Name: Profilazione lisosomica con LysoTracker per la valutazione quantitativa della senescenza cellulare nei fibroblasti umani (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-07-17T12:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 40 s
Description: Scopri come quantificare la rimodellazione lisosomica nelle cellule senescenti utilizzando LysoTracker Deep Red e imaging live-cell su fibroblasti IMR-90. Questo metodo fornisce una lettura quantitativa indiretta del compartimento acido correlata al carico di senescenza.

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<table><tbody><tr><td>24-well tissue culture plate (flat bottom, TC-treated)</td><td>CellTreat Scientific Products</td><td>229124</td><td>Qualsiasi piastra di coltura multi-well a fondo chiaro compatibile con l'imaging a fluorescenza di cellule vive (ad esempio, piastre in polistirene TC-treated da 6, 12 o 24 well; le piastre di imaging a fondo in vetro possono essere preferite per un imaging ad alta risoluzione).</td></tr><tr><td>Beta-galattosidasi staining kit (test di senescenza)</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9860</td><td>Qualsiasi kit commerciale SA-β-galattosidasi con buffer di staining verificato a pH 6,0. Per riferimento, la soluzione di fissazione contiene il 2% di formaldeide e lo 0,2% di glutaraldeide in PBS, e la soluzione di staining contiene 1 mg/mL di X-gal in DMF, 40 mM citrato/fosfato pH 6,0, 5 mM potassio ferrocianuro, 5 mM potassio ferricianuro, 150 mM NaCl, 2 mM MgCl2.</td></tr><tr><td>BioRender (software di illustrazione scientifica)</td><td>BioRender</td><td>N/A — applicazione web</td><td>Utilizzato per creare figure schematiche (Figure 1-3). https://www.biorender.com</td></tr><tr><td>Anidride carbonica gassosa (CO2), bombola compressa</td><td>Airgas (o fornitore simile)</td><td>N/A</td><td>CO2 di grado medico utilizzato per mantenere un'atmosfera al 5% nell'incubatore per colture cellulari e nella camera di imaging sul palco.</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS), inattivato termicamente</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>10082147</td><td>Qualsiasi FBS di grado per colture cellulari, inattivato termicamente a 56 °C; utilizzato al 10% v/v nel mezzo di coltura completo.</td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza con capacità di cellule vive</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMF7000</td><td>Qualsiasi microscopio a fluorescenza a campo ampio o confocale con controllo della temperatura e del CO2 per cellule vive, set di filtri per i canali far-red (eccitazione ~647 nm / emissione ~670 nm) e DAPI/Hoechst (eccitazione ~405 nm / emissione ~460 nm), e un obiettivo 20x-40x con NA sufficiente per risolvere le caratteristiche lisosomiali. In questo studio è stato utilizzato il sistema di imaging EVOS M7000.</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 colorazione nucleare</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td>Colorante per DNA permeabile alle cellule per colorazione nucleare in cellule vive (fluorescenza blu, eccitazione ~405 nm). Non intercambiabile con DAPI, che non è permeabile alle cellule in condizioni fisiologiche.</td></tr><tr><td>Software di analisi delle immagini</td><td>Python Software Foundation</td><td>N/A</td><td>Qualsiasi ambiente di calcolo scientifico che supporti la segmentazione del nucleo, l'espansione della regione nucleo-cellulare, la soglia di intensità e le statistiche di base dell'immagine (ad esempio, Python con scikit-image, MATLAB, ImageJ/Fiji, CellProfiler). Il pipeline SenTrack (vedi File Supplementare S1) è stato sviluppato per questo studio.</td></tr><tr><td>Fibroblasti polmonari umani IMR-90 (linea cellulare)</td><td>ATCC</td><td>CCL-186</td><td>Linea cellulare di fibroblasti diploidi fetali umani normale usata per modellare la senescenza replicativa; può essere sostituita da qualsiasi linea di fibroblasti umani caratterizzata in modo simile.</td></tr><tr><td>LysoTracker Deep Red</td><td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td><td>L12492</td><td>Dye fluorescente acidotropo per la colorazione in vivo di organelli acidi; fornito come stock 1 mM in DMSO. La concentrazione di lavoro è 75nM nei media di coltura cellulare preparati. L'emissione far-red (ex 647 nm / em 668 nm) minimizza la sovrapposizione con l'autofluorescenza della lipofuscina ma non l'eliminazione.</td></tr><tr><td>Medium essenziale minimo (MEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>11-095-080</td><td>Medium di coltura basale per fibroblasti IMR-90; integrato con 10% FBS e 1% penicillina-streptomicina. Qualsiasi formulazione standard di Medium Essenziale Minimo di Eagle con sali di Earle e L-glutammina può essere sostituito.</td></tr><tr><td>Soluzione di penicillina-streptomicina (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>15140122</td><td>Supplemento antibiotico per mezzo di coltura completo; utilizzato al 1% v/v (concentrazione finale 100 U/mL penicillina, 100 μg/mL streptomicina). Qualsiasi soluzione pen-strep standard può essere sostituita.</td></tr><tr><td>Medium di imaging privo di rosso fenolo</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>A1896701</td><td>DMEM o HBSS privo di rosso fenolo utilizzato per l'imaging di cellule vive per ridurre la fluorescenza di fondo durante l'acquisizione. Il FluoroBrite DMEM è una delle opzioni comunemente usate; può essere sostituito da qualsiasi buffer di imaging privo di rosso fenolo integrato con 10% FBS.</td></tr><tr><td>Soluzione tampone fosfato (PBS), pH 7,4 (1x)</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>10010023</td><td>Buffer isotonico per il lavaggio delle cellule e la diluizione dei reagenti; può essere sostituito da qualsiasi PBS sterile 1x a pH 7,4.</td></tr><tr><td>SenTrackLite v0.5.0 (software)</td><td>Open-Source (Estrada / Melendez Lab)</td><td>v0.5.0</td><td>Applicazione Python / Tkinter open-source con file singolo per l'analisi di immagini di senescenza lisosomiale. Distribuito come File Supplementare S1. Archiviato su Zenodo, doi:10.5281/zenodo.19701255. Licenza MIT. Fonte: https://github.com/goldbader-hub/Sentrack</td></tr><tr><td>Camera ambientale sul palco</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMC2000</td><td>Camera ambientale per imaging in vivo su microscopio con controllo della temperatura (37 °C) e CO2 (5%). In questo studio è stato utilizzato l'Incubatore EVOS Onstage; può essere sostituito da qualsiasi incubatore sul palco equivalente.</td></tr></tbody></table>

