Identificazione dei potenziali candidati anti-TB: una guida passo dopo passo alla sintesi, alla determinazione della CIM e alla valutazione della citotossicità nelle cellule di mammiferi

Il focus della nostra ricerca è lo sviluppo e la validazione di nuovi candidati farmaci antitubercolosi volti a promuovere strategie terapeutiche. La pipeline di screening fenotipico preventivo può essere utilizzata nella ricerca di nuovi farmaci contro ceppi di mycobacterium tuberculosis. Per cominciare, raccogli i reagenti necessari e procedi con la preparazione della miscela di reazione utilizzando le proporzioni presentate.

Mescolare la miscela di reazione a 85 gradi Celsius per 16 ore. Usa un evaporatore rotativo per rimuovere il solvente. Aggiungere circa 20 millilitri di soluzione di bicarbonato di sodio saturo al residuo.

Filtrare questa sospensione utilizzando una carta filtrante di cellulosa qualitativa da 11 micrometri per raccogliere i solidi residui. Dissolvere i solidi residui in 50 millilitri di cloroformio. Usa un imbuto separatore per risciacquare la soluzione di cloroformio con 15 millilitri d'acqua tre volte.

Rimuovendo lo strato d'acqua ogni volta. Aggiungi solfato di sodio anidro alla fase organica per rimuovere l'acqua residua e asciugarla. Dopo aver evaporato il solvente, lavare il solido verde risultante quattro volte con 10 millilitri di esano caldo a circa 50 gradi Celsius.

A un milligrammo di Compound 6, aggiungi un millilitro di una miscela uno a uno di acetonitrile e metanolo per preparare una soluzione di stock. Diluire la soluzione originale a 0,5 milligrammi per millilitro e filtrarla prima dell'analisi. Carica il campione nel sistema HPLC.

Utilizzare software di acquisizione dati per cromatografia per acquisire e elaborare i dati. Imposta il metodo cromatografico per utilizzare una colonna C18 di fase inversa di 250 per 4,6 millimetri di dimensione di particelle di cinque micrometri. Imposta la portata a 1,5 millilitri al minuto e imposta la rilevazione UV a 254 nanometri.

Imposta un gradiente come presentato con le variazioni programmate della composizione di fase mobile. Trasferire circa 15-20 milligrammi di Composto 6 in un tubo a risonanza magnetica nucleare o NMR. Scioglilo in un volume appropriato di DMSOD6.

Una volta impostati i parametri di acquisizione come presentati, si acquisisce lo spettro NMR protonico utilizzando una sequenza di impulsi standard. Regolare i parametri di acquisizione. Avviare lo spettro NMR di protoni e carbonio 13 e segnalare i cambiamenti chimici in parti per milione.

Visualizza ed elabora i dati NMR con il file libero di decadimento a induzione ottenuto dall'esperimento. Per la purificazione basata sulla cromatografia del Composto 6, riempire una colonna con gel di silice. Carica il Compound 6 grezza sulla colonna.

Eludi il composto e raccogli le frazioni. Monitorare le frazioni utilizzando cromatografia a strato sottile e combinare le frazioni contenenti il prodotto puro. Aggiungi 100 microlitri di brodo 7H9 integrato con destrosio al 10% di albumina, catalasi o ADC, alla colonna 12 della piastra da 96 pozzi.

Poi trasferisci 100 microlitri di brodo 7H9 contenente 10% ADC e 5% DMSO nella colonna 11. E poi sequenzialmente dalla colonna nove alla una. Aggiungi 200 microlitri della soluzione composta alla colonna 10, assegnando una riga per composto.

Pipetta 100 microlitri della soluzione composta al doppio della concentrazione di prova più alta nella colonna 12 della piastra a 96 pozzi. Trasferire 100 microlitri dalla colonna 10 alla colonna nove e mescolare bene pipettando per iniziare una diluizione dei cereali doppia. Continuare la diluizione seriale in modo sequenziale fino alla colonna uno.

