Un dispositivo millifluidico in coltura continua per lo studio di Escherichia coli in condizioni nutritive basse e fluttuanti

La mia ricerca si concentra sull'esame di come i batteri si adattino fisiologicamente a condizioni a basso e fluttuante contenuto di nutrienti tipiche degli ambienti naturali. I sistemi di coltivazione convenzionali replicano scarsamente condizioni di nutrienti dinamiche, mentre il nostro sistema consente la coltivazione in queste condizioni ambientali rilevanti. Prepara la coltura notturna il giorno prima dell'esperimento.

Prepara una pre-coltura aggiungendo sei microlitri della coltura notturna a un tubo contenente sei millilitri di mezzo definito pienamente ricco, o RDM. Dividere la miscela equamente in due tubi di coltura da 15 millilitri e etichettarli come A e B. Incubare entrambi i tubi a 37 gradi Celsius, con agitazione a 200 giri/min. Monitorare la densità ottica a 600 nanometri usando il tubo B e non procedere finché la densità ottica non raggiunge circa 0,5.

Durante l'incubazione, prepara il mezzo a basso RDM e alloca il volume totale tra le bottiglie per diversi momenti temporali. Poi sigilla ogni bottiglia con tappi dotati di tre tubi. Collega il terzo tubo in silicone più largo a un filtro di ventilazione da 0,2 micrometri per uno scambio d'aria sterile.

Collegare un'estremità di ciascun tubo peristaltico dotato di connettori maschi Luer lock ai tubi in silicone di diametro minore. Lasciare il coperchio in alluminio sul raccordo maschio libero Luer lock all'estremità opposta dei tubi peristaltici fino all'inizio dell'esperimento per prevenire la contaminazione. Inserire le bottiglie e la pompa peristaltica in un incubatore impostato a 37 gradi Celsius.

Fissare tutti i tubi peristaltici nei canali della stessa testa di pompa, garantendo portate identiche su tutti i filtri. Diluire la pre-coltura in un rapporto da uno a dieci aggiungendo 600 microlitri di coltura in un tubo contenente 5,4 millilitri di Low RDM. Utilizzando una pipetta da un millilitro, si introduce un millilitro di coltura diluita in ciascuno dei sei filtri di polivinilidene fluoruro da 0,45 micrometri, o PVDF.

Dopo aver risciacquato le valvole di ritegno unidirezionale con acqua ultra-pura autoclaviata, collegale a ciascuna estremità dei filtri. Rimuovi i coperchi in alluminio dai raccordi dei tubi. Collega ogni filtro ai raccordi del tubo peristaltico.

Imposta la portata a due millilitri al minuto sulla pompa peristaltica. Posiziona un contenitore dei rifiuti sotto i filtri per raccogliere il flusso e avvia il flusso. Dopo due ore, scollega uno dei filtri collegati alla bottiglia da un litro, svita le valvole di ritegno unidirezionale e posiziona il filtro in un tubo centrifuga da 50 millilitri con l'ingresso rivolto verso il basso.

Centrifuga a 2.000 G per due minuti. Utilizzando un tronchesino sterilizzato, applica una pressione delicata all'estremità di uscita della copertura di plastica per aprire il filtro. Rilascia il cilindro interno e scarta la sezione contenente la membrana.

Risciacquare le pareti interne del involucro del filtro con il mezzo di coltura raccolto. Misurare il volume totale raccolto utilizzando una pipetta sierologica da cinque millilitri. Prendere tre aliquote da 100 microlitri dal campione e fissarle con glutaraldeide fino a una concentrazione finale dell'1,5%. Scollega i relativi filtri nei momenti successivi e ripeti la procedura di raccolta.

Etichetta i campioni raccolti in base ai rispettivi momenti temporali. Etichetta i campioni con il colorante fluorescente per il DNA e conta le cellule usando la citometria a flusso. Nel tempo, il log 10 dei conteggi di cellule trasformate ha seguito traiettorie lineari, indicando una crescita esponenziale in tutte le condizioni.

I tassi di crescita erano di circa 0,88 all'ora per la condizione dello 0,5% RDM, 0,64 all'ora per la condizione dello 0,25% e 0,18 all'ora per la condizione dello 0,01%. Il conteggio cellulare ha raggiunto fino a un miliardo di cellule per campione, dimostrando che il dispositivo di coltura millifluidica continua, o MCCD, supporta sia una crescita esponenziale sia un'elevata resa di biomassa a concentrazioni di nutrienti da nanomolari a micromolari. Le cellule coltivate con 0,5% di RDM avevano una lunghezza media cellulare maggiore rispetto a quelle cresciute con 0,01% di RDM.

La principale sfida durante la coltivazione a basso contenuto di nutrienti è mantenere densità cellulari adeguate per prevenire intasi, accumulo di pressione e esaurimento dei nutrienti. Seguendo questa procedura, le cellule possono essere prelevate per altre analisi a valle, inclusi proteomica, metabolomica e altri approcci omici. Studi futuri potranno indagare l'adattamento microbico alle limitazioni e fluttuazioni dei nutrienti integrando questo protocollo con un'analisi omica quantitativa.