Espressione mirato di GFP nel follicolo pilifero Utilizzando Ex trasduzione virale Vivo
17 marzo 2008
Il follicolo pilifero è un'appendice molto complesso della pelle che contiene una molteplicità di tipi di cellule. Il follicolo subisce ciclismo costante attraverso la vita dell'organismo tra cui la crescita e il riassorbimento della crescita dipende da cellule staminali specifiche. L'obiettivo del follicolo da geni e cellule staminali di cambiare le sue proprietà, in particolare, la natura del fusto del capello è discusso. Sistemi di erogazione dei follicoli dei capelli sono descritti, come liposomi e vettori virali per la terapia genica. La natura delle cellule staminali dei follicoli dei capelli è discusso, in particolare la sua pluripotenza.
Il follicolo pilifero è un'appendice cutanea complessa costituita da sei cilindri concentrici con diversi tipi cellulari distinti che producono proteine altamente specializzate. Il ciclo continuo del follicolo pilifero attraverso le sue distinte fasi di crescita rende l'appendice adatto alla terapia genica mirata, che potrebbe correggere la calvizie e la perdita della pigmentazione dei capelli. In questo video, dimostriamo un metodo per la coltura istologica dei capelli, la crescita della pelle e la trasduzione ex vivo dei follicoli piliferi con la proteina verde fluorescente.
Questa tecnica di trasduzione efficiente è utile per seguire l'attività del promotore di vari geni di interesse in diverse regioni del follicolo durante tutto il suo ciclo di crescita. Mi chiamo Robert Hoffman. Sono il presidente di Anti-Cancer Inc.
Oggi vi mostreremo procedure molto efficaci per la terapia genica del follicolo pilifero. Questo protocollo inizia con la istocoltura della pelle, seguita dal trattamento con collagenasi. Innanzitutto si sacrifica il miser sei giorni dopo l'esaurimento, e la pelle del dorso viene rimossa a livello del tessuto sottocutaneo.
Dopo la rimozione della cute, si asporta il tessuto sottocutaneo. La pelle viene quindi risciacquata in PBS privo di calcio e magnesio. A questo punto, la cute dissezionata viene trasferita nel mezzo dopo il risciacquo in PBS.
I campioni di pelle vengono tagliati in piccoli pezzi di circa un millimetro cubo. Una frazione dei campioni viene messa da parte e coltivata in RPMI 1640 e 10% di siero fetale bovino come controllo non trattato. Il resto dei campioni viene incubato in due mg per ml.
Soluzione di collagenasi. In mezzo RPMI per 45 minuti fino a 3,75 ore a 37 gradi, i campioni digeriti vengono quindi lavati in PBS privo di calcio e magnesio. Le colture istologiche possono essere infettate con virus per la trasduzione di GFP. Ora che la collagenasi ha reso i follicoli piliferi più accessibili al virus, è possibile indurre i follicoli piliferi.
Per esprimere la GFP, vengono prima infettati con il virus adenovirus. Successivamente, un plasmide portatore di GFP viene aggiunto alla pelle trattata con collaghenasi. I colture istologiche contengono da 2,4 milioni a 5 miliardi di unità formanti colonie per millilitro.
Dopo l'aggiunta del virus, i campioni vengono ora posti nell'incubatrice per un periodo da una a sei ore dopo la trasduzione virale di GFP in colture istologiche di pelle; circa 24 ore dopo il prelievo, i campioni possono essere trapiantati su topi nudi o su topi C57 neri sei. L'espressione di GFP può quindi essere valutata mediante microscopia a fluorescenza eseguita direttamente sulle colture istologiche o visualizzata in vivo sul tessuto cutaneo trapiantato. Per determinare l'efficienza della trasduzione di GFP, viene stabilito il numero totale di follicoli piliferi e di follicoli piliferi positivi per GFP mediante microscopia in campo chiaro e microscopia a fluorescenza.
Vengono analizzati cinque campi microscopici scelti casualmente, che coprono un'area di 0,581 millimetri quadrati. Per l'espressione di GFP, vengono contati almeno 500 peli per campione al fine di determinare la percentuale di follicoli piliferi positivi al GFP. I follicoli piliferi in cui il GFP è visibile in qualsiasi parte della bulbula o del fusto del pelo vengono considerati positivi al GFP.
Vi abbiamo appena mostrato un metodo altamente efficiente per la trasduzione di GFP e follicoli piliferi, che sarà estremamente utile per la terapia genica. Queste conoscenze rivestono un'importanza clinica perché hanno implicazioni nella cura dell'alopecia o della calvizie, nella prevenzione dell'alopecia indotta dalla chemioterapia e nella modifica permanente del colore dei capelli. Grazie per averci seguito e buona fortuna con i vostri esperimenti.
Panoramica
Il follicolo pilifero è un'appendice cutanea complessa che subisce un ciclo continuo, rendendolo un bersaglio per la terapia genica. Questo articolo illustra metodi per la coltura istologica e la trasduzione genica nei follicoli piliferi, che potrebbero avere implicazioni nel trattamento della perdita dei capelli.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Terapia genica
- Dermatologia
Sfondo
- I follicoli piliferi sono composti da diversi tipi cellulari e strutture.
- Attraversano cicli di crescita influenzati dalle cellule staminali.
