Protocollo integrato per la valutazione dei linfatici meningei: iniezione di cisterna magna, imaging dei linfonodi, dissezione meningea e colorazione dell'intero montaggio
29 maggio 2026
Qui viene presentato un protocollo per valutare i vasi linfatici meningei (MLV) dei muri, che svolgono un ruolo importante in molteplici malattie neurologiche. L'obiettivo di questo protocollo è fornire un metodo integrato che consenta sia la valutazione funzionale del drenaggio dei tracce sia la caratterizzazione morfologica dettagliata della rete di MLV dorsali.
La nostra ricerca si concentra sul metodo di valutazione della funzione e morfologia dei vasi linfatici per il topo. Questo protocollo supporta modelli di malattie neurologiche, somministrazione di farmaci, correlazione molecolare e studi traslazionali. Per cominciare, raccogli gli strumenti chirurgici e i buffer necessari.
Usa le pinze smussate per staccare l'ago calibro 30 e mantenere la punta. Utilizzando un tubo di polietilene 10 o PE10 lungo 30 centimetri, collega l'ago rotto calibro 30 al ago per microiniezione contenente un ago calibro 30. Monta l'ago e il tubo assemblati sulla pompa di microiniezione.
Pesa il mouse. Dopo aver anestetizzato il topo tramite iniezione intraperitoneale, confermare che il riflesso del pizzicamento del dito del piede cessi e che la respirazione diventi lenta e regolare. Applica una crema dipilatoria sulla regione cervicale per rimuovere i peli sopra i linfonodi.
Rade la pelle dorsale del collo. Metti il mouse in una cornice stereotassica su un cuscinetto riscaldante. Inclina la testa a un angolo di 120 gradi rispetto al tronco.
Pulire l'area in modo sequenziale con iodio di povidone e etanolo al 75%. Fai un'incisione mediana nella pelle del collo. Usando due paia di pinze con punta smussata, separare gli strati muscolari.
Utilizzando pinze a punta fine, seziona il muscolo finché il duramatero traslucido che sovrasta la cisterna magna o il CM diventa visibile. Ritrae i muscoli per mantenere un'esposizione costante. Sotto un microscopio stereo, usa pinze smussate per tenere l'ago.
Inserire l'ago a un angolo di 45 gradi rispetto al piano del duramatero fino a una profondità di circa uno o due millimetri. Posiziona la smussatura dell'ago parallela al duramatero in modo che rimanga completamente sotto di esso. Usa carta assorbente per asciugare eventuali perdite di liquido cerebrospinale o liquido cerebrospinale (LCR).
Imposta la pompa di microiniezione per erogare un microlitro al minuto. Inietta cinque microlitri di ovalbumina, soluzione coniugata di AlexaFluor 647 nel CM, e lascia l'ago in posizione per due minuti per evitare il riflusso di riflusso. Applica una goccia di colla biologica sulle meningi e chiudi l'incisione chirurgica.
Eseguire immagini in vivo del topo per monitorare l'intensità del colorante nei linfonodi cervicali o CLN a 30 minuti e 60 minuti. Nel pannello di controllo acquisizione IVIS, seleziona la procedura di imaging wizard e clicca su Seguente nella finestra pop-up. Seleziona spettrale unmix/filter scan e clicca su Next.
Clicca con il tasto destro sul nome della sonda, scegli i coloranti, seleziona AlexaFluor 647 e clicca su avanti. Seleziona impostazioni manuali. Imposta il tempo di esposizione a 0,5 secondi.
E si utilizza la modalità con un filtro di eccitazione a 640 nanometri e un filtro a emissione a 680 nanometri. Dopo aver decapitato il topo soppresso, si effettua un'incisione lungo la linea centrale del cranio per aprire il cuoio capelluto. Utilizzando due emostrati curvi, separare il cuoio capelluto bilateralmente con una delicata retrazione.
Inserire gli emostrati curvi nei fossi orbitali e rimuovere il cuoio capelluto residuo dalle regioni nasale e orale. Rimuovere la mandibola mantenendo intatto il cranio. Rimuovere l'osso dalla base del cranio per esporre l'aspetto ventrale del cervello.
Utilizzando una pinza contundente, estrarre con cura il cervello evitando il contatto con il duramatero delle ossa parietali. Immergi completamente il cranio dorsale in cinque millilitri di paraformaldeide al 4%. Posiziona il campione a quattro gradi Celsius per 24 ore.
