Un modello completo di ratti per la valutazione delle vie di trasporto epatico attraverso campionamenti simultanei di linfatica e vascolo sanguigna
15 maggio 2026
Questo protocollo sperimentale descrive un modello di ratto canulato con canulazione dei dotti linfatici epatici che consente una valutazione diretta e quantitativa del drenaggio linfatico e vascolare epatico. Il modello consente il campionamento simultaneo di sangue linfatico epatico e sistemico per indagare il trasporto epatico, il metabolismo e la segnalazione immunitaria, supportando studi sulla farmacocinetica dei farmaci e sulla biologia specifica del fegato.
Il nostro laboratorio studia il ruolo del sistema linfatico nelle malattie infiammatorie e cardiometaboliche e sviluppa strategie di somministrazione di farmaci per colpire i linfatici e trattare queste malattie. Questo protocollo consente la valutazione dei processi epatici, inclusi il metabolismo dei farmaci, il flusso di nutrienti, la segnalazione immunitaria e la risposta epatica in condizioni diverse. Per cominciare, posizionare un maschio di ratto di Sprague-Dawley anestetizzato del peso di circa 250-300 grammi, che è stato cannulato con successo tramite l'arteria carotide e la vena giugulare, in posizione giacente dorsale sotto un microscopio chirurgico.
Effettuare un'incisione cutanea orizzontale di 4-5 centimetri dalla linea mediana al fianco destro, circa 1,5-2 centimetri sotto la gabbia toracica. Ritrai la pelle e fai incisioni corrispondenti nei muscoli obliqui esterni e interni. Cauterizzare o legare qualsiasi vaso sanguigno grande riscontrato durante la procedura.
Usa cotton fioc inumiditi con soluzione salina per spostare il fegato verso il diaframma, lo stomaco a sinistra e l'intestino tenue verso il basso. Mantieni gli organi ritratti con garze imbevbite di soluzione salina. Identificare il dotto linfatico epatico parallelo e leggermente caudale all'arteria epatica, mediale al rene destro e adiacente alla vena cava inferiore.
Utilizzare il dotto linfatico mesenterico più grande opaco o bianco come punto di riferimento anatomico per identificare il dotto linfatico epatico, traslucido e stretto, situato caudalmente. Usa le pinze Graefe pure per rimuovere il tessuto connettivo che sovrasta il dotto linfatico e la vena cava. Inserisci la pinza attraverso il letto adiposo sotto il rene destro per creare un tunnel sotto la vena cava.
Avanza la pinza finché le punte non emergono parallele al dotto linfatico epatico sul lato opposto della vena cava. Usa la pinza per afferrare l'estremità esterna della cannula pre-preparata e tira la cannula attraverso il tunnel finché la punta non emerge dal lato opposto. Usa le pinze Halsted Mosquito Hemostat per piegare la punta di un ago calibro 25 a circa 90 gradi.
Utilizzando l'ago piegato, perforare con attenzione il dotto linfatico epatico sul lato destro più vicino all'operatore. Controlla la cannula già riempita con soluzione anticoagulante e rimuovi le bolle d'aria, se ce ne sono. Inserire l'estremità smussata di circa 2 millimetri nel condotto.
Confermare il flusso linfatico all'estremità esterna della cannula a circa 100 microlitri all'ora. Regolare o reinserire la cannula se non si osserva alcun flusso. Tappa la cannula all'estremità di raccolta e poi applica una piccola goccia di adesivo veterinario per fissare il sito di inserimento.
Una volta che l'adesivo è asciutto, conferma il flusso linfatico attraverso il tubo. Successivamente, rimuovere la garza e riportare gli organi nelle loro posizioni originali. Posiziona il tubo di raccolta contenente la soluzione anticoagulante sotto l'uscita della cannula e verifica che la linfa scorra gocce nel tubo.
