Un metodo ottimizzato per isolare l'epitelio uretrale femmina di topo per analisi unicellulare e immunofluorescenza

Il nostro gruppo è interessato a studiare la modellazione epiteliale nel tratto geniturinario. Questo protocollo rappresenta un metodo ottimizzato per isolare il rivestimento epiteliale dell'uretra femminile del topo per l'analisi molecolare e cellulare a valle. I metodi descritti in questo articolo aiuteranno nella ricerca sul rivestimento uretrale femminile e sul suo ruolo nella difesa immunitaria.

Per cominciare, posizionare la femmina di topo soppressa al CD1, tra le 6 e le 12 settimane di età, in posizione supina sul tavolo per la dissezione (dissection). Spruzza etanolo al 70% sull'addome per bagnare i capelli. Usando la pinza, solleva la pelle dell'addome.

Poi, con delle forbici piccole, si fa un'incisione verticale verso la parte inferiore del corpo, terminando all'apertura uretrale esterna. Identifica la vescica e sollevala delicatamente con una pinza, assicurandoti che sia vuota e priva di urina. Con le forbici, taglia il tessuto adiposo e connettivo intorno alla vescica per esporre la struttura a forma di farfalla dove le due ossa pubiche si uniscono nella simfisi pubica.

Osserva l'uretra che scorre sotto la sinfisi pubica. Poi solleva la simfisi pubica con la pinza e aprila con le forbici. Rimuovere i frammenti dell'osso pubico per esporre la sottile uretra che giace sulla superficie ventrale della parete vaginale.

Usando una pinza fine, tira delicatamente la vescica verso l'alto dalla cavità corporea. Fai passare le forbici tra l'uretra e la parete vaginale per separare le vie urinarie da quelle riproduttive. Mantieni una leggera tensione sulla vescica mentre tagli lungo la parte posteriore dell'uretra per separarla dalla parete vaginale.

Continuare a tagliare fino all'apertura uretrale distale per ottenere l'uretra del topo a lunghezza completa, che misura da 1,2 a 1,5 centimetri di lunghezza. Successivamente, separare l'uretra dalla vescica facendo un singolo taglio al collo della vescica. Raccoglie quattro o cinque uretre in una piastra di Petri sterile contenente HBSS fresco privo di calcio e magnesio.

Al microscopio dissezionante, taglia il tessuto adiposo e connettivo intorno all'uretra usando pinze a punte fini e forbici. Poi, con le forbici, taglia ogni uretra in due pezzi di uguale dimensione. Posiziona i pezzi di tessuto sopra un colino a rete di nylon da 100 micron.

Lavare i pezzi di tessuto con un millilitro di HBSS, poi trasferirli in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri contenente un millilitro di tripsina all'1% preparato in HBSS integrato con antibiotici e antimicotici. Successivamente, incubare il campione su un rotatore a 30 giri al minuto e a quattro gradi Celsius per 15-30 minuti. Dopo la digestione, aggiungere 10 millimolari di cloruro di magnesio preparato in HBSS al tube, seguiti da 10 microgrammi per millilitro di DNAsi preparato in PBS.

Incubare il tubo per 15-30 minuti su un rotatore posizionato all'interno di un forno ibrido a 37 gradi Celsius. Per stingere la tripsina, trasferire i tessuti uretrali in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri contenente siero di pecora al 10% in HBSS a temperatura ambiente. Dopo cinque minuti, trasferire i tessuti uretrali in un nuovo tubo contenente HBSS ghiacciato, e poi in una piastra di Petri sterile contenente HBSS ghiacciato.

Durante la visione del campione al microscopio, tenere un'estremità del pezzo uretrale con una pinza. Utilizzando un'altra coppia di pinze, passa lungo tutta la lunghezza del pezzo uretrale per estruscere il foglio epiteliale trasparente. Processare direttamente alcuni dei fogli epiteliali uretrali isolati per l'immunocolorazione dell'intero montaggio, al fine di visualizzare in situ le cellule epiteliali e i macrofagi associati all'epitelio.

Usa una piccola pipetta di plastica per trasferire i pezzi epiteliali in una goccia di HBSS isolata da quattro a cinque uretre di topo concentrate in una piastra di Petri sterile. Usa forbici per triturare l'epitelio in piccoli frammenti. Trasferire i frammenti epiteliali tritati in un tubo microcentrifuga da due millilitri contenente 1,5 millilitri di soluzione digertiva di Accutasi preriscaldata a 37 gradi Celsius.

