Marcatura Endogena Fluorescente mediata da CRISPR/Cas9 dei geni specifici della linea germinale in Caenorhabditis elegans

Utilizziamo il marcatore endogeno basato su CRISPR per studiare la localizzazione e la dinamica delle proteine germinali in C. elegans. I transgeni convenzionali possono influenzare l'espressione della linea germinale, ma questo protocollo etichetta le proteine nel locus endogeno sotto controllo nativo. Per cominciare, identificare i geni candidati con espressione predominante nelle gonadi o nelle cellule germinali utilizzando database pubblici e letteratura pubblicata.

Dopo aver aperto la voce UniProt per la proteina bersaglio, clicca su Struttura per valutare le caratteristiche strutturali e i domini proteici e identificare un sito di marcatura fluorescente appropriato. Scorri verso il basso e apri la voce AlphaFold del database per verificare i valori di fiducia del modello. Clicca su Dominii per classificazioni strutturali specifiche.

Successivamente, apri la pagina dei geni target in WormBase. Scorri verso il basso e clicca sul widget Sequenze e sul link principale della trascrizione per aprire la pagina della trascrizione. Scorri fino alla sezione Sequenze e clicca sull'opzione specifica per rivelare la sequenza sunita della trascrizione selezionata.

Nella pagina web dello strumento di progettazione RNA della guida IDT CRISPA-Cas9, copiate e incollate la prima sequenza esoneica del gene bersaglio dalla pagina WormBase, e selezionate C, elegans dal menu a tendina Specie per la progettazione di RNA o gRNA guida. Clicca sul pulsante DESIGN per ottenere e esaminare la sequenza gRNA raccomandata in alto e la corrispondente sequenza PAM. Su SnapGene, seleziona Sequenza per identificare il punto di clonazione tra il promotore CeU6 e le regioni dell'impalcatura gRNA.

Copia la sequenza gRNA dalla pagina dello strumento IDT, incollala nella finestra di dialogo di inserimento e clicca su Inserisci per integrare lo spaziatore nel plasmide di espressione CRISPR. Per confermare l'accuratezza dell'inserimento del gRNA, selezionare la sequenza e cliccare su Mostra allineamenti per confrontare il risultato del sequenziamento Sanger base per base con la sequenza attesa. Per costruire il plasmide donatore, copiare le sequenze genomiche del braccio omologico da WormBase.

In SnapGene, incolla la sequenza e clicca su Inserisci. Successivamente, clicca con il tasto destro sul sito di inserimento per aprire la finestra Imposta colore DNA e cambiala in Arancione per segnare la giunzione. Copia la sequenza di inserimento della proteina fluorescente verde o GFP e incollala direttamente nella posizione segnata.

Poi clicca su Aggiungi Funzionalità. Nomina la funzione GFP. Cambia il colore del display in verde e clicca su OK per completare l'assemblaggio del plasmide donatore in silico.

Per introdurre una sostituzione silenziosa nel modello plasmidico donatore per prevenire il ritaglio di Cas9 dopo l'integrazione, si copia lo spaziatore gRNA a 19 nucleotidi dal vettore di espressione. Nella scheda plasmide donatore, incolla la sequenza nella barra di ricerca Trova DNA per localizzare il sito bersaglio e selezionare la posizione specifica del nucleotide da mutare. In Sostituisci base, inserisci nuovo nucleotide e clicca su Inserisci.

Clicca con il tasto destro sulla base modificata e usa Imposta colore DNA per cambiare il colore in rosso. Allineare i risultati del sequenziamento Sanger del plasmide donatore con la sequenza attesa per confermarne l'integrità. Prepara la miscela di iniezione combinando il plasmide di espressione CRISPR, il plasmide donatore e i marcatori di co-iniezione in acqua sterile doppiamente distillata fino a un volume finale di 10 microlitri alla concentrazione mostrata.

Poi centrifuga la miscela a 10.000 g per 10-20 minuti per eliminare il materiale particolato e evitare l'ostruzione del capillare di microiniezione. Usa un estratore per aghi per creare aghi di microiniezione da capillari di vetro con un lungo taper e una punta affilata adatti all'iniezione gonadale, ottimizzando empiricamente le impostazioni polari. Riscalda una micropipetta e scomponila in due pezzi per creare uno strumento di caricamento.

Attacca una lampadina aspiratrice in gomma all'estremità larga della micropipetta microcapillare accorciata. Aspirare circa un microlitro di miscela iniezione nel caricatore. Inserisci il caricatore nella parte posteriore dell'ago di iniezione e dispensa delicatamente il mix di iniezione.