Poi chiudi la parete addominale suturando in sequenza gli strati obliquo interno, obliquo esterno e cutaneo. Immediatamente dopo la canulazione linfatica epatica, iniziare la reidratazione infondendo soluzione salina sterile a 1,5-3,0 millilitri all'ora attraverso la cannula della vena giugulare. Monitora la respirazione e i riflessi mantenendo l'anestesia tramite un cono nasale.
Dopo la somministrazione terapeutica tramite la cannula della vena giugulare, raccogliere continuamente la linfa epatica in tubi contenenti soluzione anticoagulante. Sostituisci i tubi di raccolta ogni ora o secondo necessità. Prelevare campioni di sangue dell'arteria carotide in momenti temporali designati, mantenendo il volume totale sotto il 10% del volume sanguigno circolante stimato prima del campionamento terminale.
Riaprire l'incisione addominale per esporre la cavità superiore dell'addome, mantenendo l'anestesia profonda e la respirazione stabile. Usa garze inumidite con soluzione salina per ritrarre delicatamente il fegato verso il diaframma, lo stomaco a sinistra e l'intestino tenue verso il basso. Identificare l'arteria epatica che corre parallela al dotto linfatico epatico situato adiacente al dotto linfatico mesenterico.
Ottenere una cannula in polivinile con un diametro esterno di 0,61 millimetri e un diametro interno di 0,28 millimetri pre-riempito con una soluzione anticoagulante e rimuovere eventuali bolle d'aria. Utilizzando una pinza curva dell'iride, isola un breve segmento dell'arteria epatica. Posiziona una sutura di seta 4-0 sotto l'arteria.
Solleva delicatamente l'arteria e posiziona una seconda sutura distale rispetto alla prima. Legare la sutura distale per controllare il riflusso lasciando la sutura prossimale non legata per una chiusura successiva. Utilizzando microforbici a punta fine, eseguire una piccola incisione trasversale di circa 0,5 millimetri nella parete arteriologica tra le suture.
Usa la punta della pinza Dumont per sollevare il lembo del vaso e stabilizzare il lumen del vaso per l'inserimento della cannula. Inserisci l'estremità smussata della cannula in polivinile nell'apertura e avanza la cannula di circa 2-3 millimetri. Fissa la cannula legando la sutura prossimale sia attorno al vaso che alla canula.
Conferma la corretta posizione aspirando delicatamente una piccola quantità di sangue arterioso rosso brillante. Raccogliere 0,5-1 millilitro di sangue in un tubo pre-etichettato contenente anticoagulante. Il recupero linfatico di terapie macromolecolari somministrate per via endovenosa nelle linfe toracica, epatica e mesenterica dimostra l'utilità del modello nella valutazione del trasporto linfatico.
La linfa epatica ha un contenuto lipidico totale marcatamente inferiore rispetto a quella toracica e mesenterica, mentre la sua concentrazione proteica è paragonabile a quella delle altre fonti linfatose. Questo protocollo consente misurazioni simultanee della linfa e del sangue epatico per valutare il trasporto, il metabolismo e la liberazione delle molecole, inclusi farmaci, nutrienti e segnali. La cannulazione precisa del dotto linfatico epatico è tecnicamente complessa e richiede un'attenta identificazione anatomica e una tecnica chirurgica.
Studi futuri potranno utilizzare questa tecnica per mappare il trasporto, la pulizia e il metabolismo epatico, migliorando la comprensione delle malattie epatiche e delle terapie mirate.
