Valutazione dell'effetto dei filtri e dei pre-filtri rivestiti sull'infettività e la concentrazione del virus Phi6 aerosolizzato

Indaghiamo l'effetto dei pre-filtri e dei rivestimenti antivirali nella riduzione dell'infettività e delle concentrazioni di virus trasmessi dall'aria negli ambienti interni. Gli approcci attuali mancano una dinamica realistica del flusso d'aria. Il nostro protocollo ricrea le condizioni degli aerosol e misura sia i virus infettivi sia il carico virale totale.

Per cominciare, diluire la sospensione purificata del batteriofagio phi6 in un tampone di fosfato di potassio da 20 millimolari contenente un cloruro di magnesio millimolare regolato al pH 7,2. Assemblare tutti i materiali del filtro, del prefiltro e del rivestimento antivirale all'interno dell'armadietto di biosicurezza per eseguire i test superficiali. Valutare l'attività antivirale di tutti i materiali di rivestimento basati su rame o componenti attivi in rame e argento incorporati in matrici proprietarie, ovvero A6, B4, VS e VS B su pezzi di prova piatti.

Successivamente, si pipettano 20 microlitri di soluzione diluita di bactiofagi phi6 su pezzi di prova rivestiti per eseguire il test di validità superficiale. Distribuisci il campione uniformemente su un'area di due per due centimetri usando un triangolo di vetro sterile. Incubare i campioni a 22 gradi Celsius fino a quattro punti temporali, inclusi un minuto, cinque minuti, un'ora o tre ore.

Aggiungi 180 microlitri di brodo LB fresco in superficie per recuperare i virus dopo ogni momento temporale. Lava la superficie pipettando ripetutamente 10-20 volte per raccogliere il campione. Usa una piastra di Petri di plastica come superficie di controllo.

Quantificare l'efficacia antivirale dei rivestimenti superficiali utilizzando il test della placca per misurare il numero di particelle virali infettive e la reazione a catena della polimerasi inversa quantitativa, o qRT-PCR, per determinare il numero di copie del genoma virale. Diluire la sospensione purificata e concentrata del batteriofagio phi6 come dimostrato in precedenza per ottenere una concentrazione virale nell'intervallo di 2,5 volte 10 fino alla potenza di 10, fino a 4,08 per 10 alla potenza di 11 unità formanti placca per millilitro. Successivamente, assembla la camera sperimentale dell'aerosol usando un corpo cilindrico in vetro con un coperchio abbinato.

Inserire l'impalcatura metallica interna nella camera e fissare guarnizioni isolanti per garantire una tenuta ermetica. Utilizzare un nebulizzatore in combinazione con una pompa ad aria per generare un apporto stabile e riproducibile di aerosol virali. Titolare la soluzione virale utilizzata nel nebulizzatore prima e dopo ogni esperimento per monitorare la stabilità.

Imposta la portata dell'aerosol a otto litri al minuto all'interno della camera. Per ridurre l'umidità durante misurazioni prolungate, indirizza circa tre quarti del flusso di aerosol verso lo scarico attraverso un filtro HEPA ad aria particolato ad alta efficienza. Lascia entrare nella camera il restante quarto del flusso corrispondente a due litri al minuto.

Usa un imbuto per indirizzare il flusso di aerosol verso il filtro o la superficie del prefiltro all'interno della camera. Deumidifica il flusso d'aria in uscita usando un essiccatore per proteggere il filtro HEPA e il misuratore di portata dall'eccessiva umidità. Utilizzando la pompa esterna, si crea una pressione negativa all'interno del sistema e si sostiene ulteriormente il flusso d'aria per garantire un efficiente scarico attraverso la porta di uscita.

Valutare le proprietà antivirali dei prefiltri in poliestere e bulpren non rivestiti o rivestiti di B VS insieme ai materiali a doppio strato di fibre di vetro all'interno della camera aerosol. Per valutare l'effetto antivirale tramite campionamento per impazione, posizionare una piastra di Petri contenente 20 millimolari HEPES buffer a pH 7,2 direttamente sotto il prefiltro di test per massimizzare la deposizione delle particelle. In alternativa, per testare l'effetto antivirale dei filtri GF2, si installa un impinger a triplo ugello tutto in vetro collegato a una pompa esterna per la raccolta degli aerosol.