Incubare il campione su un rotatore a 37 gradi per un'ora. Dopo l'incubazione, trasferire l'intero contenuto in un tubo centrifugo da cinque millilitri contenente due millilitri di tampone di lavaggio composto da 1X PBS e 1% di BSA senza calcio e magnesio. Centrifuga la sospensione a 600 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius usando un rotore a secchio oscillante.

Successivamente, aspira il soprantantante usando un vuoto delicato. Poi usa una pipetta con punta di filtro da un millilitro per risospendere il pellet in un millilitro di tampone di lavaggio. Rompi il pellet pipettando su e giù finché i grumi diventano più piccoli.

Fai passare la sospensione attraverso ferri da 23,5 e 26,5 gauge, ciascuno collegato a una siringa da un millilitro usando quattro corse per ago. Successivamente, aggiungi un millilitro di tampone di lavaggio per bagnare la superficie di un filtro di pre-separazione da 30 micron posizionato su un tubo da cinque millilitri. Utilizzando la siringa collegata all'ago del calibro 26,5, trasferisci un millilitro della sospensione della cella attraverso il filtro.

Poi lava il tubo con un millilitro di buffer di lavaggio e lo fai passare attraverso il filtro. Svuotare le celle centrifugando a 600 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius utilizzando un rotore oscillante a secchio. Aspira il soprandante.

Risospendi il pellet in 100 microlitri di tampone di lavaggio e aggiungi 100 microlitri di tampone per la lisi dei globuli rossi. Dopo esattamente tre minuti, aggiungi quattro millilitri di tampone di lavaggio e mescola. Prelevare le celle tramite centrifugazione a 600 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius utilizzando un rotore oscillante a secchio.

Rimuovere il surnatante prima di risospendere il pellet in 50-200 microlitri di buffer di lavaggio a seconda della dimensione del pellet. Mescolare un'aliquota di cinque microlitri di cellule con cinque microlitri di blu di tripano e caricare la miscela su un emocitometro per valutare la resa e la vitalità cellulare. Valutare la vitalità cellulare e quantificare popolazioni cellulari distinte utilizzando la citometria a flusso.

Coltivare cellule epiteliali uretrali singole in una matrice di membrana basale e in un mezzo di espansione organoide per generare organoidi epiteliali uretrali tridimensionali. Eseguire colorazione con eosina ematossilina e immunocolorazione fluorescente su sezioni organoidi incorporate per visualizzare la struttura organoide e la composizione cellulare. Le guaine epiteliali uretrali isolate avevano una trasparenza maggiore rispetto al tessuto stromale dopo la separazione.

L'immunocolorazione completa delle guaine epiteliali ha mostrato una forte marcatura con l'anticorpo E-cadherin CDH1. Etichettando i fogli con l'anticorpo contro F480 si è mostrato che i macrofagi formavano strutture dendritiche ramificate tra le cellule epiteliali dell'uretra. Le singole cellule isolate dall'epitelio uretrale hanno mostrato una vitalità costantemente elevata tramite esclusione di blu di tripano su un emocitometro e citometria di flusso utilizzando il Ghost Dye reattivo ad amine V 450.

Le cellule isolate contenevano una popolazione epiteliale arricchita dopo il passaggio delle cellule vive. Circa l'1,3% delle cellule immunitarie CD45 positive e l'1,18% dei macrofagi sono stati osservati nelle sospensioni monocellulari. Le singole cellule epiteliali isolate dall'uretra sono rimaste vitali e hanno formato organoidi in una matrice tridimensionale con la crescita organoide osservata fino al sesto giorno in coltura.

La colorazione con eosina di ematossilina ha mostrato due morfologie distinte degli organoidi epiteliali uretrali, inclusi grandi organoidi cavi e organoidi solidi più piccoli. Sia gli organoidi epiteliali uretrali cavi che quelli solidi erano stratificati ed espressi in KRT5 e P63 nello strato basale. Esprimevano KRT-13 negli strati cellulari soprabasale e intermedi.

Gli organoidi generati dall'uretra prossimale mostravano una proporzione maggiore di organoidi cavi, mentre gli organoidi provenienti dall'uretra distale formavano sfere più solide. Questo protocollo consente ai ricercatori di studiare i tipi di cellule uretrali e la capacità auto-rinnovabile delle cellule epiteliali dall'uretra prossimale e distale. Una delle considerazioni più importanti di questo protocollo è la dissezione attenta dell'uretra a tutta lunghezza e la digestione enzimatica ottimale per ottenere cellule epiteliali uretrali vitali per l'analisi a valle.

Le cellule epiteliali prodotte da questo protocollo possono essere utilizzate per molteplici applicazioni, tra cui sequenziamento dell'RNA a singola cellula, sequenziamento di RNA di massa, citometria a flusso, immunocolorazione e coltura di organoidi.