Test di protezione amikacin per la quantificazione e visualizzazione dell'invasione delle cellule di Escherichia coli

Ci concentriamo sulla caratterizzazione di come gli E. coli invasivi aderenti invadano le cellule epiteliali intestinali e sull'identificazione dei fattori batterici che contribuiscono a questo processo. Gli isolati resistenti alla gentamicina limitano i tradizionali saghi di invasione. Questo protocollo basato sull'amikacina consente una quantificazione accurata dei batteri intracellulari.

Per cominciare, raccogli tutti i reagenti e i media necessari per il test di invasione. Successivamente, preleva la scorta di glicerolo congelata del ceppo invasivo di Escharicia colli, o AIEC, dal congelatore a 80 gradi Celsius. Utilizzando una punta di legno sterile o una pipetta, raschia delicatamente i batteri dal gambo e sfilali su una piastra di coclea Luria-Bertani, o LB, per ottenere colonie singole.

Incubare il piatto a 37 gradi Celsius durante la notte. Il giorno seguente, usando un bastoncino di legno sterile o una punta di pipetta, scegli una singola colonia dalla piastra di copera. Inoculare la colonia in 3 millilitri di brodo LB e incubare la coltura a 37 gradi Celsius a 200 giri al minuto durante la notte.

Poi esegui una diluizione da 1 a 10 della coltura notturna in 1 millilitro di brodo di LB. Misurare la densità ottica a 600 nanometri della coltura diluita utilizzando uno spettrofotometro. Trasferire 100 microlitri della coltura notturna in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri e centrifugare a 6.000 G per 10 minuti a 4 gradi Celsius.

Aspirare il sovrantantante con attenzione senza disturbare il pellet cellulare e risospendere il pellet in 1 millilitro di siero e substrato senza antimicotici antibiotici. Calcola il volume richiesto di sospensione batterica per ottenere una molteplicità di infezioni o MOI di 10 utilizzando la formula fornita. Per preparare il mezzo infettivo, trasferire il volume calcolato della sospensione batterica in un tubo microcentrifuga sterile da 1,5 millilitri e completare il volume a 1 millilitro con substrati sierici e senza antibiotici antimicotici.

Mescola delicatamente pipettando su e giù più volte. Prepara una piastra da 96 pozzi per determinare le unità formative di colonie per millilitro della coltura batterica diluita durante la notte, eseguendo diluizioni seriali dieci volte in PBS sterile 1X. Trasferire 200 microlitri della coltura diluita durante la notte nel primo pozzetto della piastra di piatto.

Pipetta 20 microlitri della coltura nella fila successiva contenente 180 microlitri di PBS 1X. Mescola pipettando su e giù 10 volte e ripeti il processo di diluizione fino a raggiungere 10 fino alla potenza di 6 usando ogni volta una punta nuova della pipetta. Ora impallina 10 microlitri di diluizioni spot in triplicate dal 10 al potere da 2 a 10 fino alla potenza di 6 diluizioni su piastre LB con cocle.

Lascia che le macchie vengano assorbite nella coclea vicino a una fiamma. Incubare le placche durante la notte a 27-30 gradi Celsius per prevenire la sovracrescita delle colonie e ottenere colonie individuali chiare. Rimuovere i monostrati epiteliali sani e confluenti di cellule Caco-2, coltivati in una piastra di coltura a 24 pozzi rivestita di collagene dall'incubatrice, e aspirare l'intero mezzo da ciascun pozzo.

Pipetta un millilitro di substrato siero e antimicotici senza antibiotici in ciascun pozzo. Aspira il substrato per rimuovere tracce di substrato e ripeti il lavaggio un'ultima volta per un totale di due lavaggi. Ora aggiungi 1 millilitro del mezzo infettivo precedentemente preparato contenente AIEC in ogni pozzo della piastra a 24 pozzi contenente le cellule Caco-2.

Centrifugare la piastra da 24 pozzi a 500G per 15 minuti a temperatura ambiente per sincronizzare il contatto batterico con il monostrato epiteliale e incubare la piastra a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% per tre ore per consentire l'invasione batterica. Prepara substrati contenenti antibiotici aggiungendo 240 microgrammi per millilitro di amikacina a siero preriscaldato e a mezzi senza antibiotici senza antibiotici. Dopo il periodo di infezione, aspirare il substrato dai monostrati delle cellule Caco-2 e lavare ogni pozzo con 1 millilitro di siero e substrato senza antibiotici.

Aspira il substrato e ripeti il lavaggio ancora una volta per un totale di due lavaggi. Poi si pipettano un millilitro di 240 microgrammi per millilitro di substrati contenenti amikacina in ogni pozzo. Parallelamente, trattare un altro gruppo di cellule con 100 microgrammi per millilitro di gentamicina per confronto e incubare le cellule a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% per 1 ora per eliminare i batteri extracellulari.

Dopo l'incubazione, aspira il substrato di ciascun pozzo. Aggiungi 1 millilitro di PBS per lavare via i batteri aderenti. Aspira il PBS e ripeti il lavaggio un'altra volta per un totale di due lavaggi.

Ora aggiungi 200 microlitri di 1% Triton X100 diluito in PBS in ogni pozzo e incuba su uno shaker orbitale a 90 giri al minuto per 10 minuti per lisare le cellule epiteliali. Pipetta su e giù circa 30 volte per pozzo per staccare le cellule dalla placca. Successivamente, eseguire diluizioni seriali dieci volte più numerose delle cellule in una piastra da 96 pozzi utilizzando PBS.

Lastra 10 microlitri di diluizioni spot in triplicate dal non diluito a 10 fino alla potenza di 3 diluizioni su piastre LB con coclea. Dopo che le macchie si sono asciugate, incubare le placche durante la notte a 27-30 gradi Celsius per ottenere colonie individuali e chiare. Dopo l'incubazione, rimuovere le piastre e contare le colonie ben isolate dalle diluizioni spot appropriate contenenti più di sette colonie per macchia nei triplicati.

Infine, calcola l'inoculo e le unità di formazione della colonia recuperate per millilitro e la percentuale di invasione utilizzando le equazioni. Il trattamento con gentamicina o amikacin dopo l'infezione dei monostrati di cellule Caco-2 con il ceppo invasivo AIEC NRG857c, o con il ceppo di controllo non invasivo Escherichia coli DH5 alpha controllo, ha portato a profili di invasione simili. Questi risultati indicavano che l'amikacina era efficace quanto la gentamicina nell'eliminare i batteri extracellulari e rifletteva accuratamente il carico batterico intracellulare.

Il trattamento di isolati clinici di Escherichia coli resistenti alla gentamicina ottenuti da pazienti con malattia infiammatoria intestinale con gentamicina ha portato a valori di recupero batterico altamente variabili che variano intorno al 21 al 2.788%. Al contrario, il trattamento con amikacina ha ridotto drasticamente il recupero batterico su tutti gli isolati, dimostrandone l'efficacia e permettendo misurazioni di invasione più affidabili. Questo protocollo consente una quantificazione accurata dei batteri intracellulari e la valutazione dell'invasione batterica nelle cellule epiteliali. Metodi aggiuntivi come la microscopia a immunofluorescenza possono essere utilizzati per convalidare ulteriormente l'invasione batterica e la localizzazione intracellulare.

Studi futuri possono identificare nuovi fattori di virulenza e indagare le vie dell'ospite che vengono colpite durante l'infezione invasiva da E. coli aderente.