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</ol>

<table><tbody><tr><td>100 mm piastra</td><td>Corning</td><td>353003</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>Filtro 45 &micro;m&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLHVM33RS</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>Piastra a 6 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3506</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>Piastre a 96 pozzetti fondo chiaro nero</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS356259</td><td>Per CellTiter-Glo Luminometric Assay di Vitalità Cellulare</td></tr><tr><td>Blasticidina</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1113903</td><td>Per selezione</td></tr><tr><td>CellTiter-Glo luminescent cell viability assay</td><td>CellTiter-Glo, Promega</td><td>G7570</td><td>Per CellTiter-Glo Luminometric Assay di Vitalità Cellulare</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td></td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A3672,0050</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>16140071</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>Miscela nutriente Ham&rsquo;s F12</td><td>Gibco</td><td>11765054</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>Cellule HEK293T</td><td></td><td></td><td>Donazioni gentili di Robert Weinberg (MIT, Boston, USA).</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher</td><td>15630080</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>Idrocortisone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4001-1G</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9278-5ML</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>LentiCas9-blast</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>#52962</td><td>Per la generazione di linea cellulare stabile Cas9</td></tr><tr><td>LentiGuide-Puro&nbsp;</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>#52963</td><td>Backbone per la clonazione gRNA&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit MN NucleoSpin per tessuti</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740952.5</td><td>Per l'estrazione di DNA genomico</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>10010023</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>pLentiCRISPR v2&nbsp;</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>#52961</td><td>Backbone per la clonazione gRNA&nbsp;</td></tr><tr><td>Polietilenglicole (PEG)-8000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2139-500G</td><td>Per la concentrazione di lentivirus</td></tr><tr><td>Polietilenimmina, lineare (PEI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>765090-1G</td><td>Per la produzione di lentivirus</td></tr><tr><td>Solfato di protamina (PS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4380-25G</td><td>Per l'infezione da lentivirus</td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene&nbsp;</td><td># 12260</td><td>Per la produzione di lentivirus</td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1113803</td><td>Per selezione</td></tr><tr><td>Cellule aderenti SUM159PT</td><td></td><td></td><td>Donazioni gentili di Robert Weinberg (MIT, Boston, USA).</td></tr><tr><td>Taxol</td><td>Paclitaxel, Sigma</td><td>PHR1803-200MG</td><td>Per la generazione e il mantenimento di cellule res</td></tr><tr><td>Trypsina-EDTA (0,05%)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>25300054</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>Verapamil</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S4202</td><td>Per selezione</td></tr><tr><td>VSV-G</td><td>Addgene&nbsp;</td><td># 8454</td><td>Per la produzione di lentivirus</td></tr></tbody></table>

screening knockout a livello epigenomico basati su crispr-cas9 su cellule chemoresistenti

Epigenome-Wide CRISPR-Cas9-Based Knockout Screens on Chemoresistant Cells

Screening knockout a livello epigenomico basati su CRISPR-Cas9 su cellule chemoresistenti

Chemotherapy resistance remains a major challenge in cancer treatment, driven by cancer cells&#39; ability to acquire adaptive properties, rewire ...