Quando il cranio fisso raggiunge la temperatura ambiente, lavarlo con cinque millilitri di 1XPBS e ripetere il lavaggio tre volte per 10 minuti ciascuno. Posiziona il lato dorsale del cranio verso il basso in un piatto da 10 centimetri riempito con 1XPBS. Usando pinze a punta fine, afferra o preme la bolla timpanica e rimuovila dal cranio.
Utilizzando forbici, rifila lungo la superficie ventrale del cranio per circa due millimetri per lisciarlo. Con le pinze, il tessuto bianco residuo trasparente è trasparente dalla congiunzione dei seni nasali o dalla regione COS delle meningi. Utilizzando micropinze fine, sollevare delicatamente un bordo delle meningi dal margine del cranio.
Solleva il bordo opposto. Afferra il bordo a forma di ciotola della meninge e tira per separarlo dal cranio nella regione del COS. Rimuovere l'osso mascellare con le forbici.
Afferra di nuovo il bordo della meninge e tira per separarlo dal cranio nella zona dell'osso frontale. Inserire le meningi intatte in una piastra a 24 pozzi contenente un millilitro di 1XPBS. Dopo aver bloccato e colorato le meningi con anticorpi primari e secondari, eseguire l'imaging (imaging).
L'imaging in vivo ha rivelato segnali fluorescenti ovali, distinti distribuiti bilateralmente nella regione cervicale dopo l'iniezione. Il tracciante era chiaramente visibile nei CLN dopo l'iniezione, con un'intensità di fluorescenza che ha raggiunto un picco di circa 60 minuti. Sono stati osservati segnali fluorescenti nei linfonodi cervicali superficiali e profondi isolati.
Iniezioni fallite non hanno prodotto alcun segnale fluorescente rilevabile nella regione cervicale. La colorazione immunofluorescente per il recettore endoteliale dell'ialuronina dei vasi linfatici uno, o LYVE1, ha chiaramente delineato la morfologia dei vasi linfatici. È stato osservato un segnale LYVE1 discontinuo dovuto a tearing meningeo, compromettendo la quantificazione affidabile.
L'assenza della regione del seno trasverso era visibile nei campioni compromessi. Utilizzando questo approccio, i ricercatori possono indagare la funzione transitoria e la morfologia nasale dorsale basata sul ML nei topi. La sfida più grande è eseguire una corrente di iniezioni tendinose intrasensoriali e una accurata dissezione meningena preservando l'integrità dei vasi.
A seguito di questa procedura, i ricercatori possono effettuare l'estrazione di RNA e proteine. Somministrazione o analisi intracranica di farmaci in modelli di malattia.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
Questo protocollo descrive un approccio integrato per valutare i vasi linfatici meningei (MLVs) nei topi, che sono cruciali per l'omeostasi del sistema nervoso centrale (CNS). Il metodo combina l'iniezione intracisternale magna di traccianti fluorescenti, l'imaging in vivo dei linfonodi cervicali (CLNs), la dissezione delle meningi e la colorazione su preparati interi per valutare sia la morfologia che la funzionalità dei MLVs. La procedura è efficiente e consente un'analisi completa in circa tre ore.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Neuroscienze
- Neuroanatomia
- Biologia linfatica
Sfondo
- I linfatici meningeali (MLVs) sono essenziali per il mantenimento dell'omeostasi del sistema nervoso centrale (CNS).
- Il malfunzionamento dei MLVs è associato a diverse patologie neurologiche.
- È necessaria una valutazione dettagliata dei MLVs per comprenderne i ruoli fisiologici e patologici.
- I metodi esistenti spesso mancano di integrazione tra analisi funzionale e morfologica.
Scopo dello studio
- Fornire un protocollo completo per la valutazione dei linfonodi mediastinici (MLV) nei topi.
- Permettere la valutazione simultanea della funzione e della morfologia dei MLV.
- Facilitare studi sulla fisiologia del sistema nervoso centrale e sui meccanismi delle malattie che coinvolgono i MLV.
Metodi Utilizzati
- Iniezione nella cisterna magna (i.c.m.) di traccianti fluorescenti nel liquido cerebrospinale (CSF).
- Acquisizione in tempo reale del drenaggio del tracciante verso i linfonodi cervicali (CLNs).
- Dissezione delle meningi per la preparazione del tessuto.
- Colorazione su preparati interi per un'analisi morfologica dettagliata dei vasi linfatici dorsali (MLVs).
Risultati principali
- Il protocollo consente la visualizzazione in tempo reale del movimento del tracciante dal liquor spinale ai linfonodi cervicali.
