Caratterizzazione delle sonde di Riboglow In Vitro come base per l'imaging a vita della fluorescenza in cellule di mammiferi vivi e modelli cellulari tridimensionali
4 agosto 2026
L'obiettivo di questo protocollo è consentire la misurazione quantitativa della durata della fluorescenza delle sonde di Riboglow per flussi di lavoro di imaging RNA riproducibili in vitro, in cellule di mammiferi vivi e in modelli cellulari tridimensionali. Descriviamo i flussi di lavoro di preparazione del campione, consegna delle sonde, acquisizione dati e analisi quantitativa per estrarre misurazioni di durata di fluorescenza non polarizzate.
La nostra ricerca si concentra sulla visualizzazione dell'RNA in cellule vive per indagare la dinamica spazio-temporale dell'RNA. La piattaforma Riboglow utilizza l'imaging microscopio quantitativo a tempo di vita della fluorescenza in sistemi multicellulari applicabili a sistemi biologici in salute e malattia. Per iniziare, ottenere i campioni di RNA o le cellule con sonde Riboglow caricate su sfere.
Accendere il sistema di microscopio confocale a scansione laser seguito dall'unità di controllo del microscopio. Accendere il tempo correlato al sistema di imaging a tempo di vita della fluorescenza basato sul conteggio dei fotoni singoli o FLIM, compreso l'unità di combinazione laser, il fotomoltiplicatore rilevatore e il timer degli eventi. Dopo aver aperto il software di acquisizione e analisi delle immagini NIS, nella finestra di configurazione e impostazione, selezionare AX con PicoQuant.
Una volta avviato il software, selezionare AX FLIM e FCS. Per configurare il microscopio per l'acquisizione dei dati di tempo di vita della fluorescenza, confermare che Galvano sia selezionato nella sezione AX pad. Impostare il valore di mediazione su uno e il tempo di sosta a due.
Nella sezione della potenza del laser, abbassare i singoli cursori del laser al 3-4%. Impostare tutti i cursori del laser su uno. Dopo aver selezionato l'obiettivo 20X, nelle impostazioni dell'area di scansione, selezionare 512 per 512 e accendere i rilevatori. Per definire il percorso del file di dati, andare alla parte inferiore della sezione del controller e selezionare configura.
Dopo aver cliccato sulla scheda PicoQuant o FLIM FCS, sotto il percorso del workspace, selezionare il simbolo della cartella a destra. Nel luogo di archiviazione, creare una nuova cartella per gli esperimenti del giorno e chiudere la finestra di configurazione. Una volta selezionato live e apparsa la finestra di acquisizione delle immagini, selezionare nuovamente live per mettere in pausa la raccolta dei fotoni.
Per configurare le finestre di raccolta dei dati dell'imaging a tempo di vita della fluorescenza o FLIM, fare clic con il tasto destro sulla finestra dell'immagine dal vivo e selezionare il plug-in PicoQuant. Abilitare mostra curva di decadimento, mostra traccia temporale e mostra statistiche FLIM. Per configurare la disposizione del laser per l'esperimento cellulare, andare alle impostazioni dell'esperimento nella parte superiore destra della pagina accanto ai laser.
Dopo aver cliccato su aggiungi accanto alla casella del colorante multicanale, aggiungere i coloranti desiderati. Selezionare la modalità esperto. Regolare le assegnazioni del rilevatore per ogni spettro di emissione.
Indirizzare gli spettri di eccitazione ed emissione sovrapposti a diversi rilevatori. Nel pannello di sinistra, regolare l'ordine di passaggio per minimizzare l'interferenza tra coloranti con spettri di eccitazione ed emissione sovrapposti. Dopo aver salvato e nominato la nuova configurazione del laser, selezionare la configurazione salvata per l'esperimento.
Fare clic con il tasto destro sulla finestra di acquisizione dal vivo. Scegliere controlli di acquisizione, quindi selezionare panoramica XYZ. Prima di caricare la piastra di coltura cellulare di imaging per FLIM, aggiungere il colorante nucleare delle cellule vive e mescolarlo accuratamente ruotando delicatamente sulla banca e lasciarlo da parte per 30 secondi.
Posizionare la piastra di imaging sul palco del microscopio. Spingere la piastra verso l'angolo in basso a sinistra del palco del microscopio. Fissare il campione allo stadio quando si utilizzano obiettivi non-aria per prevenire lo slittamento XY.
Passare al canale 4'6-Diamidino-2-fenilindolo o DAPI. Utilizzare la manopola del controller fino a quando il nucleo cellulare si mette a fuoco. Se necessario, regolare la sensibilità della manopola dell'altezza Z e, se le cellule non appaiono in vista, regolare le coordinate XY.
Per abilitare il sistema di messa a fuoco perfetta o PFS a fuoco automatico, sul lato destro del pannello AX, selezionare la lente d'ingrandimento accanto al pulsante PFS. Una volta che il microscopio ha normalizzato automaticamente l'altezza Z, confermare che il pulsante PFS si illumina e visualizza a fuoco. Utilizzando il rilevatore AX, trovare le cellule desiderate utilizzando il canale DAPI.
