Name: Un metodo per adattare Euglena gracilis a substrati a base di manioca per la coltivazione eterotrofa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-06-12T14:40:00.000+00:00
Duration: 12 min 37 s
Description: Scopri come adattare Euglena gracilis a substrati a base di manioca per la coltivazione eterotrofa. Questo metodo consente la valorizzazione dei sottoprodotti agricoli e la produzione di biomassa ricca di proteine.

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<table><tbody><tr><td>Autoclave - 533LS Steam Sterilizzatore</td><td>Getinge</td><td>533LS</td><td>Sterilizzazione a vapore dei media di manioca. Sterilizzare i media utilizzando il ciclo liquido.</td></tr><tr><td>Bright-Line&trade; Emacitometri sostituzione vetrino di copertura</td><td>Millipore Sigma</td><td>BR723015- 100EA</td><td>Vetrini di spessore speciali progettati per l'uso con l'ematocrito.</td></tr><tr><td>Polpa essiccata di manioca</td><td>Psaltry International</td><td>N/A</td><td>Sottostrato di manioca fornito</td></tr><tr><td>Pellet di manioca</td><td>Psaltry International</td><td>N/A</td><td>Sottostrato di manioca fornito</td></tr><tr><td>Pellicine di manioca</td><td>Psaltry International</td><td>N/A</td><td>Sottostrato di manioca fornito</td></tr><tr><td>Sottostrato di manioca (garri)</td><td>Fornitore locale</td><td>N/A</td><td>Garri derivato dalla manioca utilizzato come fonte di carbonio preparato con acqua deionizzata.</td></tr><tr><td>Centrifughe Thermo Scientific Sorvall ST16 Centrifuga</td><td>Thermo Scientific Sorvall ST16 Centrifuga</td><td>75004241</td><td>Capace di &ge;3.500 &times; g, utilizzata per il raccolto della biomassa.</td></tr><tr><td>Tubetti per centrifuga Ad es. Axygen (A Marchio Corning)</td><td>Corning</td><td>MCT-150-C-S</td><td>Sterili, volume minimo di 1,5 mL</td></tr><tr><td>Acqua pulita Ad es. UltraPure&trade; Acqua distillata senza DNase/RNase Libera</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10977035</td><td>Deionizze o distillata. Utilizzata per la preparazione dei media</td></tr><tr><td>Microscopio a luce composta</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td>Microscopio composto standard adatto per l'osservazione e il conteggio delle cellule di routine.</td></tr><tr><td>Striscia di test del cianuro Strisce, colorimetriche. CN- 10-30 mg/L</td><td>MQuant</td><td>110044</td><td>Rilevamento semi-quantitativo del cianuro. Elimina come rifiuto pericoloso</td></tr><tr><td>Piattellino di pesatura standard sterile</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-549-750</td><td>Utilizzato per pesare i substrati di manioca e la biomassa secca.</td></tr><tr><td>Euglena gracilis (linea adattata )</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Stamma adattata alla manioca generata in questo studio</td></tr><tr><td>Euglena gracilis (Tipo selvatico)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Stamma di riferimento non adattata. Mantenere le stesse condizioni standard.</td></tr><tr><td>Componenti del mezzo di crescita Euglena</td><td>Vari</td><td>N/A</td><td>Mezzo Euglena basale preparato secondo le formulazioni standard del laboratorio.</td></tr><tr><td>Consolle 6 litri FreeZone Freeze Essiccatore</td><td>Labconco</td><td>70061xxxx</td><td>Utilizzato per la disidratazione della biomassa</td></tr><tr><td>Emacitometri con linee standard</td><td>Weber Scientific</td><td>NC1587539</td><td>Utilizzato per il conteggio manuale delle cellule.</td></tr><tr><td>Agitatore magnetico con piastra riscaldante</td><td>IKA</td><td>N/A</td><td>Opzionale; migliora la consistenza durante la preparazione del mezzo e la sospensione del substrato.</td></tr><tr><td>Micropipette (P20, P200, P1000)</td><td>Eppendorf</td><td>N/A</td><td>Pipette con volume regolabile utilizzate per i trasferimenti liquidi asettici.</td></tr><tr><td>Mini centrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>N/A</td><td>Opzionale; facilita il rapido sedimento durante la raccolta della biomassa.</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td>Utilizzato per la sigillatura temporanea di flaconi o piastre quando non sono disponibili tappi ventilati.</td></tr><tr><td>Strisce indicatore pH</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-640-520</td><td>Alternativa al pHmetro per una rapida valutazione qualitativa dei mezzi di coltura.