Un metodo integrato per la modellazione fototrombotica dell'ictus e la registrazione in vivo dell'attività neuronale e astrocita in topi in comportamento

La nostra ricerca sviluppa un metodo integrato per registrare simultaneamente l'attività degli astrociti e dei neuroni durante un ictus ischemico in topi coscienti. I metodi precedenti registravano separatamente i neuroni o gli astrociti. Il nostro protocollo consente di acquisire i segnali di astrociti e neuroni contemporaneamente fin dai primi istanti dell'insorgenza dell'ictus.

Per iniziare, trasferire un topo C57BL/6J profondamente anestetizzato nel telaio stereotassico dotato di maschera per anestesia. Monitorare la profondità dell'anestesia ogni 10 minuti, mantenendo la temperatura corporea del topo tra 36 e 37,5 gradi Celsius mediante un tappetino riscaldato con controllo a retroazione. Fissare il topo al telaio stereotassico utilizzando barre auricolari e una barra mandibolare dopo aver applicato un unguento oftalmico agli occhi.

Verificare l'immobilizzazione della testa mediante un'esplorazione delicata una volta che la testa è stata fissata simmetricamente. Dopo la depilazione e la preparazione asettica della cute, utilizzare forbici chirurgiche per praticare un'incisione mediana. Pulire il periostio con soluzione fisiologica e bastoncini di cotone per esporre il bregma e il lambda.

Abbassare la micropipetta di vetro fino a toccare in successione bregma e lambda. Dopo aver annotato la coordinata Z sul nonio digitale, regolare la barra della bocca finché la differenza sia inferiore a 0,04 millimetri. Abbassare nuovamente la micropipetta di vetro fino a toccare bregma e reimpostare il nonio digitale a zero.

Spostare la micropipetta di 2,3 millimetri a sinistra e a destra del bregma in successione. Dopo aver annotato la coordinata Z, regolare le barre auricolari fino a quando le differenze bilaterali siano inferiori a 0,04 millimetri. Dopo aver riposizionato a zero il nonio digitale sul bregma, segnare l'area della corteccia motoria dell'arto anteriore a 1,5 millimetri in direzione antero-posteriore e a 0,74 millimetri in direzione mediale-laterale.

Utilizzare un microtrapano e punte rotonde da 0,5 millimetri per praticare un piccolo foro, di circa 0,5 millimetri di diametro, nel punto segnato. Prima del caricamento, mescolare i due vettori virali adeno-associati in volumi uguali e centrifugare brevemente il campione. Abbassare la micropipetta di vetro collegata alla pompa di microinfusione fino al sito bersaglio a una profondità dorso-ventrale di -0,94 millimetri rispetto alla superficie del cervello.

Infondere 400 nanolitri della miscela virale contenente 200 nanolitri di ciascun vettore a una velocità di 50 nanolitri al minuto. Ritirare lentamente la pipetta 10 minuti dopo il completamento dell'infusione. Suturare il cuoio capelluto con un punto di sutura 4-0 da 20 millimetri, arco di 3/8 di cerchio, e posizionare il topo su un tappetino riscaldante fino al completo recupero.

Tre a quattro settimane dopo l'iniezione virale, seguire la procedura precedentemente descritta fino all'incisione del cuoio capelluto. Durante l'incisione, rimuovere un'area di cuoio capelluto di 1,5 centimetri per 1,5 centimetri, mantenendo un quantitativo sufficiente di cute intorno agli occhi. Pulire il cranio con perossido di idrogeno e soluzione salina allo 0,9%.

Dopo aver identificato il bregma, reimpostare il nonio digitale a zero. Utilizzare una punta rotonda da 0,8 millimetri per leggermente smerigliare la superficie del cranio. Contrassegnare l'area della corteccia motoria dell'arto anteriore.

All'asse antero-posteriore, 1,5 millimetri e all'asse mediale-laterale, 0,74 millimetri. Utilizzare il segno come punto centrale per disegnare un quadrato di cinque millimetri per cinque millimetri. Usare un microtrapano a circa 10.000 giri al minuto per tracciare il quadrato.

Applicare continuamente soluzione salina ghiacciata lungo il percorso di trapanazione e interrompere immediatamente se il lembo osseo si allenta. Praticare tre piccoli fori di diametro di 0,5 millimetri sull'emisfero controlaterale e sul cervelletto. Implantare viti craniose nei fori.

Assicurarsi che ogni vite raggiunga la dura madre senza penetrare ulteriormente, per evitare danni al tessuto cerebrale. Utilizzare pinze per rimuovere il lembo osseo allentato. Usare pinze ultrafini con una punta ultrafine di dimensioni inferiori a 0,03 millimetri per 0,01 millimetri per rimuovere la dura madre nella finestra cranica, evitando il contatto diretto con il tessuto cerebrale.

