Un metodo per adattare Euglena gracilis a substrati a base di manioca per la coltivazione eterotrofa

La nostra ricerca si concentra sull'adattamento delle nuove foglie di Euglena gracilis ai rifiuti di manioca e sullo studio della crescita, della riduzione del cianuro e della produzione di biomassa ricca di proteine. Questo protocollo può essere applicato nella lavorazione sostenibile della manioca sostenibile, nella valorizzazione dei rifiuti agricoli, nella produzione di mangimi e nei sistemi biotecnologici a basso costo. Per cominciare, etichettare le fiaschette sterili ventilate da 500 millilitri con il tipo di substrato come garri.

Segna la concentrazione del bersaglio appropriata sulla fiaschetta. Etichetta la fiaschetta con l'identificazione replicata e la condizione di sterilizzazione pianificata come autoclaviata o non autoclavata. Metti una pesante sulla bilancia analitica.

Dopo aver premuto tare, pesa il garri per farlo corrispondere al volume di lavoro finale. Aggiungi asepticamente il garri pesato in una fiaschetta sterile da 500 millilitri contenente 300 millilitri di acqua deionizzata o distillata. Riapplica il tappo ventilato su ogni fiaschetta.

Mescola ogni sospensione per tre minuti finché la miscela non si omogeneizza. Se si utilizza il movimento magnetico, posizionare la fiaschetta su una piastra di mescolare e impostare la velocità a 200G per formare un vortice poco profondo senza schizzi. Lascia idratare la sospensione senza disturbo per 10 minuti a 25 gradi Celsius.

Stringi il tappo di ventilazione immediatamente prima della fermentazione e fai roteare la fiaschetta a mano cinque volte per omogeneizzare delicatamente la miscela e risospendere il materiale sedimentato. Per preparare ulteriori mezzi a base di manioca, etichettare le fiasche e pesare il substrato come dimostrato in precedenza per raggiungere 30 grammi per litro in base al volume di lavoro. Aggiungi asepticamente il substrato pesato in una fiaschetta sterile contenente 300 millilitri di acqua deionizzata o distillata.

Riapplica il tappo ventilato su ogni fiaschetta. Idrata e mescola la sospensione come dimostrato in precedenza. Conferma che le fiaschette siano dotate di un tappo sterile permeabile al gas per consentire lo scambio di gas minimizzando la contaminazione ambientale.

Posizionare le fiaschette in posizione verticale a 25 gradi Celsius in un'area designata, lontana dalla luce solare diretta e dal traffico d'aria intenso, e incubare le fiaschette senza agitazione per un minimo di 72 ore. Annota la data e l'orario di inizio della fermentazione per ogni fiaschetta e condizione. Conferma che ogni fiaschetta da 500 millilitri contenga non più di 300 millilitri di liquido dopo la fermentazione per evitare il ribollimento durante la sterilizzazione.

Una volta che il tappo ventilato è allacciato in posizione stretta con un dito, applica il nastro indicatore autoclave sulla fiaschetta. Dopo aver caricato le fiaschette in un vassoio sicuro per autoclave, posiziona il vassoio nell'autoclave e seleziona il ciclo liquido P13. Imposta i parametri di sterilizzazione a 121 gradi Celsius per 30 minuti per la sterilizzazione liquida.

Avvia il ciclo dell'autoclave. Dopo il ciclo, lascia che la pressione della camera dell'autoclave torni alla pressione atmosferica e apri lentamente la porta dell'autoclave. Usando guanti resistenti al calore, rimuovi le fiaschette e lasciale raffreddare a temperatura ambiente.

Conserva le fiaschette raffreddate durante la notte a temperatura ambiente prima dell'inoculazione. Usa direttamente il mezzo fermentato della manioca senza autoclavare per preservare le comunità microbiche autoctone. Inocula il materiale non autoclavato immediatamente dopo il periodo di fermentazione di 72 ore per minimizzare la contaminazione ambientale involontaria.

Mantieni una manipolazione costante tra le repliche utilizzando lo stesso tipo di fiaschette ventilate da 500 millilitri, lo stesso volume di lavoro e la stessa durata di fermentazione per tutte le condizioni del substrato. Inoculare Euglena gracilis in un nuovo mezzo nutritivo eterotrofo. Incubare le colture al buio completo a 28 gradi Celsius con oscillazioni orbitali continue a 120G fino a raggiungere la crescita logaritmica media.

Utilizzando un microscopio luminoso composto in modalità campo chiaro, esamina le colture con ingrandimento totale da 100x a 400x e conferma la motilità attiva, la morfologia cellulare allungata e i bassi livelli di insistenza. Escludere colture che mostrano eccessive detriti cellulari, morfologia anomala o un'insistenza elevata prima degli esperimenti di adattamento. Dopo aver omogeneizzato delicatamente le colture starter stringendo il tappo di ventilazione, si fanno roteare le fiaschette a mano per 15 secondi per garantire una distribuzione uniforme delle cellule senza indurre sforzi di taglio intenso.

Utilizzando un emocitometro di Neubauer, determina la densità cellulare. Una volta mescolata la coltura, facendo roteare la fiaschetta per 15 secondi, pipettare un millilitro di coltura in un tubo sterile da 1,5 millilitri per microcentrifuga. Pulisci l'emocitometro e il copertura con etanolo al 70% e lascia asciugare all'aria l'emocitometro e il copertura.