</td></tr><tr><td>pHmetro con sonda Thermo Scientific Orion Star A211 pHmetro da banco</td><td>Thermo Scientific Orion Star A211 pHmetro da banco</td><td>13-645-519</td><td>Calibrato prima dell'uso. Per misurare il pH del surnatante della coltura</td></tr><tr><td>Conservazione refrigerata (4&deg;C)</td><td>Frigidaire</td><td>FRT18S6JW7</td><td>Conservazione a breve termine dei mezzi</td></tr><tr><td>Incubatore oscillante (scuro)</td><td>Thermolyne</td><td>M49235</td><td>Incubatore oscillante orbitale capace di 100-150 RPM, intervallo di temperatura 24-28 &deg;C; utilizzato in condizioni di oscurità per supportare la crescita eterotrofica di Euglena.</td></tr><tr><td>Flacone spray (32oz)</td><td>Boardwalk</td><td>BWK03010</td><td>Utilizzato per la sterilizzazione del piano di lavoro e la manipolazione asettica di routine (soluzione di etanolo al 70%)</td></tr><tr><td>Software per fogli di calcolo</td><td>Microsoft Excel</td><td>N/A</td><td>Raccolta, organizzazione e analisi dei dati</td></tr><tr><td>Suggerimenti per pipette sterili</td><td>Eppendorf</td><td>N/A</td><td>Suggerimenti sterili e monouso compatibili con le pipette P20, P200 e P1000.</td></tr><tr><td>Pipette serologiche sterili (5, 10, 25 mL)</td><td>Corning</td><td>N/A</td><td>Pipette sterili avvolte singolarmente utilizzate per i trasferimenti e il campionamento dei coltivi.</td></tr><tr><td>Soluzione di blu di tripano 0,4%, liquida, sterile-filtrata, adatta per la coltura cellulare</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td>Dye vitale utilizzato per la valutazione della vitalità cellulare mediante il test di esclusione del blu di tripano.</td></tr><tr><td>Tubetti per il prelievo di campioni (50 mL)</td><td>Falcon</td><td>14-432-22</td><td>Per campionamento pH e cianuro</td></tr><tr><td>Flaconi Erlenmeyer con tappo di ventilazione (250-500 mL)</td><td>Flacone Erlenmeyer in policarbonato da 250 mL Corning® con tappo di ventilazione</td><td>431144</td><td>Flaconi Erlenmeyer in policarbonato con tappi ventilati; autoclavabili; utilizzati sia per colture liquide sterili che non sterili.</td></tr><tr><td>Contenitori per rifiuti</td><td>Vari - in conformità con gli standard di laboratorio stabiliti</td><td>N/A</td><td>Sacche per autoclave e contenitori per rifiuti acuti o in vetro per lo smaltimento conforme alla biosicurezza.</td></tr></tbody></table>

un metodo per adattare euglena gracilis a substrati a base di manioca per la coltivazione eterotrofa

A Method for Adapting Euglena gracilis to Cassava-Based Substrates for Heterotrophic Cultivation

I seguenti risultati rappresentativi illustrano gli esiti attesi quando il protocollo descritto viene applicato con successo, così come la gamma di risultati osservati in condizioni subottimali. I dati rappresentativi corrispondenti a questi esiti sono mostrati nella Figura 1, Figura 2, Figura 3, Figura 4, Figura 5, Figura 6, Figura 7. Insieme, questi risultati forniscono indicazioni pratiche per interpretare la dinamica della crescita, la vitalità, la morfologia e gli esiti proteici nell'adattamento di E. gracilis a substrati a base di manioca in condizioni di coltivazione eterotrofe e completamente buie. Inoltre, questi risultati convalidano i principali esiti biologici del protocollo, tra cui adattamento di successo, crescita sostenuta, alta vitalità, morfologia stabile, prestazioni costanti tra i substrati e produzione di proteine misurabile.
Durante gli esperimenti, sono state utilizzate tre repliche per trattamento (tutti i tipi di substrati di manioca). Riconosciamo che il numero di repliche dipende dalla discrezione e dai limiti logistici di qualsiasi gruppo che segua i protocolli sopra indicati. L'applicazione con successo di questo protocollo porta a una crescita eterotrofa sostenuta di E. gracilis in mezzi a base di garri in condizioni completamente buie. Gli esiti positivi sono caratterizzati da traiettorie di crescita sigmoide, differenze limitate tra repliche e densità cellulari stabili nella fase tardiva. I tratti morfologici che indicavano risultati positivi e che sono stati osservati in modo costante nelle popolazioni adattate includevano la rotondità cellulare e le membrane cellulari spesse. Al contrario, le cellule collassate malsane appaiono tipicamente irregolari, frammentate o strutturalmente compromesse e sono associate a una vitalità ridotta, distinguendole dalle forme intatte, arrotondate o semi-incisate osservate in colture adattate. Per riferimento, sono incluse immagini rappresentative di E. gracilis di tipo selvatico che mostra una morfologia allungata caratteristica (Figura 8) per distinguere la struttura cellulare di base dalle forme adattate o alterate. Le colture coltivate a 30 g di L-1 garri hanno mostrato una crescita integrata più elevata, misurata per area sotto la curva di crescita (AUC), rispetto a concentrazioni più basse, suggerendo un utilizzo più efficiente del substrato della manioca e un adattamento fisiologico di successo (Figura 1).
