Profilazione lisosomica con LysoTracker per la valutazione quantitativa della senescenza cellulare nei fibroblasti umani

Studiamo la senescenza cellulare e la sua caratterizzazione, concentrandoci su come caratteristiche come i cambiamenti lisosomici possano fungere da marcatori di senescenza. I marcatori di senescenza convenzionali sono spesso basati sull'endpoint e binari, mentre l'imaging a cellule vive può leggere la senescenza come un segnale quantitativo continuo attraverso le condizioni. Per cominciare, seminare i fibroblasti IMR-90 in una piastra a 24 pozzi e incubarli a 37 gradi Celsius in un incubatore al 5% di anidride carbonica finché non formano uno strato monoconfluente sottoconfluente.

Annota la densità di semina e il tempo tra la placcatura e la colorazione lisosomica per ogni esperimento. Riscalda l'intero mezzo di coltura a 37 gradi Celsius. Prepara una soluzione di lavoro LysoTracker Deep Red da 75 nanomolari nel mezzo e proteggila dalla luce.

Mescola la soluzione di lavoro con una delicata inversione. Seleziona coorti di fibroblasti IMR-90 presenescenti e senescenti abbinati preparati utilizzando un metodo definito di induzione da senescenza. Confermare il fenotipo senescente monitorando le caratteristiche di crescita e la morfologia.

Aspira il mezzo esaurito da ogni pozzo. Aggiungi delicatamente la soluzione funzionante LysoTracker lungo la parete di ogni pozzo, evitando disturbi al monostrato. Incubare le cellule con LysoTracker per 30 minuti a 37 gradi Celsius in un incubatore al 5% di anidride carbonica.

Durante gli ultimi 10 minuti di incubazione con LysoTracker, aggiungi direttamente Hoechst 33342 ai pozzi alla concentrazione di lavoro consigliata dal produttore e mescola dondolando delicatamente la piastra con un po' di dondolo. Rimuovere il mezzo di colorazione alla fine dell'incubazione e risciacquare le cellule una volta con PBS preriscaldato per ridurre la fluorescenza di fondo. Subito dopo il risciacquo, aggiungi un medium di coltura rosso senza fenoli preriscaldato.

Procedere direttamente all'imaging delle cellule vive, mantenendo coerente il tempo tra lo scambio del buffer e l'acquisizione dati su tutti i pozzi. Etichettare i pozzi paralleli nella piastra di coltura per la colorazione con beta-galattosidasi, al fine di confrontare le cellule altamente senescenti con i controlli presenescenti. Imaging completo delle cellule vive per i pozzi di validazione prima della fissazione.

Registra le coordinate di stadio durante l'imaging live per spostare gli stessi campi dopo la fissazione. Aggiungere la soluzione di fissazione del kit di tinzione senescenza beta-galattosidasi contenente 2% formaldeide e 0,2% glutaraldeide alle cellule. Copri il piatto con il coperchio e incuba per 10-15 minuti a temperatura ambiente.

Rimuovi il fissativo e risciacqua i pozzi due volte con PBS. Poi aggiungi la soluzione di colorazione beta-galactosidasi contenente il substrato X-gal a pH 6 in ogni pozzo. Sigilla la piastra con parafilm per limitare l'evaporazione durante l'incubazione e posiziona la piastra in un incubatore asciutto a 37 gradi Celsius senza anidride carbonica per 12-16 ore.

Dopo la fissazione e la colorazione, posizionare la lastra sul palco del microscopio e spostare gli stessi campi di imaging utilizzando le coordinate dello stadio registrate. Ispeziona i pozzi al microscopio a campo chiaro e documenta il modello di colorazione. Acquisire immagini rappresentative per ogni condizione e determinare la frazione di cellule beta-galactosidasi associate alla senescenza per pozzo.

Le cellule senescenti hanno mostrato regioni luminose e spazialmente espanse di lisomi paranucleari arricchite di lisomi, mentre i controlli presenescenti hanno mostrato un segnale complessivo inferiore con strutture puntate discrete. Le condizioni senescenti hanno mostrato una frazione maggiore di cellule beta-gal positive rispetto ai controlli presenescenti. È stata osservata una forte correlazione tra l'intensità di LysoTracker e l'area beta-gal positiva associata alla senescenza nei pozzi replicati.

L'intensità media di LysoTracker all'interno della maschera positiva era più alta nelle colture senescenti rispetto alle colture presenescenti, rendendolo il discriminatore a livello di campo più robusto tra le due condizioni. L'intensità integrata di LysoTracker per nucleo era inoltre più elevata nelle colture senescenti nel campo rappresentativo mostrato. Questo protocollo consente ai ricercatori di misurare il rimodellamento lisosomico nelle cellule viventi, fornendo una lettura quantificabile da singola cellula del carico e della progressione della senescenza.

È importante mantenere le impostazioni di colorazione e imaging identiche su tutti i pozzi, poiché i confronti di intensità sono validi solo in una sessione. Studi futuri potranno estendere questa procedura a modelli tridimensionali, tipi cellulari aggiuntivi e convalidazione tra diversi sistemi e flussi di lavoro microscopici.