Isolamento di piccole vescicole extracellulari da muscolo scheletrico murino e midollo osseo tramite cromatografia a esclusione di dimensioni
23 giugno 2026
Questo protocollo descrive l'isolamento di piccole vescicole extracellulari da muscoli scheletrici murini e midollo osseo tramite digestione enzimatica e cromatografia a esclusione di dimensioni, consentendo il recupero riproducibile di frazioni arricchite da vescicole da tessuti strutturalmente complessi e a basso rendimento per l'analisi molecolare a valle.
La nostra ricerca si concentra sull'isolamento di piccole vescicole extracellulari dai muscoli e dal midollo osseo del topo per comprendere come i tessuti scambiano segnali. Questo protocollo può essere applicato a studi relativi all'invecchiamento, alla rigenerazione muscolare, alla fisiologia dell'esercizio e agli studi fisiopatologici del midollo osseo in modelli murini. Per cominciare, inserire i campioni di femore e tibia murino in un armadietto di biosicurezza.
Prepesa e etichetta i tubi centrifughe da 1,5 millilitri. Successivamente, si punge il fondo di un tubo da 0,2 millilitri con un ago sterile calibro 16 tenuto perpendicolare alla base, creando un'unica apertura uniforme. Inserisci il tubo forato nel tubo centrifugo da 1,5 millilitri pre-pesato con un caldo aderente per preparare il sistema del tubo pungente.
Metti le ossa delle gambe in una piastra di Petri sterile. Separare femore e tibia tagliando lo spazio articolare. Taglia entrambe le estremità del femore e della tibia per esporre il midollo rosso.
Inserire le ossa nel tubo PCR perforato, che è posizionato all'interno del tubo da 1,5 millilitri, e sigillare l'insieme con parafilm. Centrifugare il campione per 10 secondi in una microcentrifuga da banco a circa 8.000 g a temperatura ambiente. Verifica il successo dell'estrazione del midollo con la presenza di ossa visibilmente bianche, prive di residuo di midollo rosso nel tubo superiore, e del pellet rosso scuro e compatto sul fondo del tubo inferiore.
Poi si pesa nuovamente il tubo da 1,5 millilitri per determinare la massa del midollo estratto, assicurandosi che rientri nel range previsto di circa 15-30 milligrammi per topo. Aggiungi 250 microlitri di RPMI 1640 a ogni tubo contenente il midollo osseo e metti i campioni sul ghiaccio. Risospendere il midollo pipettando delicatamente su e giù 10-15 volte con una pipetta P1000 fino a ottenere una sospensione omogenea senza residui di grumi o frammenti di tessuto intatti.
Centrifugare il campione a 300 g per 10 minuti a quattro gradi Celsius per ottenere pellet di detriti non digeriti, cellule intate e frammenti di tessuto residui. Trasferire con cura il surnatante in un nuovo tubo sterile da 1,5 millilitri per microcentrifuga senza disturbare il pellet. Centrifugare il soprandanante trasferito a 2.000 g per 15 minuti per rimuovere detriti grandi.
Raccogli il soprandanante in un nuovo tubo e centrifuga nuovamente a 10.000 g per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Poi raccogli almeno 200 microlitri dell'ultimo soprandante in un tubo fresco. Bilanciare la colonna di cromatografia di esclusione dimensionale risciacquandola con sei millilitri di PBS filtrato, mantenendo la colonna e il PBS a temperatura ambiente.
Lascia passare l'intero volume attraverso la colonna per gravità. Poi carica 150 microlitri del surnatante filtrato sulla colonna e lascia che il campione entri completamente nella resina. Il punto finale si raggiunge quando il menisco liquido raggiunge la superficie del letto resinico senza che rimanga liquido visibile sopra la resina umida.
Aggiungi immediatamente 550 microlitri di PBS per iniziare l'eluzione e raccogliere il volume vuoto di 700 microlitri. Scartare il volume vuoto o trattenerlo come frazione vescicolosa non extracellulare. Inizia a raccogliere la frazione arricchita da vescicole extracellulari immediatamente dopo che il volume vuoto di 700 microlitri è stato eludito.
Assicurarsi che vengano raccolti 850 microlitri di eluto arricchito da vescicole extracellulari. Per concentrare la vescicola extracellulare, si carica il campione in un filtro centrifugo pre-risciacquo con un taglio molecolare di 100 kilodalton. Centrifugare il campione a 4.000 g a quattro gradi Celsius, controllando ogni due o tre minuti fino a raggiungere il volume finale desiderato.
Poi recupera la retentazione con una pipetazione delicata. Tieni le frazioni arricchite da vescicole extracellulari sul ghiaccio per analisi immediate, come la microscopia elettronica a trasmissione. L'analisi Western blot ha mostrato la presenza di piccole vescicole extracellulari, o marcatori SEV, nelle frazioni iniziali.