Esiti subottimali sono comunemente osservati a concentrazioni di garri più basse (10–20 g L-1), dove la crescita è rilevabile ma ridotta in intensità e più variabile tra le repliche. A concentrazioni più elevate (40–50 g L-1), le colture possono raggiungere densità cellulari di picco elevate; tuttavia, queste condizioni mostrano frequentemente stabilizzazione ritardata o aumento della variabilità temporale (Figura 2).
Negli esperimenti riusciti, la vitalità cellulare rimane elevata per tutto il periodo di coltura, con solo lievi fluttuazioni a metà esperimento. I test di esclusione Trypan Blue indicano che le colture mantenute a 30 g di L-1 garri mantengono un'alta proporzione di cellule vitali (non colorate) rispetto a quelle non vitali (colorate di blu) nei momenti temporali campionati (Figura 3). Le deviazioni da questo schema, tra cui una maggiore proporzione di cellule colorate, una motilità ridotta o spostamenti verso morfologie arrotondate o collassate, possono indicare condizioni subottimali e fungere da precoci innescatori per la risoluzione dei problemi. Le valutazioni di vitalità e morfologia si sono basate su criteri osservativi coerenti, tra cui l'integrità cellulare, la motilità direzionale e la prevalenza relativa delle forme allungate rispetto a quelle arrotondate o collassate.
Gli esiti subottimali sono caratterizzati da riduzioni transitorie della vitalità, più comunemente osservate a concentrazioni garri più elevate. Un recupero parziale può essere osservato in momenti successivi; tuttavia, queste condizioni mostrano una maggiore variabilità di vitalità durante il periodo di coltura (Figura 4). Questi modelli di crescita mostrano che concentrazioni intermedie di substrato (ad esempio, 30 g L-1) forniscono un equilibrio tra disponibilità di nutrienti e stress, risultando in una crescita più stabile. Queste tendenze riflettono l'impatto delle condizioni di pre-elaborazione e dell'adattamento a stadi sulle prestazioni della coltura, poiché l'esposizione graduale alla crescente complessità del substrato supporta una maggiore stabilità fisiologica e un comportamento di crescita riproducibile. Concentrazioni più basse limitano la produzione di biomassa, mentre concentrazioni più elevate portano a una maggiore variabilità e a una stabilizzazione ritardata.
La valutazione morfologica fornisce un indicatore qualitativo dello stato di adattamento. Gli esiti positivi includono l'emergere e la persistenza di cellule arrotondate o semi-incisate con motilità ridotta che rimangono intatte attraverso ripetute sottocolture (Figura 5).
Al contrario, le colture subottimali, per lo più associate a ceppi selvatici o adattamento in fase iniziale, mostrano transizioni brusche da cellule allungate e mobili a morfologie irregolari o collassate che coincidono con una riduzione della stabilità della crescita.
Quando il protocollo viene applicato a substrati aggiuntivi derivati dalla manioca, inclusi polpa, pellet e bucce, le colture adattate di E. gracilis mostrano una crescita riproducibile su più tipi di substrato. Gli esiti positivi sono caratterizzati da una stabilizzazione anticipata delle curve di crescita e da una riduzione del declino nelle fasi finali rispetto alle colture di tipo selvatico (Figura 6).
Gli esiti subottimali includono un ritardo nell'inizio della crescita o un aumento della variabilità replicativa, in particolare nei substrati con maggiore eterogeneità fisica.
L'implementazione riuscita del protocollo produce biomassa di E. gracilis con contenuto misurabile di proteine grezze, come quantificato da analisi di laboratorio esterno utilizzando il metodo della Combustione (Dumas). Le percentuali di proteine osservate nelle colture adattate sono comparabili a quelle misurate nelle colture di tipo selvatico, con una maggiore produzione proteica totale corrispondente a un aumento dell'accumulo di biomassa (Figura 7).
Il monitoraggio della chimica dei media ha supportato le interazioni coltura-substrato durante l'adattamento e ha convalidato l'inclusione di misurazioni di pH e cianuro all'interno del protocollo. I valori del pH hanno mostrato cambiamenti graduali nel tempo, indicando attività metabolica e utilizzo del substrato, con tendenze più stabili nelle colture adattate. Le misurazioni del cianuro hanno ulteriormente confermato questa affermazione, poiché le colture adattate hanno mostrato riduzioni nei livelli rilevabili, mentre le colture di tipo selvatico sono rimaste più variabili. Insieme, questi risultati dimostrano che questi passaggi di monitoraggio catturano efficacemente i cambiamenti nella chimica dei media associati all'adattamento e supportano l'interpretazione della performance culturale. Sebbene i meccanismi sottostanti non siano stati studiati, questo rappresenta un'area importante per future ricerche, in particolare per applicazioni su scala industriale.
