Name: Marcatura Endogena Fluorescente mediata da CRISPR/Cas9 dei geni specifici della linea germinale in Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-05-29T13:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Impara a marcare endogenamente proteine fluorescenti nella linea germinale di Caenorhabditis elegans usando CRISPR/Cas9. Questo protocollo consente alleati knock-in stabili per studiare la localizzazione proteica in vivo sotto controllo nativo.

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	<li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transparent+window+into+biology:+a+primer+on+Caenorhabditis+elegans.">A transparent window into biology: a primer on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).</li><li>Pazdernik, N., Schedl, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+germ+cell+development+in+Caenorhabditis+elegans.">Introduction to germ cell development in Caenorhabditis elegans.</a> Adv Exp Med Biol. 757, 1-16 (2013).</li><li>Ebbing, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+transcriptomics+of+C.+elegans+males+and+hermaphrodites+identifies+sex-specific+differences+in+gene+expression+patterns.">Spatial transcriptomics of C. elegans males and hermaphrodites identifies sex-specific differences in gene expression patterns.</a> Dev Cell. 47 (6), 801-813.e6 (2018).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+single-cell+architecture+of+gene+expression+in+Caenorhabditis+elegans+germ+cells.">Spatiotemporal single-cell architecture of gene expression in Caenorhabditis elegans germ cells.</a> Cell Discov. 11 (1), 26 (2025).</li><li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+in+C.+elegans:+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences.">Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10 (12), 3959-3970 (1991).</li><li>Kelly, W. G., Fire, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+silencing+and+the+maintenance+of+a+functional+germline+in+Caenorhabditis+elegans.">Chromatin silencing and the maintenance of a functional germline in Caenorhabditis elegans.</a> Development. 125 (13), 2451-2456 (1998).</li><li>Robert, V. J., Sijen, T., van Wolfswinkel, J., Plasterk, R. H. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+and+RNAi+factors+protect+the+C.+elegans+germline+against+repetitive+sequences.">Chromatin and RNAi factors protect the C. elegans germline against repetitive sequences.</a> Genes Dev. 19 (7), 782-787 (2005).</li><li>Merritt, C., Seydoux, G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+solutions+for+the+germline.">Transgenic solutions for the germline.</a> WormBook. , 1-21 (2010).</li><li>Fr&#x00F8;kj&#x00E6;r-Jensen, C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-copy+insertion+of+transgenes+in+Caenorhabditis+elegans.">Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans.</a> Nat Genet. 40 (11), 1375-1383 (2008).</li><li>Vallin, E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+collection+of+Mos1+transposon+insertion+mutants+for+the+C.+elegans+research+community.">A genome-wide collection of Mos1 transposon insertion mutants for the C. elegans research community.</a> PLoS One. 7 (2), e30482 (2012).</li><li>Dickinson, D. J., Ward, J. D., Reiner, D. J., Goldstein, B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+Cas9-triggered+homologous+recombination.">Engineering the Caenorhabditis elegans genome using Cas9-triggered homologous recombination.</a> Nat Methods. 10 (10), 1028-1034 (2013).</li><li>Friedland, A. E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heritable+genome+editing+in+C.