Le frazioni da uno a cinque sono state aggregate per la successiva caratterizzazione di piccole vescicole extracellulari. L'assenza di calnexina e segnali di proteine immunoglobuline di legame in queste frazioni escludevano la contaminazione da membrane intracellulari e componenti del reticolo endoplasmatico. La microscopia elettronica a trasmissione delle frazioni arricchite con SEV F1 a F5 ha rivelato vescicole rotonde intatte con bilayer di membrana chiaramente definiti e diametri inferiori a 200 nanometri.
L'analisi del tracciamento delle nanoparticelle del campione aggregato ha dimostrato una distribuzione unimodale di dimensioni centrata sotto i 200 nanometri con un diametro mediano delle particelle di 147,8 nanometri. La concentrazione di particelle normalizzata alla massa tissutale era più alta nelle frazioni arricchite con SEV F1 a F5 con una potenza di 3,7 per 10 alla potenza di otto particelle per millilitro per milligrammo di tessuto e leggermente ridotta nelle frazioni successive da F6 a F8 a 3,7 per 10 alla potenza di otto particelle per millilitro per milligrammo di tessuto. Questo protocollo consente ai ricercatori di misurare dimensioni, concentrazioni e carico molecolare di vescicole extracellulari provenienti da muscoli e midollo osseo.
Ricerche future potranno estendere questo protocollo ai modelli di malattie e utilizzare le vescicole isolate per identificare biomarcatori e bersagli terapeutici.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un flusso di lavoro riproducibile per l'isolamento di microvescicole extracellulari (sEVs) da tessuti di muscolo scheletrico (SkM) e midollo osseo (BM) di topo. Il tessuto SkM viene sottoposto a digestione enzimatica, mentre il BM è processato direttamente; successivamente, entrambi i campioni vengono sottoposti a centrifugazione differenziale e cromatografia ad esclusione molecolare (SEC) per ottenere frazioni arricchite in EV. Il metodo consente l'isolamento di sEV ad alta purezza a partire da piccole quantità di tessuto, favorendo analisi molecolari e funzionali successive.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia delle vescicole extracellulari
- Isolamento di vescicole specifiche per tessuto
- Caratterizzazione di nanoparticelle
Sfondo
- Gli sEV mediati comunicazione intercellulare tramite il trasferimento di proteine, lipidi e RNA.
- L'isolamento degli sEV da tessuti solidi come il muscolo scheletrico (SkM) e il midollo osseo (BM) è difficoltoso a causa della bassa resa e della contaminazione.
- I metodi esistenti richiedono spesso grandi quantità di tessuto e mancano di riproducibilità.
- La cromatografia a esclusione dimensionale (SEC) è efficace per separare gli EV dai contaminanti in base alla dimensione.
- La validazione della purezza degli EV richiede l'uso di molteplici tecniche ortogonali.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo affidabile per l'isolamento di sEV da SkM e MO di topo.
- Minimizzare i requisiti di quantità di tessuto ottimizzando resa e purezza.
- Fornire un protocollo standardizzato che utilizzi centrifugazione differenziale e SEC.
- Permettere analisi molecolari e funzionali a valle degli sEV derivati da tessuto.
- Sostenere la ricerca sulla comunicazione intercellulare nei sistemi muscoloscheletrico ed ematopoietico.
Metodi Utilizzati
- Digestione enzimatica del tessuto muscolare scheletrico.
- Elaborazione diretta del midollo osseo senza trattamento enzimatico.
- Centrifugazione differenziale per rimuovere cellule e detriti.
- Cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC) per l'arricchimento di EV.
- Scarto dei volumi di esclusione (SkM: ~2,5 mL; BM: 700 µL) seguito dalla raccolta delle frazioni arricchite in EV.
- Suddivisione in aliquote sequenziali (SkM: F1–F4; BM: F1–F5).
- Microscopia elettronica a trasmissione (TEM) per la valutazione della morfologia.
- Analisi del tracciamento di nanoparticelle (NTA) per dimensione e concentrazione.
- Western blotting per marcatori canonici di EV (ad es., tetraspanine).
- Rilevamento interferometrico a singola particella (SPID) per la quantificazione di sottopopolazioni definite da tetraspanine.
Risultati principali
- sEV isolati da ~500 µL di quadricipite e da ~150 µL di MO di femore/tibia in pool.
- Resa di ~10⁸ particelle·mL⁻¹·mg⁻¹ di tessuto.
- Diametro delle particelle prevalentemente <200 nm.
- Le frazioni arricchite in EV sono state validate mediante microscopia elettronica a trasmissione, analisi della tracciatura nanoparticellare e immunoblotting.
- La SPID ha permesso la quantificazione di sottopopolazioni di sEV positive per le tetraspanine.
- Il metodo consente di ottenere sEV ad alta purezza, adatti per analisi omiche e saggi funzionali successivi.
Conclusioni
- Il protocollo consente l'isolamento riproducibile di sEV ad alta purezza da tessuti strutturalmente complessi.
- Sono sufficienti volumi minimi di tessuto in ingresso per ottenere rese robuste di EV.
- L'uso combinato di centrifugazione differenziale e SEC riduce le contaminazioni.
- Una validazione ortogonale conferma l'integrità e la purezza delle vescicole.
