Un protocollo semplificato per la microscopia di localizzazione a singola molecola nei nuclei di Arabidopsis
May 8th, 2026
Questo protocollo presenta un flusso di lavoro efficiente per l'imaging microscopico di localizzazione a singola molecola di nuclei isolati di Arabidopsis, utilizzando isolamento, fissazione e marcatura ottimizzati per ottenere una visualizzazione affidabile su scala nanometrica della cromatina e della RNA Polimerasi II. Questo approccio può essere facilmente adattato ad altre proteine associate alla cromatina o modifiche agli istoni per immagini ad alta risoluzione.
La mia ricerca si concentra sull'editing dell'epigenoma e sulla visualizzazione dell'organizzazione della cromatina nei nuclei di Arabidopsis tramite microscopia a super risoluzione. I metodi esistenti non sono adattati all'imaging STORM. Questo protocollo migliora la purezza dei nuclei, la consistenza dell'etichettatura, il montaggio del campione e la stabilità dell'imaging.
Si applica ad Arabidopsis thaliana e ad altri sistemi vegetali per lo studio dell'organizzazione nucleare, della struttura della cromatina ed epigenetica ad alta risoluzione. Per cominciare, posiziona una piastra di coltura a sei pozzi sul ghiaccio sotto la cappa fumi. Mescola la soluzione di fissazione contenente il 4% di volume in volume, formaldeide stabilizzato con metanolo 0,1%, Triton X100 e PBS.
Aggiungi circa quattro millilitri di soluzione di fissazione gelata in ciascun pozzo sotto la cappa fumi. Utilizzando pinze pulite, rimuovere le piantine di Arabidopsis che sono tra otto e quindici giorni dopo la germinazione da Murashige e Skoog a semi-forza solida, o tramite MS. Immergi immediatamente le piantine nella soluzione di fissazione e posiziona circa 20 piantine per pozzo.
Usa tre pozzi per ottenere materiale sufficiente per ogni campione. Metti la piastra nella camera a vuoto riempita di ghiaccio e chiudila. Applica un ciclo di vuoto tra meno 0,6 bar e meno 0,8 bar per 15 minuti per rimuovere l'aria intrappolata e permettere una penetrazione profonda del fissativo nei tessuti vegetali.
Poi, rilascia lentamente il vuoto. Mescola il campione e applica il vuoto per altri 15 minuti. Sotto la cappa fumi, rimuovere la soluzione di fissazione con una pipetta.
Lava ogni pozzo tre volte per 10 minuti ciascuno sotto delicata agitazione usando cinque millilitri di PBS ghiacciato. Dopo i lavaggi, rimuovi il PBS. Utilizzando una pinza, trasferire il tessuto fisso in una piastra di Petri da 120 per 120 millimetri e aggiungere 50 microlitri di tampone isolante dei nuclei alle piantine fissate.
Con una lama, taglia il tessuto fisso. Usando la stessa lama, raschia il tessuto tagliato su un bordo della piastra di Petri. Aggiungi 600 microlitri di tampone isolante per nuclei e lava via qualsiasi tessuto attaccato alla lama.
Trasferisci la suspense in un tubo omogeneizzatore Dounce da due millilitri e accarezza cinque-dieci volte con il pestello più piccolo. Poi, si colpisce con il penello più grande finché non si muove dolcemente all'interno del tubo, richiedendo tipicamente cinque-dieci colpi. Filtrare il campione omogeneizzato attraverso un filtro a rete da 30 micrometri in un tubo da 50 millilitri.
Trasferisci il filtrato in un tubo fresco da 1,5 millilitri. Centrifuga la sospensione per 10 minuti a 800G usando la rampa più bassa sia per l'accelerazione che per la decelerazione. Dopo la centrifugazione, si noti che tra i detriti di tessuto verde è visibile un piccolo pellet bianco.
Scartare il sovrantantante e risospendere il pellet in 600 microlitri di buffer di isolamento dei nuclei. Centrifuga di nuovo per 10 minuti a 800G e rimuovi il soprantantante. Dopo aver completamente lavato via i detriti verdi, conservare la sospensione dei nuclei isolati a quattro gradi Celsius per un massimo di una settimana e immunocolorare i nuclei con gli anticorpi desiderati.