Studiamo i meccanismi epigenetici responsabili della resistenza chemioterapica nel carcinoma mammario triplo negativo, utilizzando approcci di screening basati su CRISPR. Per iniziare, adattare circa 159 cellule aderenti PT a 2 volte 10 alla potenza di 3 cellule per pozzetto in piastre da 96 pozzetti con fondo nero-trasparente, utilizzando il terreno Ham's F-12 Nutrient Mix, integrato con i componenti indicati. Incubare le cellule per 16 ore in un incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.Successivamente, preparare una soluzione madre di Taxolo disciolta in dimetilsulfossido o DMSO. Per trattare le cellule, preparare diluizioni seriali di Taxolo nel mezzo di coltura, con concentrazioni comprese tra 0,3 nanomolare e 10 micromolare, utilizzando il DMSO da solo come controllo del veicolo. Trattare le cellule con 200 microlitri di dosi crescenti di Taxolo in triplicato.Lasciare la piastra in un incubatore per colture cellulari per 72 ore a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Dopo 72 ore di trattamento con il farmaco, valutare la vitalità cellulare mediante un saggio di quantificazione dell'ATP basato sulla luminescenza. Misurare la luminescenza con un lettore di micropiastre e normalizzare i risultati rispetto ai valori del controllo DMSO.Successivamente, calcolare i valori di concentrazione inibitoria al 10% e al 50% utilizzando una regressione non lineare con un modello logistico a quattro parametri per la risposta dose-effetto, mediante un software statistico adeguato. Per iniziare a generare cellule chemioresistenti, seminare 2 × 10⁵ cellule A549 PT per pozzetto in piastre a sei pozzetti e incubare per tutta la notte a 37 gradi Celsius in atmosfera di anidride carbonica al 5%.Il giorno successivo, trattare le cellule con concentrazioni inibitorie del 10% o del 50% di Taxolo in due millilitri di mezzo di coltura per 72 ore. Se le cellule tollerano la concentrazione attuale del farmaco, suddividerle in due pozzetti. Mantenere uno come controllo di riserva con mezzo fresco e raddoppiare la concentrazione di Taxolo nell'altro pozzetto.Durante la generazione di cellule resistenti, passare le cellule parentali in un mezzo contenente DMSO come controllo e regolare il volume di DMSO in modo che corrisponda alla quantità presente nel trattamento con Taxol corrispondente. Misurare la vitalità cellulare ogni tre o quattro settimane fino a quando non si osserva una differenza significativa nei valori di concentrazione inibitoria al 50% tra le linee cellulari parentali e quelle resistenti. Mantenere le cellule resistenti stabili alla concentrazione finale di Taxol utilizzata durante l'aumento progressivo del dosaggio.Per la caratterizzazione delle cellule resistenti, eseguire il sequenziamento dell'RNA, il Western blot, la qPCR e saggi di vitalità cellulare in presenza del farmaco. Seminare circa 159 cellule parentali e resistenti al Taxolo in triplice replicato in piastre nere con fondo trasparente da 96 pozzetti a 2 × 10³ cellule per pozzetto. Incubare le cellule durante la notte a 37 °C con 5% di anidride carbonica.Trattare le cellule con diluizioni seriali a due fold di verapamil, comprese tra 80 micromolar e 1,25 micromolar, mantenendo costante la concentrazione di Taxol in tutte le condizioni di trattamento. Dopo 72 ore di trattamento, valutare la vitalità cellulare mediante un saggio di quantificazione dell'ATP basato sulla luminescenza. Determinare la concentrazione di verapamil che mantiene la vitalità cellulare ripristinando al contempo la sensibilità nelle cellule resistenti.Per determinare la concentrazione di puromicina da utilizzare in combinazione con verapamil, seminare circa 159 cellule PT resistenti al Taxol in una piastra a 96 pozzetti a una densità di 2 × 10³ cellule per pozzetto. Incubare la piastra per 16 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Preparare diluizioni seriali a due raddoppi di puromicina, con concentrazioni comprese tra 40 e 0,625 microgrammi per millilitro, in mezzo contenente la concentrazione di verapamil precedentemente determinata.Trattare le cellule con le diluizioni di puromicina rispettivamente per 72 ore. Dopo il saggio di vitalità, identificare la concentrazione minima di puromicina che riduce la vitalità al 5% o meno in presenza di verapamil. Successivamente, utilizzare alcune cellule resistenti al PT Taxol 159 per calcolare la titolazione virale e la molteplicità di infezione.Aggiungere il volume calcolato di lentivirus Cas9, in base alla multiplicità di infezione desiderata, direttamente alle cellule nel mezzo di coltura contenente otto microgrammi per millilitro di solfato di protamina. Sostituire il mezzo virale con mezzo fresco dopo 16 ore dall'infezione. Il giorno successivo, applicare la selezione con blasticidina sostituendo il mezzo di coltura