Aggiungi 100 microlitri della sospensione batterica di Mycobacterium tuberculosis in sequenza dalla colonna 11 alla colonna uno e copri la placca. Sigilla la piastra con parafilm e incuba a 37 gradi Celsius per sette giorni. Successivamente, aggiungi 60 microlitri di soluzione allo 0,01% di resazirina in ciascun pozzetto della piastra e coprilo.

Sigilla la piastra con parafilm e incubala a 37 gradi Celsius per 48 ore. Poi controlla il cambio di colore dal blu al rosa. Prepara una soluzione operativa di 0,5 milligrammi per millilitro MTT in DMEM senza siero.

Ottieni cellule Vero e HEPG2 trattate con il Composto 6 per 48 ore e ispezionale per valutare gli effetti del trattamento. Aspirare il mezzo dalle piastre e aggiungere 50 microlitri della soluzione di lavoro MTT in ciascun pozzo in condizioni di luce ambientale bassa. Dopo un'incubazione di tre ore, si aggiungono 100 microlitri di DMSO in ciascun pozzo per dissolvere i cristalli di Formazan in condizioni di luce ambientale bassa.

Posiziona la piastra su uno shaker orbitale a 100 giri/min per 15 minuti mantenendola protetta dalla luce. Ispezionare i pozzi di controllo per confermare la completa dissoluzione cristallina. Metti la piastra in un microlettore di placche.

Imposta la lunghezza d'onda di riferimento da 630 a 690 nanometri e verifica l'assorbanza a 570 nanometri. Prepara una soluzione di lavoro rossa neutra da 40 microgrammi per millilitro in DMEM senza siero. Poi preparare la soluzione di disorbizione rosso neutra contenente 1% di acido acetico glaciale, 49% etanolo e 50% di acqua ultrapura in volume.

Una volta valutato l'effetto del Composto 6 sulle celle Vero e HEPG2, rimuovere il materiale e aggiungere 100 microlitri della soluzione di lavoro neutra e rossa filtrata in ciascun pozzo. Incubare la piastra per due ore a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5%. Dopo aver rimosso la soluzione rossa neutra di lavoro, risciacqua ogni pozzo una volta con 150 microlitri di PBS sterile.

Aggiungi 150 microlitri della soluzione di desorbo rosso neutro in ciascun pozzo. Posiziona la piastra su uno shaker orbitale a 150 giri al minuto per 15 minuti per estrarre il colorante. Controlla i pozzi di controllo per confermare l'estrazione completa del colorante.

Leggi l'assorbanza a 540 nanometri con un lettore di microplacche. Il cromatogramma HPLC ha mostrato che il Composto 6 ha avuto un tempo di ritenzione di 14,11 minuti e una purezza del 99%. Lo spettro NMR protonico ha mostrato segnali caratteristici per la parte della piperidina tra 1,50 e 3,13 parti per milione. Un singolo metilico a 2,38 parti per milione.

E segnali aromatici che includono doppietti a 6,97 e 7,17 parti per milione e un multipletto a 7,63-7,75 parti per milione. Lo spettro NMR del carbonio 13 mostrava un segnale di metilcarbonio a 23,81 parti per milione, e segnali correlati alla piperidina tra 24,85 e 49,70 parti per milione. La piastra MTT mostrava un chiaro gradiente di colore tra le concentrazioni di composti, indicando che la citotossicità era più alta in concentrazioni elevate di composti con pozzi traslucidi e più bassa in concentrazioni di composto basse in pozzi viola profondo.

La piastra di assorbimento rosso neutro mostrava un chiaro gradiente di colore tra le concentrazioni di composti, indicando che la citotossicità era più alta a concentrazioni elevate di composti nei pozzi traslucidi e più bassa a basse concentrazioni di composti nei pozzi rosa intenso. Questo protocollo rappresenta un canale per lo sviluppo di candidati farmaci contro la tubercolosi basato sullo screening fenotipico. È importante considerare e valutare la bassa solubilità dei composti sintetizzati durante l'applicazione del protocollo.

Questa ricerca può servire da base per future studi sulla biodisponibilità, infezione da macrofagi e in vivo.