profilazione lisosomica con lysotracker per la valutazione quantitativa della senescenza cellulare nei fibroblasti umani

Lysosomal Profiling With LysoTracker For Quantitative Assessment of Cellular Senescence In Human Fibroblasts

Profilazione lisosomica con LysoTracker per la valutazione quantitativa della senescenza cellulare nei fibroblasti umani

Cellular senescence is a stable cell-cycle arrest state associated with characteristic phenotypes, including enlarged cell morphology, altered secretory ...

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Biologia

Questo video illustra un test basato sulla citometria a flusso per quantificare le cellule tumorali senescenti indotte dalla terapia con doppi marcatori di senescenza. La rilevazione e la quantificazione delle cellule senescenti comportano l'utilizzo di un substrato β-galattosidasi. Il substrato viene scisso dalla β-galattosidasi lisosomiale attiva all'interno delle cellule senescenti, producendo un prodotto fluorescente che, in combinazione con granuli di lipofuscina autofluorescenti, marcare...

Quantificazione basata sulla citometria a flusso di cellule tumorali senescenti indotte da terapia

Sia senescenza impedisce o promuove la tumorigenesi rimane controverso. Poiché i farmaci chemioterapici possono indurre le cellule tumorali a senesce, studiando la senescenza è essenziale per proporre nuove terapie. Tuttavia, il dosaggio standard di β-galattosidasi e ampiamente utilizzato presenta gravi inconvenienti. Proponiamo qui un saggio di citometria di flusso basato rapido e sensibile per quantificare senescenza.

Un metodo sensibile per quantificare le cellule tumorali senescenti

senescenza cellulare, lo stato irreversibile di arresto del ciclo cellulare, può essere indotta da vari stress cellulari. Qui, descriviamo i protocolli per indurre la senescenza e metodi per valutare cellulare marcatori di senescenza.