Quindi passare al canale ATO 590 per identificare efficacemente le cellule caricate su sfere. Una volta che una cellula è stata identificata e centrata facendo doppio clic, passare ad AX FLIM e FCS. Assicurarsi che 512 per 512 sia selezionato, regolare la dimensione del frame cliccando e trascinando gli angoli per adattarsi alla cellula.
Consentire al frame ridimensionato di diventare rosso. Fare clic con il tasto destro all'interno del frame o selezionare live fino a quando il frame diventa verde per confermare l'adattamento. Dopo aver regolato il numero di acquisizioni al valore desiderato, selezionare cattura.
Osservare la nuova finestra di cattura e la casella di progresso di cattura sul lato destro dello schermo. Una volta aperto il software di analisi FLIM, navigare verso il percorso file corretto. Osservare le acquisizioni che popolano automaticamente la finestra del software di analisi.
Rinominare le acquisizioni mentre vengono raccolte. Quando la cattura è completa, tornare al rilevatore AX. Selezionare live per cercare una nuova cellula.
Regolare la dimensione della finestra AX FLIM e della spettroscopia di correlazione della fluorescenza o FCS secondo necessità per cellule più grandi o più piccole. Dopo aver acquisito nuove cellule durante il periodo di imaging di tre ore, esportare il file sptw creato. Procedere con l'elaborazione e l'analisi dei dati FLIM per estrarre le misurazioni del tempo di vita della fluorescenza dai campioni raccolti.
Le curve di decadimento rappresentative hanno mostrato che la presenza del tag RNA A ha aumentato il tempo di vita della fluorescenza estratto in vitro, mentre i campioni senza il tag RNA A hanno mostrato curve di decadimento spostate a sinistra, indicando valori di tempo di vita medi più brevi. I tempi di vita della fluorescenza cellulare delle cellule caricate con sfere con 3xGly erano significativamente inferiori a quelli carichi con 5xGly. Le curve di decadimento rappresentative hanno mostrato che le cellule caricate con 3xGly avevano curve di decadimento spostate a sinistra rispetto alle cellule caricate con 5xGly, indicando valori di tempo di vita medi della fluorescenza più bassi.
Il nucleo delle cellule caricate con la sonda Riboglow ha mostrato costantemente tempi di vita della fluorescenza più elevati rispetto al citosol della stessa cellula. La finestra di acquisizione della scala di colori falsa, le curve di decadimento e i valori di ampiezza media tau estratti hanno tutti mostrato la stessa tendenza del tempo di vita della fluorescenza. Questo protocollo permette ai ricercatori di determinare il tempo di vita della fluorescenza di molecole fluorescenti in diversi contesti biologici.
I ricercatori possono eseguire l'analisi quantitativa dei dati e valutare le variabili di interesse seguendo questa procedura, compresa l'aggiunta di ligandi RNA. Studi futuri possono applicare Riboglow FLIM a modelli di malattie, espandere le capacità di multiplexing e tracciare la dinamica dell'RNA in sistemi animali vivi.
Panoramica
In questo articolo viene presentato un protocollo dettagliato per il sistema Riboglow-FLIM, un biosensore per RNA di origine genetica che consente la visualizzazione quantitativa di molecole di RNA in cellule mammifere vive mediante microscopia di imaging della durata di fluorescenza (FLIM). Il flusso di lavoro comprende la preparazione del campione, l'acquisizione delle immagini e l'analisi quantitativa, facilitando lo studio della dinamica e delle interazioni dell'RNA sia in ambienti controllati che in cellule vive.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- biologia dell'RNA
- imaging in cellule vive
- microscopia a fluorescenza
Sfondo
- La maggior parte del genoma umano viene trascritta in RNA non codificanti, che svolgono diversi ruoli regolatori.
- La visualizzazione quantitativa dell'RNA in cellule vive è essenziale per comprendere la dinamica dell'RNA, ma rimane tecnicamente impegnativa.
- Riboglow è una piattaforma di biosensori per l'RNA che utilizza un aptamero RNA di breve lunghezza che lega una sonda a piccola molecola per generare un segnale di tempo di vita della fluorescenza.
- La FLIM consente il rilevamento di questi segnali, permettendo l'imaging quantitativo dell'RNA in complessi ambienti cellulari.
Scopo dello studio
- Fornire un protocollo completo per l'implementazione di Riboglow-FLIM in vitro e in cellule mammifere vive.
- Permettere la rilevazione e l'analisi quantitativa dell'RNA basata sul tempo di decadimento della fluorescenza.
- Evidenziare le considerazioni fondamentali per una visualizzazione dell'RNA riproducibile e accurata mediante questo metodo.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di campioni di RNA o cellule vive caricate con perle contenenti sonde Riboglow.
- Configurazione e calibrazione del microscopio confocale a scansione laser e del sistema FLIM.
- Acquisizione di dati relativi al tempo di vita della fluorescenza mediante specifiche configurazioni di laser e detector.