Posiziona l'ago caricato orizzontalmente per 10 minuti per formare una colonna continua e permettere alla soluzione di depositarsi verso la punta. Monta l'ago sul microscopio a iniezione e porta la punta a fuoco usando ottica a campo chiaro. Apri la punta dell'ago con un contatto delicato con il bordo di un slip di copertura in olio di halocarburi e verifica il flusso.

Per coltivare i vermi per l'iniezione, mantenere i vermi selvatici N2 su piastre di mezzo con semi batterici OP50. Seleziona gli ermafroditi allo stadio L4 da una piastra sana e incuba a 20 gradi Celsius per 10 ore per ottenere giovani adulti con linee germinali ben sviluppate. Trasferire i vermi su un piatto non seminato per ridurre il trasferimento batterico.

Prepara un tampone asciutto al 2%agarosio su un vetrino di vetro. E applica una goccia di olio halocarbonico. Usa un raccoglicciglie per trasferire un verme sul cuscinetto di agarosio e immobilizzarlo.

Utilizzare un obiettivo a basso ingrandimento per orientare la gonade per l'iniezione. Usa i controlli del micromanipolatore per posizionare l'ago a un angolo di 20-40 gradi rispetto al verme. Usa un ingrandimento elevato per mettere a fuoco la linea germinale distale.

Avanza il verme sull'ago e posiziona la punta all'interno del sincizio gonadale. Inietta la soluzione finché la gonade non si gonfia. Ritira l'ago e riposiziona per le successive iniezioni.

Aggiungi il buffer M9 per ammorbidire e rompere parzialmente il pad di agarosio per liberare i vermi. Trasferire ogni verme su una singola piastra di recupero. Poi ripeti le iniezioni per 20-25 vermi.

Selezionare la progenie F1 per i marcatori di co-iniezione e selezionare animali positivi per marcatori. Trasferire ogni verme F1 su una singola piastra e lasciare uno o due giorni per la deposizione delle uova. Lisare ogni verme F1 in un tampone di proteinasi K per preparare i modelli PCR.

Esegui la PCR tramite giunzione utilizzando un primer genomico esterno al braccio di omologia e un primer interno del tag. E mantenere le piastre corrispondenti degli animali F1 PCR-positivi. Isolare la progenie F2 dalle linee F1 PCR-positive su singole placche per produrre progenie.

Lyse adulti per la genotipizzazione. Eseguire la PCR utilizzando primer che affiancano i bracci di omologia per distinguere alleli di tipo selvatico e alleli knock-in in base alla dimensione del prodotto. Utilizzare lo strumento SnapGene per verificare e validare la corretta integrazione sia alle giunzioni di inserimento sinistra che a destra allineando i risultati del sequenziamento Sanger con la sequenza genomica editata attesa.

Utilizzare la microscopia a fluorescenza per verificare l'espressione e la localizzazione della linea germinale. Espandere le linee omozigote confermate. Mantenere le scorte e linee validate con criopreservazione per la conservazione a lungo termine.

Lo screening basato sulla PCR dei discendenti F1 ha rivelato knock-in riusciti identificati da un amplicon PCR a giunzione di 1.550 coppie di basi utilizzando un primer genomico di fiancheggiamento e uno interno GFP. L'assenza della banda di 1.550 coppie di basi nella maggior parte degli animali F1 indicava l'assenza di integrazione rilevabile del bersaglio, coerente con una trasmissione non integrativa del DNA piuttosto che con una riparazione diretta dall'omologia. La determinazione della zigosità nei progenitori F2 derivati da linee PCR-positive a giunzioni distingue gli alleli per dimensione della banda a 1.345 coppie di basi come allele di tipo selvatico e 2.344 coppie di basi come allele knock-in.

Gli eterozigoti mostrano entrambe le bande. I campioni omozigoti knock-in non hanno la banda di dimensione wild-type, e i campioni con integrazione fallita mostrano solo il prodotto di dimensione wild-type. Ulteriore validazione della linea omozigote di effetto GFP è stata effettuata utilizzando imaging microscopico confocale, dove è stata osservata fluorescenza GFP nelle cellule germinali con segnale arricchito nella regione spermatogenica.

Questo protocollo consente l'analisi in vivo della localizzazione e dinamica delle proteine nella linea germinale di C. elegans. Una progettazione attenta dei tag e una validazione accurata sono essenziali per preservare la funzione proteica e minimizzare i candidati falsi positivi. Studi futuri potranno utilizzare questo flusso di lavoro per monitorare la localizzazione delle proteine ed esplorare potenziali interazioni durante lo sviluppo della linea germinale.