+elegans+via+a+CRISPR-Cas9+system.">Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system.</a> Nat Methods. 10 (8), 741-743 (2013).</li><li>Nance, J., Fr&#x00F8;kj&#x00E6;r-Jensen, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+transgenic+toolbox.">The Caenorhabditis elegans transgenic toolbox.</a> Genetics. 212 (4), 959-990 (2019).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+CRISPR-Cas9-mediated+genome+editing+to+study+spermatogenesis+in+Caenorhabditis+elegans.">Protocol for CRISPR-Cas9-mediated genome editing to study spermatogenesis in Caenorhabditis elegans.</a> STAR Protoc. 4 (4), 102720 (2023).</li><li>Khan, A. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+efficient+ligation-independent+cloning+system+for+CRISPR/Cas9-based+genome+editing+in+plants.">A highly efficient ligation-independent cloning system for CRISPR/Cas9-based genome editing in plants.</a> Plant Methods. 13, 86 (2017).</li><li>Ghanta, K. S., Ishidate, T., Mello, C. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+for+precision+genome+editing+in+Caenorhabditis+elegans.">Microinjection for precision genome editing in Caenorhabditis elegans.</a> STAR Protoc. 2 (3), 100748 (2021).</li><li>Rieckher, M., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+microinjection.">Caenorhabditis elegans microinjection.</a> Bio Protoc. 7 (19), e2584 (2017).</li><li>Medley, J. C., Hebbar, S., Sydzyik, J. T., Zinovyeva, A. Y. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+nucleotide+substitutions+effectively+block+Cas9+and+allow+for+scarless+genome+editing+in+Caenorhabditis+elegans.">Single nucleotide substitutions effectively block Cas9 and allow for scarless genome editing in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 220 (1), iyab199 (2022).</li><li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+stable+transgenic+C.+elegans+using+microinjection.">Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection.</a> J Vis Exp. (18), e833 (2008).</li><li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+monomeric+green+fluorescent+protein+derived+from+Branchiostoma+lanceolatum.">A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum.</a> Nat Methods. 10 (5), 407-409 (2013).</li><li>Bajar, B. T., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+brightness+and+photostability+of+green+and+red+fluorescent+proteins+for+live+cell+imaging+and+FRET+reporting.">Improving brightness and photostability of green and red fluorescent proteins for live cell imaging and FRET reporting.</a> Sci Rep. 6, 20889 (2016).</li><li>Bindels, D. S., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mScarlet:+a+bright+monomeric+red+fluorescent+protein+for+cellular+imaging.">mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging.</a> Nat Methods. 14 (1), 53-56 (2017).</li><li>He, S., Cuentas-Condori, A., Miller, D. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NATF+(native+and+tissue-specific+fluorescence):+a+strategy+for+bright,+tissue-specific+GFP+labeling+of+native+proteins+in+Caenorhabditis+elegans.">NATF (native and tissue-specific fluorescence): a strategy for bright, tissue-specific GFP labeling of native proteins in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 212 (2), 387-395 (2019).</li><li>Paix, A., Folkmann, A., Seydoux, G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+genome+editing+using+CRISPR-Cas9+and+linear+repair+templates+in+C.+elegans.">Precision genome editing using CRISPR-Cas9 and linear repair templates in C. elegans.</a> Methods. 121-122, 86-93 (2017).</li></ol>