con mezzo contenente la concentrazione di blasticidina precedentemente determinata.Continuare la selezione fino a quando le cellule non infette vengono eliminate. Validare l'attività di Cas9 utilizzando RNA guida singoli di controllo per geni essenziali oppure usare GFP come reporter per valutare l'efficienza di knockout. Calcolare il numero di cellule infette con successo necessarie per raggiungere la copertura della libreria desiderata utilizzando l'equazione presentata.Preparare miscele di infezione indipendenti per ogni replicato biologico. Dopo aver seminato le cellule precedentemente calcolate, infettarle con un volume virale determinato in otto millilitri di terreno di coltura completo contenente otto microgrammi per millilitro di solfato di protamina. Dopo 16 ore, sostituire il terreno virale con terreno fresco e incubare le cellule a 37 gradi Celsius in presenza di 5% di anidride carbonica.Applicare la selezione con puromicina in presenza di verapamil alle concentrazioni precedentemente determinate per arricchire le cellule infettate con sg-RNA in circa 159 cellule PT resistenti al Taxol. Continuare la selezione fino a quando tutte le cellule nella piastra di controllo non infettata sono eliminate. In genere, per circa tre giorni.Al termine della selezione con puromicina e verapamil, trattare le cellule con tripsina e raccogliere un punto temporale iniziale, il pellet cellulare al tempo zero, da ogni replicato biologico corrispondente al livello di copertura deciso durante la trasduzione. Suddividere le cellule in bracci sperimentali, mantenendo la copertura. Un braccio come controllo con DMSO.E l'altro come trattamento con Taxolo. Mantenere le colture per 14-16 raddoppiamenti cellulari. Calcolare il livello di raddoppiamento cellulare utilizzando la formula specificata.A ogni passaggio, monitorare la vitalità cellulare e la cinetica di crescita. Mantenere un numero adeguato di cellule per evitare colli di bottiglia. Una volta raggiunto il livello desiderato di raddoppiamento della popolazione, raccogliere i pellet del punto temporale finale per ogni replicato e condizione, mantenendo la copertura della libreria per ogni pellet.Conservare i pellet a 80 gradi Celsius fino all'estrazione successiva del DNA genomico. Le cellule resistenti hanno continuato a proliferare, nonostante il trattamento con Taxolo, mentre le cellule parentali non sono sopravvissute allo stesso trattamento. Il sequenziamento dell'RNA ha identificato ABCB1 come uno dei geni maggiormente sovraespressi nelle cellule resistenti, seguito da altri trasportatori ABC, tra cui ABCB4 e ABCA5.L'upregolazione dell'espressione di ABCB1 nelle cellule resistenti è stata convalidata mediante PCR quantitativa. Le cellule resistenti al Taxol hanno mostrato un fenotipo di resistenza a più farmaci e resistenza alla doxorubicina e alla vincristina. La selezione con puromicina potrebbe non essere efficiente nelle cellule resistenti perché la puromicina può essere espulsa tramite l'efflusso mediato da ABCB1.Il verapamil da solo non ha influenzato la vitalità cellulare. Tuttavia, quando combinato con agenti chemioterapici, il verapamil ha ripristinato la sensibilità a questi agenti. Dosi non tossiche di verapamil hanno inoltre ripristinato la sensibilità alla puromicina in cellule resistenti al Taxol.Quando i campioni del punto temporale finale delle condizioni trattate con DMSO o Taxolo sono stati confrontati con il punto temporale iniziale, quasi tutti i geni essenziali sono risultati depleti dopo il knockout, confermando la qualità dello screening. Al contrario, il confronto tra i campioni finali trattati con DMSO e quelli trattati con Taxolo non ha mostrato una deplezione dei geni essenziali, poiché questi geni rimangono essenziali in entrambi i gruppi. Invece, questo confronto rivela modificatori epigenetici che sensibilizzano al Taxolo.Molti geni di controllo positivo e modificatori epigenetici sono risultati significativamente depleti nello schermo EPIKOL eseguito in cellule resistenti al Taxolo. Le RNA guida singole dirette contro ABCB1 sono state specificamente deplete nel gruppo trattato con Taxolo, confermando ABCB1 come controllo positivo per la sensibilità al Taxolo nello schermo. Questo protocollo consente ai ricercatori di studiare la resistenza terapeutica in modelli di cancro e di identificare regolatori epigenetici della resistenza alla chemioterapia mediante piattaforme di screening CRISPR.La considerazione più importante durante lo screening di cellule chemioresistenti è mantenere la rappresentatività della libreria e ottimizzare le condizioni di trasfezione e selezione. I futuri studi identificheranno le vulnerabilità terapeutiche delle cellule tumorali resistenti a più farmaci e svilupperanno nuovi approcci combinatori per superare la chemioresistenza.