- Permette una valutazione morfologica dettagliata dei vasi linfatici meningei mediante colorazione su preparato intero.
- L'intero flusso di lavoro può essere completato entro 3 ore.
- Il metodo è adattabile per la somministrazione intracranica di farmaci ed è compatibile con analisi molecolari (estrazione di RNA/proteine).
Conclusioni
- Questo protocollo integrato fornisce un quadro solido per lo studio dei linfonodi mediastinici nei topi.
- Permette analisi sia funzionali che morfologiche, potenziando la ricerca sull'omeostasi e sulle malattie del sistema nervoso centrale.
- L'approccio è versatile e può essere adattato per ulteriori applicazioni sperimentali.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La valutazione integrata dei vasi linfatici meningei (MLVs) è sempre più fondamentale per ridurre i rischi nella scoperta di farmaci mirati al sistema nervoso centrale e per comprendere i meccanismi delle malattie neurologiche. Questo protocollo consente la valutazione simultanea della funzionalità e della morfologia dei MLVs, sostenendo una maggiore affidabilità predittiva nelle fasi iniziali della ricerca sul sistema nervoso centrale. La sua adattabilità ad analisi molecolari e alla somministrazione intracranica lo rende una capacità riutilizzabile in diversi flussi di lavoro di scoperta e preclinici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi della funzione e della struttura dei vasi linfatici meningei (MLV) per chiarire i percorsi linfatici del sistema nervoso centrale (CNS).
- Supporta la riduzione dei rischi biologici collegando la disfunzione dei MLV a modelli di malattie neurologiche.
- Facilita la previsione e l'affidabilità nella validazione degli obiettivi per studi sull'omeostasi del CNS.
Sviluppo di screening e saggi
- Prepara sistemi di tessuti validati pertinenti al sistema nervoso centrale per saggi molecolari o di imaging successivi.
- Standardizza letture funzionali basate su traccianti e analisi morfologica su preparato intero.
- Consente una valutazione riproducibile e quantitativa del drenaggio linfatico e dell'integrità dei vasi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea a modelli rilevanti per le malattie consentendo la valutazione di biomarcatori funzionali e strutturali.
- Supporta la continuità dalla scoperta alla validazione preclinica di bersagli linfatici del sistema nervoso centrale.
- Fornisce una riduzione del rischio meccanicistica per ipotesi terapeutiche che coinvolgono disfunzioni del sistema linfatico del sistema nervoso centrale.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo collega la fase iniziale della scoperta, la validazione del bersaglio e la ricerca preclinica nella biologia del sistema linfatico del SNC, sostenendo sia la verifica delle ipotesi sia lo sviluppo di biomarcatori traslazionali.
- Biologia della scoperta: Integra saggi con traccianti funzionali e analisi morfologica per chiarire i meccanismi linfatici del sistema nervoso centrale.
- Screening: Fornisce output standardizzati e quantitativi per la valutazione comparativa della funzione dei vasi linfatici meningei.
- Analisi: Offre imaging in tempo reale e dati su preparati interi per supportare il confronto statistico tra condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Permette l'allineamento con modelli di malattia e sostiene la continuità dei biomarcatori attraverso le diverse fasi della ricerca.
- Riutilizzo aziendale: Adattabile per la somministrazione intracranica e per analisi molecolari, supporta linee di ricerca sul sistema nervoso centrale di diversa natura.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella ricerca sui linfatici del sistema nervoso centrale.
- Valore operativo: Standardizza le procedure per garantire riproducibilità e scalabilità tra diversi studi.
- Valore strategico: Orienta le decisioni di avanzamento o interruzione e riduce i rischi biologici in fase avanzata nei portafogli di ricerca sul sistema nervoso centrale.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione e l'avanzamento di programmi mirati al sistema nervoso centrale, adeguati al livello di rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella dissezione del sistema nervoso centrale, nell'iniezione di traccianti e nelle tecniche di imaging in vivo.
- Necessita dell'accesso a pompe per infusione, sistemi di imaging a fluorescenza e infrastrutture per l'elaborazione dei tessuti.
- Richiede una standardizzazione tra i gruppi di lavoro per protocolli riproducibili di somministrazione dei traccianti e di imaging.
- Adattabile a tessuti freschi o fissati, consentendo analisi molecolari e morfologiche.
- Limitato ai modelli animali di piccole dimensioni e dipendente da competenze chirurgiche e di imaging precise.