Fissare l'optrodo al braccio del micromanipolatore del telaio stereotassico e posizionarlo sopra la finestra cranica. Intrecciare saldamente i fili argentati di massa e di riferimento dell'optro ai tre viti di cranoplastica. Pulire la superficie della finestra cranica con soluzione fisiologica sterile.

Abbassare lentamente l'optro alla profondità dorso-ventrale desiderata di meno 0,94 millimetri, a un millimetro ogni 10 secondi. Applicare uno strato di agarosio sulla finestra cranica dopo l'innesto. Applicare tre o quattro strati di cemento dentale.

Dopo la solidificazione del cemento dentale, somministrare analgesia per tre-cinque giorni e permettere al topo di riprendersi per una-due settimane. Utilizzare un sistema di fotometria con fibra a doppia o tripla lunghezza d'onda per eccitare GCaMP6s. Impostare il canale del segnale a 470 nanometri e il canale di controllo a 410 nanometri.

Regolare la frequenza di campionamento a 60 fotogrammi al secondo. A questo punto, collegare correttamente a terra tutti i componenti del sistema di registrazione. Utilizzare un riferimento mediano comune durante la registrazione.

Verificare che nel software di registrazione siano selezionati i segnali a banda larga e i potenziali di campo locali, monitorando continuamente la presenza di rumore durante tutta la sessione di registrazione. Dopo aver anestetizzato brevemente il topo, collegare l'optro alla linea di registrazione tramite un adattatore. Posizionare il topo in un ambiente simile alla gabbia di casa per la registrazione.

Consentire 10 minuti di acclimatazione dopo il risveglio. Registrare il topo mentre esegue il test di forza della presa, richiedendo un singolo strappo al minuto per cinque minuti. Contrassegnare temporalmente con precisione i test comportamentali sia nei sistemi multicanale che in quelli di fotometria con fibra.

Somministrare una soluzione di colorante al 1,5% di Rosa Bengala per via intraperitoneale a una dose di 10-20 milligrammi per chilogrammo e attendere cinque minuti. Collegare la sonda optroda alla sorgente laser una volta raggiunta e mantenuta l’anestesia profonda. Applicare un fascio laser di 530 nanometri a 15 milliwatt attraverso l’optroda impiantata per un periodo di cinque-otto minuti per indurre ischemia focale.

Per eseguire la stimolazione optogenetica, collegare lo stimolatore laser all'optrodo. Accendere lo stimolatore laser optogenetico a 488 nanometri e impostarlo a 10 milliwatt per cinque minuti per Opto-vTrap. Infine, posizionare il topo su un tappetino riscaldato per il recupero.

Rispetto al valore basale, il flusso ematico cerebrale è diminuito dopo la fototrombosi ed è rimasto soppresso a un giorno e a sette giorni dall'ictus. La forza di presa degli arti anteriori ha mostrato un calo altamente significativo a un giorno ed è rimasta soppressa a sette giorni dall'ictus. I transitori del calcio negli astrociti registrati mediante fotometria con fibra ottica e gli impulsi neuronali ottenuti mediante elettrofisiologia sono stati allineati in base ai timestamp.

Dopo un ictus fototrombotico, le frequenze di scarica sono risultate significativamente ridotte sia nei neuroni piramidali che nei neuroni interneuroni, rispetto alla frequenza di scarica basale osservata durante il compito di presa con l'arto anteriore. A livello basale, i transitori calcici negli astrociti raggiungevano il picco entro quattro-sei secondi dall'inizio del compito. Tuttavia, l'ampiezza risultava significativamente ridotta dopo l'ictus fototrombotico, a indicare un'attività calcica indebolita.

I grafici raster e gli istogrammi peri-stimolo nel tempo hanno mostrato variazioni nell'attività neuronale durante la stimolazione ottica. Sia la frequenza di scarica dei neuroni piramidali che quella degli interneuroni hanno mostrato una diminuzione significativa dopo la stimolazione ottica rispetto alla baseline pre-stimolo, confermando che la modulazione degli astrociti ha un effetto misurabile a valle sull'eccitabilità del circuito locale. Questo protocollo permette la registrazione ininterrotta dell'esercizio e dell'attività neuroelettrica lungo tutta la linea temporale antecedente l'ictus, dalla fase acuta fino a quella cronica.

Il successo di questo protocollo dipende da un allineamento preciso o coordinato. L'impianto ottogenetico monolaterale e un'espressione virale sufficiente richiedono tempi appropriati durante gli interventi chirurgici. Studi futuri potrebbero utilizzare impianti multipli per monitorare aree cerebrali più ampie o per indirizzare diversi tipi cellulari mediante svariati test comportamentali.