Le tecniche per indurre e Quantificare cellulare senescenza

Andremo a discutere una serie di protocolli per l'induzione e la convalida della senescenza cellulare in cellule coltivate. Ci concentriamo sui diversi stimoli che inducono la senescenza e descrivere la quantificazione degli indicatori comuni di senescenza-collegata. Forniamo dettagli tecnici usando i fibroblasti come un modello, ma i protocolli possono essere adattati a vari modelli di cellulari.

Induzione e convalida della senescenza cellulare in cellule umane primarie

ROS intracellulari è stato indicato per svolgere un ruolo importante nell'induzione della senescenza cellulare. Qui, descriviamo un test sensibile per quantificare i livelli di ROS durante la senescenza cellulare. Forniamo anche i protocolli per la valutazione del fenotipo secretivo senescenza-collegata, che secondo come riferito contribuisce a varie disfunzioni relative all'età.

Una misura quantitativa di specie reattive dell'ossigeno e senescenza-collegata di fenotipo secretivo in fibroblasti umani normali durante la senescenza indotta da Oncogene

La senescenza cellulare è il fattore chiave nello sviluppo di patologie croniche legate all'età. L'identificazione delle terapie che colpisce le cellule senescenti è promettente per estendere l'invecchiamento sano. Qui, presentiamo un nuovo saggio da vagliare per l'identificazione delle senoterapie sulla base della misurazione dell'attività di senescenza associata a z-Galactosidase in singole cellule.

Saggio di screening basato su SA-Galactosidase per l'identificazione dei farmaci senoterapici

Questo protocollo descrive il flusso di lavoro per l'etichettatura metabolica di cellule senescenti e non in divisione con SILAC pulsato, analisi di spettrometria di massa non mirata e un calcolo semplificato delle emivite proteiche.

Misurazione dei tassi di turnover proteico in cellule coltivate senescenti e non in divisione con etichettatura metabolica e spettrometria di massa

Qui presentiamo un metodo basato sulla citometria a flusso per la visualizzazione e la quantificazione di più marcatori associati alla senescenza in singole cellule.

Imaging simultaneo e rilevamento basato sulla citometria a flusso di marcatori di senescenza fluorescenti multipli in cellule tumorali senescenti indotte dalla terapia

Viene presentato un protocollo per la quantificazione fluorescente citometrica a flusso di cellule tumorali senescenti indotte da farmaci chemioterapici in colture cellulari o in modelli tumorali murini. Le procedure opzionali includono la co-immunocolorazione, la fissazione del campione per facilitare l'analisi di grandi lotti o punti temporali e l'arricchimento di cellule senescenti vitali mediante selezione citometrica a flusso.

Sonda β-galattosidasi associata alla senescenza fluorescente Far-Red per l'identificazione e l'arricchimento delle cellule tumorali senescenti mediante citometria a flusso

L'immunofluorescenza multiplexata consente l'etichettatura sequenziale di più marcatori anticorpali all'interno di una singola sezione tissutale per supportare l'analisi spaziale dell'architettura tissutale e delle popolazioni cellulari. Qui viene presentato un flusso di lavoro per la rilevazione multiplex di marcatori strutturali, associati alla senescenza e immunologici, inclusa la preparazione manuale e automatizzata delle vetrine, l'imaging iterativo e l'analisi di singole cellule...

Saggio multiplexato di immunofluorescenza per la valutazione spaziale dei marcatori di senescenza in vivo

Questo protocollo presenta una microscopia confocale a luce riflessa per la rilevazione oggettiva e monocellulare dell'attività beta-galactosidasi associata alla senescenza (SA-β-gal) nella frazione stromale vascolare isolata dal tessuto adiposo umano. Il metodo è compatibile con l'immunocitochimica, incorpora controlli del pH per la valutazione quantitativa e offre inoltre un'alternativa più sensibile e meno soggettiva rispetto alla colorazione convenzionale SA-β-gal.

Rilevamento della senescenza utilizzando luce riflessa nella frazione vascolare stromale adiposa

Scopri come quantificare la rimodellazione lisosomica nelle cellule senescenti utilizzando LysoTracker Deep Red e imaging live-cell su fibroblasti IMR-90. Questo metodo fornisce una lettura quantitativa indiretta del compartimento acido correlata al carico di senescenza.

Profilazione lisosomica con LysoTracker per la valutazione quantitativa della senescenza cellulare nei fibroblasti umani

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