Riscaldare la soluzione di agarosio a bassa fusione al 1,5% di peso per volume a 90 gradi Celsius per un minuto per sciogliere la polvere e ottenere una soluzione trasparente. Vortex brevemente per garantire un mix completo. Raffreddare la soluzione e mantenerla a 37 gradi Celsius prima di procedere per evitare la denaturazione termica del buffer glucosioossidasi.
Dopo che la soluzione di agarosio a bassa fusione raggiunge i 37 gradi Celsius, prepara il tampone STORM aggiungendo 100 millimolari di mercaptoetilamina e buffer di glucosio ossidasi all'agasio a bassa fusione per ottenere una concentrazione finale 1X e mescola delicatamente la soluzione. Depositare 10 microlitri della miscela di nuclei su un slip di copertura da 1,5 ore trattato con ozono, trattato per 20 minuti in un sistema di pulizia con ozono ultravioletto. Aspettare tre minuti per permettere ai nuclei di depositarsi sulla copertura del coperchio.
Poi, rimuovi il liquido in eccesso e attendi due minuti. Aggiungi 10 microlitri di agarosio a bassa fusione preparato al copricapo e copri immediatamente con un vetrino per microscopio. Sigilla il copertino usando un sigillante silicone.
Mescola quantità uguali di soluzione A e soluzione B in una piccola piastra di Petri usando una punta di micropipetta. Applica la miscela sui bordi del slip di copertura per sigillare il campione. Lascia indurire il sigillante siliconico per cinque minuti.
Monta il vetrino sul microscopio e trova la messa a fuoco. Individua e concentrati su un nucleo. Attivare un modulo di mantenimento del focus se disponibile per garantire stabilità durante acquisizioni lunghe.
Seleziona una regione in cui uno o pochi nanodiamanti sono posizionati vicino al nucleo per migliorare la correzione della deriva durante la ricostruzione. Per l'imaging a due colori, inizia l'acquisizione con il canale a lunghezza d'onda più lunga e poi passa al canale a lunghezza d'onda più corta per completare l'imaging. Elaborare gli stack di immagini raw in ThunderSTORM usando il fitting gaussiano con stima dei minimi quadrati ponderati e generare immagini ricostruite.
Applicare un filtraggio basato su sigma e incertezza sotto i 30 nanometri per mantenere localizzazioni accurate e rimuovere rumore. Infine, eseguire la correzione della deriva del campione utilizzando la correlazione incrociata ThunderSTORM o l'algoritmo COMET e confermare la deriva minima nelle immagini ricostruite. I nuclei sono stati isolati da piantine selvatiche di 15 giorni di fa, immunomarcate con anticorpi secondari coniugati AF647 e controcolorati con Hoechst H33258.
L'imaging confocale ha mostrato molteplici nuclei isolati e ben conservati con detriti minimi, con cromocentri e nucleolo chiaramente distinguibili. Il segnale della RNA polimerasi II era assente nei cromocentri e nel nucleolo. Le proiezioni di massima intensità limitate dalla diffrazione e le corrispondenti ricostruzioni SMLM hanno rivelato dettagli strutturali della RNA polimerasi II e della marcatura del DNA, incluse regioni di interesse ingrandite che mostrano strutture più fine.
Il filtraggio della localizzazione basato su sigma e incertezza ha migliorato la definizione sia dei segnali RNA polimerasi II che di quelli del DNA rispetto alle localizzazioni rilevate. E ulteriori perfezionamenti dopo la correzione della deriva mantennero questa struttura migliorata. Il filtraggio basato sui valori sigma rimuoveva le localizzazioni con larghezze di adattamento eccessivamente piccole o grandi.
L'analisi di correlazione ad anello di Fourier ha mostrato che la risoluzione nel canale AF647 è migliorata da 90,1 a 47,7 nanometri dopo il filtraggio, mentre il canale JF549 è migliorato da 56,6 a 27,9 nanometri. Mantenere l'integrità nucleare minimizzando detriti e fluorescenza di fondo è fondamentale per ottenere immagini di alta qualità con singole molecole. Studi futuri possono collegare l'architettura nucleare alla regolazione genica in condizioni ambientali o di sviluppo.