Panoramica
Il fegato svolge un ruolo centrale come sede metabolica e immunologica, elaborando nutrienti, xenobiotici e mediatori immunitari trasportati attraverso la vena porta e l'arteria epatica. Le sostanze entrano negli epatociti e nelle altre cellule epatiche attraverso capillari sinusoidali, con il filtrato plasmatico che drena nello spazio di Disse per essere trasformato metabolicamente, sottoposto a sorveglianza immunitaria o drenato linfaticamente come linfa epatica. Questo articolo descrive un modello chirurgico su ratto che consente il campionamento simultaneo della linfa epatica in uscita e del sangue sistemico mediante cannulazione del dotto linfatico epatico, dell'arteria carotide e della vena giugulare. Il modello permette un campionamento continuo di linfa epatica e sangue arterioso, con accesso alla vena giugulare per l'idratazione o il prelievo di sangue venoso, consentendo il confronto tra sangue arterioso e venoso. I flussi di linfa epatica di circa 0,1 mL/h in ratti anestetizzati permettono fino a 8 ore di campionamento continuo della linfa mentre vengono contemporaneamente prelevati campioni di sangue arterioso e venoso. Il campionamento terminale dell'arteria epatica e della vena porta al termine della procedura consente un confronto diretto tra afflusso epatico, efflusso e drenaggio linfatico. Questa piattaforma versatile facilita la valutazione di processi epatici come la farmacocinetica dei farmaci, il flusso e il metabolismo dei nutrienti e le risposte specifiche del fegato in diverse condizioni fisiopatologiche.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Epatologia
- Fisiologia
- Farmacocinetica
Sfondo
- Il fegato riceve un doppio apporto ematico dalla vena porta (sangue intestinale ricco di nutrienti) e dall'arteria epatica (sangue sistemico ossigenato).
- I capillari sinusoidali permettono lo scambio tra sangue ed epatociti, con il filtrato plasmatico che entra nello spazio di Disse.
- La linfa epatica trasporta sostanze metabolicamente modificate e fattori immunitari, rispecchiando la funzione epatica.
- Il campionamento simultaneo di sangue e linfa consente l'analisi dell'assorbimento epatico, del metabolismo e della secrezione.
Scopo dello studio
- Sviluppare un modello chirurgico su ratto per il campionamento continuo e simultaneo di linfa epatica, sangue arterioso e sangue venoso.
- Permettere un confronto diretto tra affluente epatico (vena porta, arteria epatica), effluente (vene epatiche) e drenaggio linfatico.
- Sostenere un'analisi completa del trasporto epatico, dei processi metabolici e della segnalazione immunitaria.
- Fornire una piattaforma per lo studio della farmacocinetica dei farmaci, del flusso di nutrienti e delle risposte specifiche del fegato in condizioni fisiologiche e patologiche.
Metodi Utilizzati
- Canulazione chirurgica del dotto linfatico epatico per il prelievo continuo dell’efflusso linfatico.
- Canulazione dell’arteria carotidea per il prelievo continuo di sangue arterioso.
- Canulazione della vena giugulare per idratazione, supporto di fluidi o raccolta di sangue venoso.
- Prelievo terminale dell’arteria epatica e della vena porta al termine dell’esperimento per valutare l’afflusso epatico.
- Misurazione della velocità di flusso linfatico epatico (~0,1 mL/h) in ratti anestetizzati per validare la funzionalità del modello.
Risultati principali
- Una cannulazione riuscita ha prodotto un flusso linfatico epatico stabile di circa 0,1 mL/h in ratti anestetizzati.
- Il campionamento continuo della linfa epatica è stato mantenuto fino a 8 ore, contemporaneamente al prelievo di sangue arterioso e venoso.
- Il modello ha permesso un confronto diretto tra sangue arterioso (input sistemico) e deflusso linfatico epatico (output processato a livello epatico).
- Il campionamento terminale dell'arteria epatica e della vena porta ha consentito la valutazione dell'afflusso di nutrienti e farmaci al fegato.
- Ha facilitato l'analisi della clearance epatica, della trasformazione metabolica e del trattamento dei mediatori immunitari.
Conclusioni
- Il modello ratto con triplice canulazione fornisce un sistema robusto per il campionamento simultaneo di linfa epatica, sangue arterioso e venoso.
- Permette un confronto diretto tra afflusso epatico, efflusso e drenaggio linfatico in condizioni controllate.
- Il modello è adatto allo studio del trasporto epatico, del metabolismo, della funzione immunitaria e della farmacocinetica.