- Questo approccio supporta studi avanzati sulle funzioni specifiche dei sEV nei tessuti in condizioni fisiologiche e patologiche.
Domande Frequenti
Rilevanza Industriale Direttiva
L'isolamento di piccole vescicole extracellulari (sEV) da tessuti solidi come il muscolo scheletrico e il midollo osseo rappresenta ancora oggi un collo di bottiglia nella scoperta di biomarcatori e negli studi meccanicistici, a causa della bassa resa e della contaminazione. Questo protocollo consente un isolamento riproducibile e ad alta purezza di sEV a partire da piccole quantità di tessuto, supportando la validazione degli bersagli e lo screening fenotipico nei modelli di malattie muscoloscheletriche ed ematopoietiche. Riducendo il rumore biologico e migliorando la purezza delle vescicole, il metodo aumenta l'affidabilità predittiva nei successivi saggi omici e funzionali.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi di vie di comunicazione intercellulare specifiche per tessuto, mediate dal trasferimento di proteine, lipidi e RNA tramite sEV.
- Valore operativo: Fornisce un flusso di lavoro riproducibile per l'isolamento di sEV da muscolo scheletrico e midollo osseo murino mediante centrifugazione differenziale e cromatografia di esclusione dimensionale.
- Valore scientifico: Supporta la riduzione del rischio biologico mediante la validazione dell'arricchimento di EV attraverso metodi ortogonali, inclusi TEM, NTA, immunoblotting e rilevamento interferometrico di singole particelle.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Produce frazioni arricchite in EV con diametro delle particelle prevalentemente inferiore a 200 nm e rese di circa 10⁸ particelle·mL⁻¹·mg⁻¹ di tessuto, consentendo un apporto costante per campagne di screening.
- Valore operativo: Standardizza l'isolamento degli sEV mediante lo smaltimento del volume morto definito e una frazionamento sequenziale (SkM: F1–F4; BM: F1–F5), migliorando la riproducibilità dei saggi tra diversi laboratori.
- Valore scientifico: Permette la preparazione di sistemi biologici validati per analisi molecolari successive, come proteomica e profilazione dell'RNA di vescicole derivate da tessuto.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Supporta sistemi rilevanti per le malattie consentendo l'isolamento di sEV da muscolo scheletrico e midollo osseo, tessuti centrali nella fisiopatologia muscoloscheletrica ed ematopoietica.
- Valore operativo: Richiede quantità minime di materiale iniziale (~500 µL di quadricipite, ~150 µL di midollo osseo pooled da femore/tibia), permettendo l'elaborazione su scala ridotta di campioni preclinici limitati.
- Valore scientifico: Migliora l'allineamento traslazionale dei biomarcatori isolando sottopopolazioni di sEV definite da tetraspanine, quantificabili mediante rilevamento interferometrico a singola particella.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione iniziale della proteina bersaglio fino agli studi meccanicistici preclinici, consentendo l'isolamento affidabile di sEV derivati dai tessuti per la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi biologici.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi isolando sEV che mediano la comunicazione intercellulare nei microambienti del muscolo scheletrico e del midollo osseo.
- Screening: Fornisce frazioni di EV pronte per i saggi, escluse per dimensione e con ridotta contaminazione, migliorando l'affidabilità delle valutazioni delle risposte a composti o stimoli.
- Analisi: Produce dati quantitativi, inclusi la concentrazione di particelle, la distribuzione dimensionale (<200 nm) e le informazioni sulle sottopopolazioni di tetraspanine, per consentire analisi comparative tra diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Collega la scoperta alla continuità preclinica fornendo sEV purificati adatti a saggi funzionali di internalizzazione e di segnalazione in modelli di malattia.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma standardizzata e riutilizzabile di isolamento applicabile a programmi di ricerca muscoloscheletrica ed ematopoietica.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta l'affidabilità predittiva riducendo l'ambiguità meccanicistica grazie all'isolamento di sEV ad alta purezza, convalidato da multiple tecniche ortogonali.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione e la riproducibilità mediante protocolli definiti di frazionamento tramite SEC e smaltimento del volume vuoto.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione (go/no-go) consentendo una valutazione affidabile del carico di vescicole specifico per tessuto nelle fasi iniziali della scoperta.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione basata sulla gestione del rischio fornendo input di sEV costanti per studi di convalida di biomarcatori e target.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione dei tessuti, nella digestione enzimatica (per il tessuto muscolare scheletrico) e nelle tecniche di centrifugazione.
- È subordinato all'accesso a colonne di cromatografia ad esclusione dimensionale, analisi del tracciamento delle nanoparticelle e infrastrutture per il Western blotting.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per i criteri di raccolta e raggruppamento delle frazioni, basata sull'arricchimento dei marcatori degli EV.
- Richiede considerazioni di adattamento quando applicato ad altri tessuti solidi, a causa delle differenze nella densità della matrice extracellulare e nella cellularità.
- Limite pratico: la resa assoluta ridotta ottenuta da piccoli quantitativi di tessuto richiede metodi di rilevamento sensibili a valle per le applicazioni omiche.