Mantieni il flusso d'aria attraverso il prefiltro o filtro di prova a due litri al minuto. Aumenta l'ingresso totale d'aria a 10 litri al minuto utilizzando una valvola aggiuntiva dopo l'uscita della camera. Cattura gli aerosol in cinque millilitri di buffer HEPES da 20 millimolari.

E ripristinare il tampone evaporato ogni 30 minuti. Per il campionamento triplicata, esegui le corse di controllo senza pre-filtri o filtri per 15 minuti prima e dopo ogni esperimento. Dopo la prova di controllo pre-esperimento, inserire il filtro o il prefiltro nella camera e far funzionare il sistema per tre ore.

Raccogli aerosol virali recuperando un millilitro di sospensione da piastre di Petri contenenti 20 millilitri di tampone ogni 30 minuti. Rimuovere il filtro e eseguire una prova di controllo post-esperimento. Raccogliere campioni ogni 30 minuti durante l'esperimento per ottenere otto campioni qRT-PCR e titolazione ciascuno per esperimento.

Negli esperimenti con l'impinger, si raccolgono campioni di titolazione una sola volta al termine delle tre ore di ricorrimento. Utilizzare 800 microlitri del campione raccolto per l'analisi qRT-PCR e i restanti 200 microlitri per la titolazione del virus. Congelare rapidamente i campioni qRT-PCR in azoto liquido e conservarli a 80 gradi Celsius.

Processare immediatamente i campioni di titolazione del virus utilizzando il test di placca. I test di viabilità superficiale hanno dimostrato che tutti i rivestimenti testati hanno inattivato con successo il virus, con riduzioni significative osservate nei primi cinque minuti. Il rivestimento superficiale a base di rame, B4, ha raggiunto la riduzione più rapida, diminuendo il numero di infezioni di tre ordini di grandezza in cinque minuti e raggiungendo l'inattivazione completa con un limite di rilevamento inferiore a 100 unità di formazione di placca per millilitro entro 15 minuti.

Il rivestimento A6 ha raggiunto l'inattivazione totale del virus entro 25 minuti, e il VS B in 60 minuti. Il rivestimento VS ha mostrato il tasso di inattivazione più lento tra i materiali testati. I pre-filtri studiati BP6, S11 e FMR5 sono stati altrettanto efficaci nel ridurre il numero di virus infettivi, passandoli attraverso di 1,5-2 ordini di grandezza rispetto al controllo senza filtro.

I filtri GF2 hanno dimostrato prestazioni superiori, riducendo il carico virale di almeno sei ordini di grandezza, e non sono state rilevate placche infettive del virus phi6 entro il limite di rilevamento. Il rivestimento VS B non ha influenzato in modo significativo l'efficacia della filtrazione del virus infettivo rispetto ai pre-filtri non rivestiti. I risultati qRT-PCR hanno mostrato che i prefiltri riducevano il numero di copie del genoma virale fino a due ordini di grandezza.

Il filtro GF2 ha mostrato una diminuzione fino a quattro ordini di grandezza rispetto al controllo senza filtro. Sebbene le differenze tra prefiltri e controllo rimanessero insignificanti nei primi 30 minuti, l'efficienza del filtraggio meccanico aumentava rispetto al punto di 60 minuti. Inoltre, l'applicazione del rivestimento VS B non ha avuto effetti misurabili sul numero di genomi virali che attraversano il mezzo filtrante.

Questo protocollo consente ai ricercatori di quantificare l'inattivazione virale, l'efficienza di filtrazione e le differenze tra particelle infettive e carico virale totale. Una sfida chiave è il tempo di contatto molto breve con la superficie del virus durante il flusso d'aria, il che limita l'efficacia dei rivestimenti antivirali. Studi futuri possono esplorare la combinazione dei rivestimenti con i raggi UV o il test delle prestazioni in sistemi di ventilazione reali e con diversi virus.