Un sistema microfluidico per modellare la disfunzione endoteliale sotto stress fisiologico di taglio pulsatile combinato e iperglicemia oscillatoria

Questo studio indaga come l'iperglicemia oscillatoria sincronizzata e lo stress di taglio pulsatile insieme guidino la disfunzione endoteliale nella malattia vascolare diabetica. I modelli esistenti utilizzano un livello iniziale di glucosio elevato o flusso laminare costante. Indagiamo come lo stress di taglio pulsatile contrasti il danno oscillatorio del glucosio.

Per cominciare, utilizza software di progettazione assistita dal computer per progettare la struttura del chip microfluidico. Realizza lo stampo master SU-8 tramite una società commerciale. In una tazza pulita, mescola l'agente polimerico polidimetilsilossano e il prepolimero in un rapporto 10:1 in peso e mescola vigorosamente la miscela a mano per cinque minuti.

Poi si posiziona il contenitore in una camera a vuoto a una pressione di 0,08 megapascal per almeno 15 minuti per rimuovere le bolle d'aria intrappolate durante la miscelazione. Versare il polidimetilsossiano sulla wafer posta in una piastra di vetro di Petri. Degassare il polidimetilsilossano versato sulla wafer in un essiccatore per altri 15 minuti per rimuovere eventuali bolle formate durante la colata.

Metti la piastra di Petri contenente lo stampo e il polimero in forno caldo impostato a 80 gradi Celsius per due ore. Con un bisturi, speggi con cura la lastra polimerica solidificata dallo stampo master. Utilizzando uno strumento per perforare il nucleo, crea porte di ingresso e uscita alle estremità designate dei canali sulla lastra di polimero.

Pulisci il vetrato del coperchio di vetro e la faccia decorata della lastra di polimero con del nastro adesivo. Successivamente, tratta sia la lastra di polimero che il vetrato del coperchio con un detergente al plasma a 65 watt sotto aria ambiente per 60 secondi. Allinea immediatamente la faccia del canale in polimero con il lato trattato del vetrato del coperchio in vetro.

Poi premi delicatamente per creare un canale microfluidico permanentemente chiuso. Metti il microfluidico incollato in una bottiglia di vetro boronizzata riempita di acqua deionizzata. Sterilizza con autoclaving a 121 gradi Celsius e 15 libbre per pollice quadrato per 20 minuti.

Posiziona il chip sterilizzato in una teglia di coltura da 60 millimetri riempita con una miscela equimolare di PBS e DMEM a basso contenuto di glucosio. Poi, usando una siringa da un millilitro, introduci 100 microgrammi per millilitro di fibronectina nel canale e incuba a 37 gradi Celsius per quattro ore. Successivamente, aggiungere 24,5 millimolari di demanistolo al DMEM a basso glucosio per aumentare la pressione osmotica.

Aggiungere cinque millimolari di D-glucosio a DMEM ad alto livello di glucosio per ottenere una concentrazione finale di 30 millimolari di glucosio. Prepara un medium per coltura di glucosio normale e un mezzo per coltura di glucosio alto integrato con 20% di FBS e 1% di penicillina streptomycin. Poi caldo PBS, tripsina, mezzo normale per coltura di glucosio e mezzo per colture ad alto contenuto di glucosio in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius.

Preleva le cellule endoteliali della vena ombelicale umana dal piatto di coltura al 90% di confluenza. Distogliere le celle utilizzando una soluzione al 0,25% di tripsina-EDTA. Dopo aver incubato le cellule a 37 gradi Celsius per 30 secondi, contare le cellule prelevate e risospenderle separatamente in glucosio normale e in substrati ad alto contenuto glucosiano, a una concentrazione di 1 per 10 con la potenza di 6 cellule per millilitro.

Utilizzando una siringa da un millilitro, iniettare 100 microlitri della sospensione cellulare nella porta di ingresso del chip microfluidico con un mezzo glucosio normale per il gruppo di controllo e un mezzo ad alto contenuto di glucosio per il gruppo sperimentale. Posizionare i chip microfluidici in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% per 48 ore. Calcola la portata necessaria per raggiungere la tensione di taglio pulsatile target utilizzando l'equazione presentata.

Collega la sorgente di pressione al controllore di pressione. Poi collega il controllore di pressione al regolatore valvola collegato al computer per il controllo automatico delle forme d'onda di pressione. Riempi due serbatoi da 100 millilitri, uno con un substrato di coltura glucosio normale e l'altro con un substrato di coltura ad alto contenuto di glucosio.

Collega i serbatoi ai canali corrispondenti del regolatore di pressione. Poi collega i serbatoi e la valvola magnetica a tre vie a due posizioni usando tubi in silicone. Imposta la tensione fisiologica di taglio pulsatile target corrispondente a una portata di circa 200 microlitri al minuto.

Programma la pompa d'aria programmabile per generare una funzione d'onda sinusoidale per mantenere la tensione di taglio pulsatile. Successivamente, programmare il controller della valvola per cambiare canale ogni cinque minuti per generare un'oscillazione di glucosio a onda quadrata durante la stimolazione dinamica. Collega la valvola magnetica a due posizioni a tre vie e il chip microfluidico usando tubi in silicone.

Poi avvia il sistema di pompa programmabile per preparare il tubo. Successivamente, utilizzando i connettori in acciaio inox angolati a 90 gradi di diametro da 1,3 millimetri di diametro, collega le porte di ingresso e uscita del chip microfluidico al tubo. Collegare l'uscita del chip microfluidico al serbatoio di scarto, poi riavviare la pompa per fornire una tensione di taglio oscillatoria e pulsatile combinata per un totale di 30 minuti.