- Le applicazioni includono la valutazione della distribuzione dei farmaci, del flusso di nutrienti e delle risposte epatiche in condizioni fisiologiche e patofisiologiche.
- Questo approccio migliora la comprensione meccanicistica della funzione epatica integrando il campionamento vascolare e linfatico.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il campionamento simultaneo di linfa epatica e sangue in un modello ratto consente una valutazione diretta e quantitativa dei processi epatici di trasporto, eliminazione e metabolismo, fondamentali per la scoperta di farmaci e la ricerca traslazionale. Questa piattaforma aumenta l'affidabilità predittiva sulla distribuzione epatica, supportando la riduzione del rischio meccanicistica e la validazione degli obiettivi in punti critici del percorso biofarmaceutico. La capacità del modello di confrontare i compartimenti arterioso, venoso e linfatico fornisce informazioni a livello aziendale sulle risposte specifiche del fegato e sulla farmacocinetica.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi meccanicistica delle vie di captazione epatica, metabolismo e clearance.
- Supporta la validazione funzionale dei trasportatori epatici e delle proteine metaboliche bersaglio.
- Facilita la riduzione del rischio biologico distinguendo i contributi vascolare e linfatico alla distribuzione del composto.
- Migliora l'affidabilità predittiva riguardo alle criticità epatiche nei portafogli di fase iniziale.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce campioni biologici validati per saggi quantitativi successivi di metaboliti, citochine e xenobiotici.
- Permette la standardizzazione dei saggi consentendo il confronto diretto tra compartimenti arteriosi, venosi e linfatici.
- Supporta flussi di lavoro riproducibili e scalabili per la valutazione di composti in contesti epatici.
- Prepara set di campioni robusti per lo screening ad alto contenuto e la scoperta di biomarcatori.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea i modelli preclinici alla fisiologia epatica umana integrando il campionamento vascolare e linfatico.
- Permette l'identificazione di biomarcatori traslazionali attraverso analisi specifiche per compartimento.
- Supporta decisioni di avanzamento proporzionate al rischio fornendo dati completi sul destino epatico.
- Facilita la continuità dalla scoperta alla validazione preclinica di terapie mirate al fegato.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo modello collega la fase iniziale della scoperta, l'identificazione dei composti promettenti e la ricerca preclinica, consentendo un'analisi diretta e quantitativa del trasporto epatico e del metabolismo attraverso compartimenti vascolari e linfatici.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi relativi ai meccanismi di trasporto epatico e di eliminazione.
- Screening: Fornisce risultati quantitativi riproducibili per lo sviluppo di saggi e la selezione di composti.
- Analisi: Offre misurazioni multicompartimentali per confrontare flusso in entrata, flusso in uscita e drenaggio linfatico.
- Ricerca traslazionale: Allinea i risultati preclinici con i processi epatici e i profili di biomarcatori rilevanti per l'uomo.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per diversi studi epatici, dalla farmacocinetica ai segnali immunitari.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica negli studi sul destino epatico.
- Valore operativo: Standardizza il campionamento e l'analisi tra compartimenti vascolari e linfatici per garantire riproducibilità.
- Valore strategico: Permette decisioni più accurate di avanzamento o interruzione e una maggiore efficienza del capitale chiarificando precocemente i rischi epatici.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce la priorizzazione e lo sviluppo di asset mirati al fegato, adeguati al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze chirurgiche per una cannullazione precisa e il prelievo dei campioni.
- Necessita di un'infrastruttura analitica per la misurazione quantitativa di metaboliti e molecole di segnalazione.
- Richiede una standardizzazione tra i gruppi di lavoro per la gestione dei campioni e l'integrazione dei dati.
- Adattabile a diversi modelli di malattia e condizioni sperimentali, come supportato dal protocollo.
- Il volume e la durata del campionamento sono limitati dalle velocità del flusso linfatico e dalla fisiologia animale.