Il flusso di lavoro di mantenimento e consolidamento a lungo termine ha supportato la continuazione della linea adattata di Euglena gracilis per periodi di coltura prolungati. Le colture mantenute tramite passaggi ripetuti hanno costantemente mantenuto motilità, morfologia caratteristica e comportamento di crescita stabile attraverso i cicli di mantenimento. Sebbene la performance a lungo termine non sia stata evaluata quantitativamente, queste osservazioni forniscono prove rappresentative che la linea adattata può essere mantenuta in modo affidabile nelle condizioni specificate.
Insieme, questi risultati confermano che il protocollo di adattamento supporta una crescita robusta, la vitalità e la produzione di biomassa di E. gracilis su substrati a base di manioca, con prestazioni costanti e livelli ridotti di cianuro nel tempo.
Tutte le figure e le tabelle sono fornite come file separati e non sono incorporate nel documento manoscritto. Le preferenze di posizionamento di figure e tavoli sono indicate all'interno del testo del manoscritto tramite note tra parentesi (ad esempio, (Figura 1)). Salvo diversa specificazione, tutte le figure e le tabelle devono apparire sotto la sezione Risultati Rappresentativi nella pubblicazione finale.
Tutte le figure vengono inviate come file individuali, con figure multipannello fornite come un'unica immagine combinata. Le immagini microscopiche includono barre di scala in ogni pannello. Le figure di dati includono assi etichettati con unità di misura definite, e le barre di errore sono specificate nelle corrispondenti legende delle figure.
Tutte le tabelle sono inviate come singoli file .xls o .xlsx e contengono dati numerici grezzi o riassunti senza formattazione decorativa.
<img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70741/70741fig1.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1: Dinamiche di crescita di E. gracilis coltivate a 10, 20 e 30 gL-1 garri in condizioni completamente buie. Le densità medie delle cellule vengono mostrate nel tempo per ciascuna concentrazione di substrato. Le barre di errore rappresentano il SEM tra repliche biologiche. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70741/70741fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70741/70741fig2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2: Prestazioni di crescita di E. gracilis a concentrazioni elevate del garri (30–50 g L-1). Le traiettorie della densità cellulare illustrano differenze nella densità di picco, nel tempismo di stabilizzazione e nella variabilità tra concentrazioni più elevate nel substrato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70741/70741fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70741/70741fig3.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3: Tendenze di vitalità cellulare di E. gracilis coltivata a 30 gL-1 garri misurate con esclusione di Trypan Blue. La proporzione di cellule vitali è mostrata nei punti temporali campionati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70741/70741fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70741/70741fig4.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 4"> 
Figura 4: Fluttuazioni di vitalità di E. gracilis coltivate a concentrazioni garri più elevate. Cambiamenti transitori nella vitalità cellulare sono mostrati durante il periodo sperimentale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70741/70741fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figura 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70741/70741fig5.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 5"> 
Figura 5: Morfologia rappresentativa delle popolazioni adattate di E. gracilis . Immagini rappresentative della microscopia a luce invertita mostrano cellule arrotondate e semi-incisate osservate dopo l'adattamento. Barra della scala = XX μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70741/70741fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figura 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70741/70741fig6.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 6"> 
Figura 6: Prestazioni di crescita di E. gracilis adattato e di tipo selvatico su substrati derivati dalla manioca. Le traiettorie di crescita sono mostrate per colture adattate e di tipo selvatico coltivate su più prodotti di manioca. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70741/70741fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figura 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70741/70741fig7.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 7"> 
Figura 7: Contenuto di proteine grezza e output totale di proteine della biomassa di E. gracilis coltivata nella manioca. Il contenuto proteico è stato quantificato tramite analisi esterne utilizzando il metodo SGS Combustion (Dumas). La produzione totale di proteine è rappresentata insieme all'accumulo di biomassa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70741/70741fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figura 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70741/70741fig8.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 8"> 
Figura 8: Morfologia rappresentativa di E. gracilis di tipo selvatico in condizioni standard (ingrandimento 40X). Immagine rappresentativa di Euglena gracilis sana e non adattata che mostra una morfologia allungata caratteristica sotto microscopia luminosa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70741/70741fig8large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Un metodo per adattare Euglena gracilis a substrati a base di manioca per la coltivazione eterotrofa

Cassava processing generates nutrient-rich by-products that remain underutilized due to variable composition, cyanogenic compounds, and active microbial ...

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