Dopo aver effettuato la verifica del campo di flusso, preparare la soluzione di lavoro di calceina AM e iodio di propidio secondo le istruzioni del produttore al punto finale sperimentale. Una volta che il canale è stato risciacquato una volta con PBS, introduci la soluzione lavorativa di calceina AM e iodio di propidio nel canale e incuba a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% per 30 minuti al buio. Cattura immediatamente immagini fluorescenti delle cellule colorate utilizzando un microscopio a fluorescenza invertita dotato di una lente con obiettivo 10 volte.

Cattura immediatamente immagini fluorescenti delle cellule colorate utilizzando un microscopio a fluorescenza invertita dotato di una lente obiettivo 10x. Usa il filtro verde di isotiocianato di fluoresceina per la calcina AM e il filtro rosso tetrametilrodamina o rodamina per il propidio ioduro. Dopo aver lavato il canale tre volte con PBS, introdurre la soluzione fluorescente a stress ossidativo per cellule vive nel canale e incubare come dimostrato in precedenza.

Risciacqua il canale tre volte con PBS per rimuovere la sonda non legata. Cattura immediatamente immagini fluorescenti utilizzando il filtro rosso lontano impostato tramite una lente obiettivo 20x mantenendo parametri di esposizione identici su tutti i gruppi. Apri le immagini acquisite di calceina AM verde e propidio ioduro rosso in ImageJ.

Regola manualmente la soglia per ogni canale per distinguere i segnali fluorescenti da quelli di fondo. Usa il contatore cellulare per quantificare le cellule fluorescenti, regolando la dimensione minima della cellula in base alle osservazioni per determinare il conteggio delle cellule vive e morte su più campi visivi. Calcola la percentuale di cellule vive utilizzando un software di fogli di calcolo per ogni condizione sperimentale.

Poi calcola la media e la deviazione standard su più campi visivi utilizzando software di analisi statistica per confrontare i gruppi. Trascina l'immagine scelta in ImageJ. Seleziona Analizza e seleziona Imposta scala per calibrare la dimensione del pixel utilizzando i metadati del microscopio.

Successivamente rimuovi il segnale uniforme di fondo non specifico dall'intera immagine usando la funzione di sottrazione dello sfondo selezionando Processo e scegliendo Sottrazione di Sfondo. Successivamente, seleziona Immagine e scegli Aggiusta seguito da Soglia per regolare manualmente il cursore della soglia e definire il segnale della specie reattiva intracellulare dell'ossigeno. Imposta le misure selezionando Analizza e scegliendo Imposta Misure per includere Area e Valore grigio medio.

Seleziona Analizza e Analizza Particelle per determinare la dimensione minima della cella in base alle dimensioni della cella osservate e misura l'intensità media del segnale segmentato all'interno del ROI del monostrato cellulare. Riporta il livello di specie reattiva di ossigeno per ogni condizione sperimentale come media dei valori misurati derivati da almeno tre campi di vista selezionati casualmente per chip. Inserisci i risultati quantitativi in un software di analisi dei dati e grafici.

Determinare la significatività statistica confrontando i gruppi sperimentali con il gruppo di controllo utilizzando un'analisi bidirezionale della varianza seguita dal test post-hoc di Tukey con un livello di significatività di 0,05. Usa il software per eseguire l'analisi e genera grafici con barre di errore che rappresentano la deviazione standard. Le immagini di fluorescenza rappresentative hanno mostrato un'alta proporzione di cellule vitali in tutti i gruppi, con una morte cellulare trascurabile osservata nel glucosio normale e nel glucosio normale con gruppi di sforzo di taglio pulsatile, mentre il glucosio oscillatorio e il glucosio oscillatorio con gruppi di sforzo di taglio pulsatile hanno mostrato un aumento visibile delle cellule morte.

L'analisi quantitativa ha mostrato che l'esposizione al glucosio oscillatorio ha comportato una significativa riduzione della vitalità cellulare rispetto al gruppo di controllo, e l'applicazione di stress di taglio pulsatile in condizioni di glucosio oscillatorio ha aumentato significativamente la vitalità rispetto al glucosio oscillatorio da solo. In condizioni normali di glucosio, i livelli intracellulari delle specie reattive di ossigeno erano bassi e ulteriormente ridotti dopo l'applicazione dello stress di taglio. Mentre le condizioni oscillatorie di glucosio causavano un marcato aumento dell'intensità di fluorescenza rossa, indicando specie reattive di ossigeno elevate.

L'aumento oscillatorio indotto dal glucosio nelle specie reattive intracellulari dell'ossigeno è stato ridotto dopo l'applicazione dello stress di taglio. L'analisi quantitativa ha rivelato che lo stress di taglio ha ridotto significativamente i livelli di specie reattive di ossigeno in condizioni normali di glucosio. Al contrario, le condizioni di glucosio oscillatorio hanno portato a un aumento significativo dei livelli di specie reattive di ossigeno rispetto al glucosio normale.

Inoltre, lo stress di taglio ridusse significativamente i livelli delle specie reattive di ossigeno, anche in condizioni di glucosio oscillatorio. Questo protocollo consente di quantificare i livelli ROS e la disponibilità cellulare per studiare la disfunzione endoteliale sotto iperglicemia oscillatoria e la tensione di taglio pulsatile. A seguito di questa procedura, possono essere eseguite analisi molecolari, come la via NRF2 o la segnalazione iNOS, per enucleare i meccanismi di protezione endoteliale.

Studi futuri potrebbero utilizzare questo sistema per esplorare vie meccanobiologiche, includere geometrie di disturbo del flusso o co-coltura delle cellule muscolari lisce.