- La terapia genica potrebbe potenzialmente trattare condizioni come la calvizie.
- Comprendere la biologia del follicolo pilifero è fondamentale per sviluppare trattamenti efficaci.
Scopo dello studio
- Dimostrare un metodo per l'istocoltura dei follicoli piliferi.
- Esplorare tecniche di trasduzione genica per i follicoli piliferi.
- Valutare l'efficienza dell'espressione di GFP nei follicoli piliferi.
Metodi Utilizzati
- Coltura istologica di campioni di pelle seguita da trattamento con collaghenasi.
- Infezione dei follicoli piliferi con adenovirus portatore del plasmide GFP.
- Valutazione dell'espressione di GFP mediante microscopia a fluorescenza.
- Analisi dell'efficienza di trasduzione mediante conteggio dei follicoli piliferi positivi per GFP.
Risultati principali
- È stata ottenuta una trasduzione efficiente dei follicoli piliferi con GFP.
- L'espressione di GFP può essere visualizzata in vivo e in colture istologiche.
- Il metodo mostra potenzialità per applicazioni nella terapia genica.
- Sono state discusse le implicazioni per il trattamento dell'alopecia e la modifica del colore dei capelli.
Conclusioni
- Lo studio presenta un metodo potente per la terapia genica del follicolo pilifero.
- Comprendere la trasduzione genica può portare a progressi nel trattamento della perdita dei capelli.
- La ricerca futura potrebbe concentrarsi sulle applicazioni cliniche di queste tecniche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La trasduzione virale ex vivo mirata dei follicoli piliferi consente un rilascio preciso del gene a popolazioni cellulari follicolari distinte, supportando l'analisi funzionale dell'espressione genica in un tessuto complesso e rigenerativo. Questo approccio aumenta la fiducia predittiva nelle strategie di terapia genica per i percorsi di medicina dermatologica e rigenerativa, in particolare quando sono fondamentali la specificità per tipo cellulare e l'efficienza quantitativa della trasduzione. Gli output quantitativi e la riproducibilità del metodo lo posizionano come uno strumento prezioso per la validazione precoce dei bersagli e la ricerca traslazionale nell'ambito della ricerca e sviluppo biotecnologica e farmaceutica.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Consente la validazione funzionale di geni bersaglio in popolazioni cellulari definite del follicolo pilifero.
- Permette la riduzione dei rischi meccanicistici consentendo il tracciamento spaziale e temporale dell'espressione genica mediante GFP.
- Facilita la valutazione quantitativa dell'attività del promotore e dell'efficienza di consegna del gene.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Fornisce un sistema riproducibile ex vivo per la valutazione di vettori e costrutti di trasferimento genico.
- Produce letture standardizzate e quantificabili dell'efficienza di trasduzione mediante microscopia a fluorescenza.
- Permette lo sviluppo di saggi per lo screening di candidati per la terapia genica mirati alla biologia della pelle e dei follicoli piliferi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea a sistemi rilevanti per la malattia per la modellizzazione di disturbi del follicolo pilifero e terapie rigenerative.
- Permette una continuità dalla scoperta alla validazione preclinica consentendo il trapianto in vivo e il monitoraggio longitudinale dell'espressione genica.
- Supporta decisioni di avanzamento proporzionate al rischio per programmi di terapia genica mirati agli annessi cutanei.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo di trasduzione virale ex vivo si inserisce nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica, collegando la validazione in vitro alla valutazione funzionale in vivo per candidati di terapia genica mirati alla biologia del follicolo pilifero.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante l'analisi mirata dell'espressione genica in sottopopolazioni del follicolo pilifero.
- Screening: Fornisce dati quantitativi e riproducibili sull'efficienza di trasduzione per guidare la selezione di vettori e costrutti.
- Analisi: Offre misurazioni robuste basate sulla fluorescenza per confrontare le condizioni e i risultati della somministrazione genica.
- Ricerca traslazionale: Favorisce la continuità preclinica attraverso il trapianto e il monitoraggio in vivo di follicoli geneticamente modificati.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma scalabile e adattabile per valutare diverse modalità di terapia genica in modelli di cute e follicoli piliferi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi della terapia genica e riduce l'ambiguità meccanicistica nei tessuti complessi.
- Valore operativo: Standardizza i flussi di lavoro per la somministrazione e la quantificazione genica al fine di garantire riproducibilità e scalabilità.
- Valore strategico: Orienta le decisioni di avanzamento o interruzione e la selezione del portafoglio fornendo dati quantitativi sulla trasduzione specifici per tipo cellulare.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei beni terapeutici genici mirati a indicazioni dermatologiche e rigenerative in base al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coltura tissutale ex vivo, nella manipolazione di vettori virali e nella microscopia a fluorescenza.
- Richiede l'accesso a infrastrutture analitiche per l'imaging quantitativo e l'analisi dei dati.
- Necessita di una standardizzazione tra gruppi diversi delle procedure di elaborazione dei tessuti e dei criteri di valutazione per garantire la riproducibilità.
- Potrebbe essere necessaria un'adattamento per diverse specie, tipi di follicoli piliferi o vettori di trasferimento genico.
- L'efficienza e la specificità possono variare in base al tipo di vettore, alla scelta del promotore e alle condizioni del tessuto.