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Overview
This article introduces a streamlined and reproducible protocol for Single-Molecule Localization Microscopy (SMLM), specifically direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM), to visualize chromatin architecture in nuclei isolated from Arabidopsis thaliana. The workflow addresses technical challenges in plant sample preparation, enabling nanoscale imaging of chromatin domains, histone modifications, and nuclear organization with enhanced clarity and reproducibility.
Key Study Components
Area of Science
- Plant cell biology
- Super-resolution microscopy
- Chromatin organization
Background
- Confocal fluorescence microscopy is limited by diffraction, restricting resolution in chromatin studies.
- Super-resolution techniques like SMLM overcome these limitations, providing nanoscale insights.
- dSTORM is widely used in mammalian systems but less so in plants due to sample preparation challenges.
- Improved protocols are needed to facilitate SMLM in plant nuclei.
Purpose of Study
- To develop a reproducible workflow for SMLM imaging of plant nuclei.
- To enable high-resolution visualization of chromatin modifications and nuclear architecture in Arabidopsis thaliana.
- To lower technical barriers for applying super-resolution microscopy in plant biology.
Methods Used
- Fixation of Arabidopsis seedlings to preserve nuclear morphology.
- Gentle tissue chopping and centrifugation to enrich for intact nuclei.
- Fluorophore labeling of isolated nuclei in liquid medium.
- Immobilization of nuclei on low-melting agarose pads for imaging stability.
Main Results
- The protocol minimizes background fluorescence and improves labeling consistency.
- Enhanced reproducibility is achieved across biological replicates.
- Preparations allow clear visualization of chromatin modifications and nuclear architecture at the nanoscale.
- The workflow facilitates studies of epigenetic regulation and nuclear topology in plants.
Conclusions
- This protocol establishes a methodological foundation for SMLM imaging in plant systems.
- It bridges the gap between plant and mammalian cell biology in super-resolution imaging.
- The approach opens new opportunities to study genome regulation and nuclear architecture in response to developmental and environmental cues in plants.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Super-resolution imaging of chromatin architecture in plant nuclei addresses a critical gap in understanding epigenetic regulation and nuclear organization at the nanoscale. This streamlined SMLM protocol for Arabidopsis nuclei enables reproducible, high-resolution visualization, supporting predictive confidence in chromatin state analysis. The approach enhances early discovery and mechanistic de-risking for plant-based R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables nanoscale interrogation of chromatin domains and histone modifications in plant nuclei.
- Supports functional validation of epigenetic targets by visualizing nuclear architecture changes.
- Facilitates mechanistic de-risking through direct observation of chromatin organization.
- Improves predictive confidence in linking nuclear structure to gene regulation.
Screening & Assay Development
- Provides standardized sample preparation for reproducible super-resolution imaging workflows.
- Delivers quantitative, high-clarity readouts of chromatin modifications for assay development.
- Enables consistent labeling and imaging across biological replicates, supporting screening scalability.
- Prepares validated plant nuclear systems for downstream compound or genetic screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns chromatin imaging outputs with translational biomarker discovery in plant systems.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation of epigenetic interventions.
- Enables risk-adjusted advancement by clarifying nuclear topological changes under different conditions.
- Provides mechanistic insights relevant to environmental and developmental response studies.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery continuum from early chromatin hypothesis testing to preclinical validation of epigenetic mechanisms in plants.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven analysis of chromatin organization and nuclear architecture.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for assay standardization.
- Analytics: Enables precise measurement of chromatin modifications and nuclear features for comparative studies.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical research by enabling biomarker alignment in plant systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging workflow adaptable to diverse plant research applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces ambiguity in chromatin state analysis.
- Operational Value: Standardizes sample preparation and imaging, enhancing reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for epigenetic target programs in plant R&D.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of plant-based discovery and translational projects.
Implementation Considerations
- Requires expertise in super-resolution microscopy and plant nuclear isolation.
- Needs access to dSTORM-capable imaging platforms and fluorophore labeling reagents.
- Demands cross-team standardization of fixation, labeling, and immobilization protocols.
- May require adaptation for different plant species or tissue types.
- Sample stability and background minimization are critical for reproducible outputs.