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Beijing Lablead Biotech Co., Ltd.</td><td>QZ02</td><td>Componente per la preparazione di piastre di agar NGM</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>NOVON</td><td>ZZ14011</td><td>Preparazione di pastiglie di agarose al 2%</td></tr><tr><td>Cenorhabditis elegans ceppo N2 </td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td>Ceppo di sfondo per iniezione</td></tr><tr><td>Centrifughe</td><td>Eppendorf</td><td>5425</td><td>Chiarimento del mix per iniezione</td></tr><tr><td>Colesterolo</td><td>Beijing Chemical Reagents Company</td><td>57-88-5</td><td>Componente per la preparazione di piastre di agar NGM</td></tr><tr><td>Plasmidi per marcatori di co-iniezione rol-6 (su1006) (pRF4)</td><td>Guangshuo Ou Lab</td><td></td><td>Marcatore roller per arricchire i candidati</td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>ZEISS</td><td>LSM880 + Airyscan</td><td>Convalida dell'espressione/localizzazione GFP</td></tr><tr><td>Di-Potassio idrogeno fosfato (K2HPO4)</td><td>Sinapharm</td><td>CAS: 7758-11-4</td><td>Componente per la preparazione di piastre di agar NGM</td></tr><tr><td>Di-Sodio idrogeno fosfato (Na2HPO4)</td><td>Sinapharm</td><td>CAS: 7558-79-4</td><td>Componente per la preparazione del buffer M9</td></tr><tr><td>Scala di DNA</td><td>Mei5 Biotechnology, Co., Ltd.</td><td>MF288-01</td><td>Riferimento dimensionale per gel di agarose</td></tr><tr><td>Backbone plasmide donatore (pPD95.75)</td><td>Addgene</td><td>1494</td><td>Backbone per la costruzione del donatore HDR</td></tr><tr><td>Sistema di elettroforesi </td><td>Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.</td><td>112-0630</td><td>Separazione di ampliconi PCR su gel di agarose per lo screening delle giunzioni e il genotipizzazione della zigosi</td></tr><tr><td>Ceppo di Escherichia coli OP50</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td>Fonte di cibo per i vermi</td></tr><tr><td>Plasmidi marcatori co-iniezione fluorescenti (pPD122.11)</td><td>Fire Lab</td><td></td><td>Co-marcatore GFP per arricchire i candidati</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio fluorescente</td><td>SOPTOP</td><td>SZX12-HT</td><td>Screening di vermi vivi per marcatori co-iniezione fluorescenti</td></tr><tr><td>GelRed Nucleic Acid Gel Stain</td><td>Mei5 Biotechnology, Co., Ltd.</td><td>MF079-plus-01</td><td>Visualizzazione delle bande di DNA</td></tr><tr><td>Capillari di vetro</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td>Usati con il tira-aghi per realizzare aghi di iniezione</td></tr><tr><td>Olio di Halocarbon 700</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8898-50ML</td><td>Prevenzione dell'essiccamento durante l'iniezione</td></tr><tr><td>Incubatrice</td><td>Wuhan Ruihua Instrument &amp; Equipment Co., Ltd.</td><td>HP400S</td><td>Mantenimento dei vermi a temperatura standard</td></tr><tr><td>Solfato di magnesio (MgSO4)</td><td>Sinapharm</td><td>CAS: 7487-88-9</td><td>Componente per la preparazione di piastre di agar NGM e buffer M9</td></tr><tr><td>Pipette microcapillari</td><td>KIMBLE</td><td>71900-50</td><td>Riscaldati e spezzati per creare lo strumento di caricamento</td></tr><tr><td>Unità microiniettore</td><td>Eppendorf</td><td>FemtoJet 4i</td><td>Erogazione di impulsi di pressione controllati di mix di iniezione nel gonade distale tramite un ago di microiniezione (attivato tramite pedaliera)</td></tr><tr><td>Vetrini di copertura per microscopio</td><td>Fisherbrand</td><td>12545A 22&times;30-1</td><td>Preparazione di pastiglie di agarose al 2% per il montaggio e l'immobilizzazione dei vermi durante la microiniezione; Apertura delle punte degli aghi di iniezione contro il bordo del vetrino</td></tr><tr><td>Microscopio per microiniezione</td><td>ZEISS</td><td>Axio Observer.A1</td><td>Microscopio per iniezione</td></tr><tr><td>Tira-aghi</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>Model P97</td><td>Trasformazione di capillari di vetro in aghi di iniezione</td></tr><tr><td>Termociclatore PCR</td><td>Bio-Rad</td><td>C1000 Touch Thermal Cycler</td><td>Amplificazione PCR</td></tr><tr><td>pDD162 (Peft-3::Cas9 + sgRNA vuoto)</td><td>Addgene</td><td>47549</td><td>Espressione Cas9 + sgRNA</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Gibco</td><td>308723</td><td>Componente per la preparazione di piastre di agar NGM</td></tr><tr><td>Di-Potassio diidrogeno fosfato (KH2PO4) </td><td>Sinapharm</td><td>CAS: 7778-77-0</td><td>Componente per la preparazione di piastre di agar NGM e buffer M9</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio (NaCl)</td><td>Sinapharm</td><td>CAS: 7647-14-5</td><td>Componente per la preparazione di piastre di agar NGM e buffer M9</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Motic</td><td>K400L</td><td>Prelievo e montaggio dei vermi su pastiglie di agarose e esecuzione delle fasi di recupero post-iniezione</td></tr></tbody></table>

marcatura endogena fluorescente mediata da crispr/cas9 dei geni specifici della linea germinale in caenorhabditis elegans

CRISPR/Cas9-mediated Endogenous Fluorescent Tagging of Germline-specific Genes in Caenorhabditis elegans

Marcatura Endogena Fluorescente mediata da CRISPR/Cas9 dei geni specifici della linea germinale in Caenorhabditis elegans

Protein localization in the Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is central to interpreting gene function during gametogenesis, yet conventional ...

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