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La tecnica qui descritta genotipizzazione, che accoppia fluorescente reazione a catena della polimerasi (PCR) per elettroforesi su gel capillare, permette high-throughput genotipizzazione di cloni knockout nucleasi-mediata. Elude limitazioni incontrate da altre tecniche di genotipizzazione ed è più conveniente rispetto ai metodi di sequenziamento.

Usando una tecnica fluorescente PCR-capillare elettroforesi su gel al genotipo CRISPR / Cas9 mediata Knockout Mutants in un formato high-throughput

I recenti progressi nella capacità di manipolare geneticamente le linee cellulari somatiche hanno un grande potenziale per la ricerca di base e applicata. Qui presentiamo due approcci per la produzione e lo screening generati da CRISPR / Cas9 nelle linee cellulari mammiferi, con e senza l'uso di marcatori selectable.

Selezione-dipendente e generazione indipendente di CRISPR / Cas9-mediata Gene Knockouts nelle cellule di mammiferi

Qui, presentiamo un protocollo per ottimizzare CRISPR-Cas9 per ottenere una maggiore specificità senza la perdita di attività sul bersaglio. Utilizziamo un approccio diretto evoluzione chiamato Sniper-schermo per trovare un mutante Cas9 con le caratteristiche desiderate. Cecchino-Cas9 è compatibile con tronco singolo-guida RNAs e consegna in un formato della ribonucleoproteina, ben note strategie per conseguire maggiore specificità.

Utilizzando il cecchino-Cas9 a minimizzare gli effetti di fuori bersaglio di CRISPR-Cas9 senza la perdita di attività On-target tramite Evolution diretto

La tecnologia CRISPR-Cas9 fornisce un metodo efficiente per modificare con precisione il genoma dei mammiferi in qualsiasi tipo di cellula e rappresenta un nuovo mezzo per eseguire schermi genetici a livello di genoma. Qui viene fornito un protocollo dettagliato che illustra i passaggi necessari per il successo delle prestazioni degli schermi CRISPR-Cas9 a livello di genoma raggruppato.

Schermi genetici basati su CRISPR in cellule mammaliane

Questo manoscritto descrive un approccio di screening basato sulle cellule su scala genomica per identificare le interazioni recettore-ligando extracellulari.

Identificazione del recettore della superficie cellulare utilizzando schermi genetici CRISPR/Cas9 su scala genomica

Lo screening dell'interferenza dell'RNA ad alto rendimento (RNAi) utilizzando un pool di shRNA lentivirali può essere uno strumento per rilevare bersagli letali sintetici terapeuticamente rilevanti nelle neoplasie maligne. Forniamo un approccio di screening dello shRNA aggregato per studiare gli effettori epigenetici nella leucemia mieloide acuta (LMA).

Screening della libreria di shRNA in pool per identificare i fattori che modulano un fenotipo di resistenza ai farmaci

L'articolo descrive un protocollo per l'applicazione di un modello in vitro per l'esaurimento per completare uno screening CRISPR knockout per l'intero genoma in cellule T del recettore dell'antigene chimerico del donatore sano.

Esecuzione di uno screening CRISPR knockout in vitro a livello di genoma in cellule T del recettore dell'antigene chimerico

Qui, presentiamo un protocollo che integra la tecnologia CRISPR/Cas9 con il saggio Cell Counting Kit-8 (CCK-8) per identificare i geni candidati che sono cruciali per l'anomala capacità proliferativa delle cellule staminali ematopoietiche e delle cellule progenitrici.

Valutazione dei geni correlati alla crescita anormale di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche combinando la tecnologia CRISPR/Cas9 con il conteggio delle cellule

Questo studio presenta un doppio sistema CRISPRi che ha come bersaglio lunghi RNA non codificanti in cellule di melanoma. Consente il knockdown genico combinatorio e lo screening letale sintetico, identificando le interazioni lncRNA specifiche del cancro per potenziali strategie terapeutiche.

Doppia strategia di interferenza CRISPR per il targeting delle interazioni letali sintetiche tra RNA non codificanti nelle cellule tumorali

Viene fornito un approccio meticoloso e strutturato per selezionare geni resistenti e sensibili alle radiazioni attraverso l'applicazione di un metodo di screening CRISPR/Cas9 per l'intero genoma. Questo protocollo ha anche il potenziale per fungere da quadro versatile per altri sforzi di ricerca che studiano i meccanismi di resistenza ai farmaci chimici somministrati clinicamente.

Screening CRISPR a livello di genoma per svelare geni radiosensibili e radioresistenti

Abbiamo sviluppato un protocollo ottimizzato di screening knockout CRISPR-Cas9 per le cellule CAR T primarie. Riducendo il trasferimento del gDNA tramite la digestione enzimatica e il pulldown delle cassette sgRNA, questo approccio minimizza gli artefatti PCR, garantendo una rilevazione accurata degli sgRNA e un'identificazione robusta dei bersagli genici funzionali.

Migliorare gli schermi CRISPR-Cas9 nelle cellule CAR T: un metodo raffinato per la preparazione delle librerie

Koç University School of Medicine.  Qui presentiamo un protocollo per generare cellule chemoresistenti utilizzando un approccio di aumento della dose, seguito da uno screening basato su CRISPR/Cas9 utilizzando una libreria sgRNA focalizzata che mira ai modificatori epigenetici per identificare i regolatori della chemioresistenza acquisita. Il protocollo fornisce inoltre molteplici punti di ottimizzazione adattati a modelli cellulari chemoresistenti, offrendo un quadro solid...

Screening knockout a livello epigenomico basati su CRISPR-Cas9 su cellule chemoresistenti

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