- Analisi quantitativa dei dataset FLIM, inclusa l'estrazione delle curve di decadimento e l'analisi delle regioni subcellulari.
Risultati principali
- In vitro, la presenza del marcatore RNA A ha aumentato il tempo di vita della fluorescenza, mentre la sua assenza ha determinato tempi di vita più brevi.
- In cellule vive, il caricamento dei microsferini con diverse varianti della sonda Riboglow (ad esempio, 3xGly rispetto a 5xGly) ha prodotto firme distinte del tempo di vita della fluorescenza.
- Il nucleo ha mostrato costantemente tempi di vita della fluorescenza più elevati rispetto al citosol all'interno della stessa cellula.
- L'immagine a colori falsati, le curve di decadimento e i valori di ampiezza estratti hanno tutti confermato le tendenze osservate nei tempi di vita della fluorescenza.
Conclusioni
- Riboglow-FLIM consente una valutazione robusta e quantitativa della localizzazione e della dinamica dell'RNA in cellule vive.
- Il protocollo supporta un'implementazione riproducibile e un'analisi accurata dei dati in diversi contesti biologici.
- Questo approccio può essere esteso a modelli di malattia, imaging multiplex e studi in animali vivi in ricerche future.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
La visualizzazione quantitativa dell'RNA in cellule mammifere vive rappresenta una sfida fondamentale nella fase iniziale della scoperta di farmaci, in particolare per comprendere la dinamica degli RNA non codificanti e i meccanismi regolatori. Il flusso di lavoro Riboglow-FLIM consente misurazioni robuste e riproducibili della localizzazione e delle interazioni dell'RNA in ambienti cellulari complessi, supportando una valutazione predittiva affidabile della validazione del bersaglio e della riduzione dei rischi meccanicistici. Questa capacità rafforza la continuità traslazionale dalla scoperta alla ricerca preclinica fornendo dati quantitativi sull'RNA con risoluzione spaziale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo di Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Consente l'analisi diretta della localizzazione e della dinamica dell'RNA in cellule vive per la validazione funzionale di bersagli.
- Permette la riduzione del rischio meccanicistico quantificando le interazioni tra RNA e sonde e la distribuzione subcellulare.
- Fornisce un'elevata predittività per le ipotesi terapeutiche mirate all'RNA attraverso misurazioni quantitative della durata di vita.
Sviluppo di screening e saggi
- Stabilisce saggi di imaging quantitativi validati per il rilevamento dell'RNA in sistemi con cellule vive e in vitro.
- Facilita la standardizzazione e la riproducibilità dei saggi attraverso l'analisi dei tempi di vita della fluorescenza e delle curve di decadimento.
- Permette un confronto affidabile tra varianti di sonde e condizioni sperimentali per flussi di lavoro di screening successivi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea la visualizzazione dell'RNA a modelli cellulari rilevanti per le malattie e allo sviluppo di potenziali biomarcatori.
- Consente la continuità dalla scoperta alla validazione preclinica, permettendo il tracciamento quantitativo dell'RNA in sistemi complessi.
- Fornisce una piattaforma per l'imaging multiplo e per l'eventuale espansione verso modelli di malattia e studi in animali vivi.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il protocollo Riboglow-FLIM si integra nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica, consentendo l'imaging quantitativo dell'RNA, dalla validazione in vitro all'analisi in cellule vive e in modelli tridimensionali.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi biologici quantificando la localizzazione dell'RNA e il legame delle sonde.
- Screening: Fornisce risultati quantitativi riproducibili per confrontare varianti di sonde e condizioni sperimentali.
- Analisi: Offre misurazioni del tempo di vita della fluorescenza, curve di decadimento e valori di ampiezza per un'analisi dati robusta.
- Ricerca traslazionale: Facilita l'allineamento con modelli di malattia e supporta lo sviluppo di strategie per biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma di imaging standardizzata e scalabile, adattabile a diversi sistemi biologici.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella ricerca mirata all'RNA.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione, la riproducibilità e la scalabilità dei flussi di lavoro per l'imaging dell'RNA.
- Valore strategico: Migliora il processo decisionale di avanzamento o interruzione e l'efficienza del capitale fornendo dati quantitativi e riproducibili.
- Impatto sul portafoglio: Consente la priorizzazione e la promozione di programmi mirati all'RNA con adeguamento del rischio.
Considerazioni relative all'implementazione
- Richiede competenze specifiche in microscopia confocale, strumentazione FLIM e analisi quantitativa delle immagini.
- Richiede l'accesso a sistemi FLIM calibrati e a software compatibili per l'acquisizione delle immagini.
- Necessita di un rigoroso controllo dei parametri sperimentali e di acquisizione per garantire la riproducibilità.
- Potrebbe richiedere adattamenti per diversi tipi cellulari, varianti di sonde o scenari di imaging multiplex.
- Dipende da una accurata selezione delle regioni di interesse e da un attento processamento dei dati per ottenere risultati quantitativi precisi.