Pipetta 10 microlitri di coltura sulle due griglie dell'emocitometro e posiziona il coperchio sul campione bagnato. Utilizzando la microscopia a campo chiaro con un obiettivo 10x, si concentra sulla griglia e si contano le celle all'interno di un insieme definito di quadrati sulla griglia grande applicando le regole standard di confine. Ripeti il conteggio delle cellule nella seconda camera e calcola la media delle celle per millilitro e la densità cellulare.

Regolare i volumi di inoculazione per ottenere un inoculo finale del 5% volume per volume su tutti i mezzi sperimentali. Prepara inocula separata per ogni condizione di trattamento per mantenere densità cellulari iniziali costanti tra i gruppi sperimentali. Aggiungere l'inoculo preparato di E. gracilis a substrati di manioca autoclavi e non autoclavi preparati a concentrazioni finali di garri di 10, 20 e 30 grammi per litro.

Utilizzare volumi di inoculazione uguali in tutte le condizioni di trattamento per standardizzare la densità cellulare iniziale. Dopo aver stretto il tappo ventilato, fai ruotare delicatamente la fiaschetta in un movimento circolare per 15 secondi per distribuire le celle. Incubare le colture al buio totale a 25 gradi Celsius per avviare la crescita eterotrofa.

Minimizzare l'agitazione del mezzo non autoclavato per preservare la struttura della comunità microbica nativa e la stratificazione del substrato. Mescola tutte le colture una volta al giorno usando un leggero vortice manuale per 15 secondi per mantenere il contatto tra le cellule di E. gracilis e il materiale di manioca sospeso. Utilizzando una punta sterile di pipetta, ogni 48 ore, raccogli asetticamente campioni di un millilitro da ciascuna coltura.

Stringi il tappo ventilato e fai girare delicatamente la fiaschetta di coltura per 15 secondi prima del campionamento per garantire una distribuzione uniforme delle cellule e del materiale sospeso. Dopo aver trasferito un'aliquota di coltura in un tubo microcentrifuga sterile da 1,5 millilitri, diluire il campione con acqua deionizzata secondo necessità per migliorare la visualizzazione delle singole cellule. Prepara un vetrino microscopico a montaggio umido pipettando 10 microlitri del campione diluito su un vetrino pulito e coprendo il campione con un coperturatore.

Utilizzando un microscopio a luce composta in modalità campo chiaro, esaminare i campioni con un ingrandimento totale da 100x a 400x e valutare la motilità cellulare, la morfologia e la frequenza di insistenza come indicatori dello stato di adattamento. Ogni sette giorni, trasferire asepticamente il 20% volume per volume di ogni coltura in substrati di manioca appena preparati con le stesse condizioni di concentrazione garri e sterilizzazione. Mantenere volumi di trasferimento costanti tra i passaggi e ripetere il passaggio seriale finché le colture non mostreranno crescita costante, motilità sostenuta e bassa frequenza di insistenza in mezzo manioca da 30 grammi per litro.

Dopo l'adattamento ad alta concentrazione della manioca e l'analisi comparativa della crescita, si utilizzano strisce colorimetriche per valutare i livelli di cianuro e osservare il colore sviluppato. Dopo la centrifugazione, si preleva biomassa per l'analisi a valle. In condizioni di coltivazione completamente buie, le colture coltivate a 30 grammi per litro di garri hanno mostrato una crescita integrata più elevata rispetto a concentrazioni più basse.

Concentrazioni di garri più basse, di 10-20 grammi per litro, hanno mostrato una crescita rilevabile ma ridotta e più variabile. Concentrazioni più elevate di 40-50 grammi per litro hanno raggiunto densità cellulari di picco elevate, ma hanno mostrato stabilizzazione ritardata e maggiore variabilità. I saggi di esclusione del blu di tripano hanno indicato che le colture mantenute a 30 grammi per litro di garri hanno mantenuto un'elevata vitalità nei momenti di tempo campionati.

Concentrazioni più elevate di garri hanno mostrato riduzioni transitorie della vitalità seguite da un recupero parziale con maggiore variabilità nel tempo. Gli esiti positivi includevano cellule arrotondate o semi-insistenti con motilità ridotta che sono rimaste intatte attraverso ripetute sottocolture. Le colture adattate di E. gracilis hanno mostrato una crescita riproducibile su molteplici tipi di substrato e una stabilizzazione più precoce con un declino ridotto nelle fasi avanzate rispetto alle colture di tipo selvatico.

L'implementazione con successo del protocollo ha prodotto biomassa di E. gracilis con contenuto misurabile di proteine grezze, quantificato da analisi di laboratorio esterno utilizzando il metodo di Dumas a combustione. Le percentuali di proteine osservate nelle colture adattate erano comparabili a quelle misurate nelle colture di tipo selvatico con una maggiore produzione proteica totale corrispondente a un aumento dell'accumulo di biomassa. Questo protocollo consente ai ricercatori di studiare la crescita di Euglena, la riduzione del cianuro, la produzione di biomassa e il potenziale nutrizionale in diversi ambienti a base di manioca.

La sfida critica in questo protocollo è mantenere una temperatura stabile, condizioni di coltura costanti e una comunità microbica equilibrata per la crescita di Euglena. Studi futuri possono ottimizzare e ampliare questo protocollo, migliorare la resa proteica e testare diverse applicazioni industriali utilizzando diversi flussi di rifiuti di manioca su larga scala.