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<table><tbody><tr><td>1.5 mL microtubes Axygen</td><td>Corning</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Falcon tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339651</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>6 well plate Falcon polystyrene microplate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp;08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid, 60%&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide 30%&nbsp; and bis-acrylamide solution, 29:1</td><td>Biorad</td><td>1610157</td><td></td></tr><tr><td>Aluminum fold</td><td>Reynolds&nbsp;</td><td>U07211R0</td><td></td></tr><tr><td>Amonium Persulfate (APS)</td><td>Merck</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Binocular stereomicroscope</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)&nbsp;</td><td>Merck</td><td>&nbsp;A9418</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Merck</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>DelltaVision microscope</td><td>Olympus</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Distilled H2O</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Filter Units with PES filters of 0.45 &mu;m pore</td><td>Thermo Fisher Scientific/Nalgene</td><td>09-740-63B</td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps FST Dumont SS</td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td>11200-33</td><td></td></tr><tr><td>goat (IgG H+L) highly cross-adsorbed&nbsp; anti-rat labelled by AlexaFluor647</td><td>Invitrogen</td><td>A-21247</td><td></td></tr><tr><td>goat (IgG H+L) highly cross-adsorbed anti-rabbit labelled by AlexaFluor568</td><td>Invitrogen</td><td>A-21428</td><td></td></tr><tr><td>goat (IgG H+L) highly cross-adsorbed anti-guinea pig labelled by AlexaFluor488&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-11073</td><td></td></tr><tr><td>Gloves</td><td>Merck</td><td>Z412392</td><td></td></tr><tr><td>Growing chambers / greenhouse / or field</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Merck</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Masking tape 3M</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-047-259</td><td></td></tr><tr><td>Maize seeds</td><td>NA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope 22 x 22 mm-1,5 glass coverslips&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>Microscope 22 x 22 mm-H coverslips&nbsp;</td><td>Deckgläser, Zeiss</td><td>474030-9020-000</td><td></td></tr><tr><td>Microscopic glass slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-230-900</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slide box</td><td>Fisher Scientific,</td><td>03-448-9</td><td></td></tr><tr><td>Micropipets P20, P200, P1000</td><td>Merck</td><td>CLS4069</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Nail polish</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>Paper towels</td><td>Merck</td><td>Z188956</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Merck</td><td>P7668</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde 16% solution&nbsp;</td><td>Electron Microscopy Grade</td><td>&nbsp;15710</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Merck</td><td>P4474</td><td></td></tr><tr><td>Plastic box with lid</td><td>Tupperware</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Merck</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Primary antibodies (rat anti-ZmAFD1, rabbit anti-ZmASY1, guinea-pig anti ZmZYP1)</td><td>NA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prolong Antifading</td><td>Molecular Probes</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish (D x H: 35 mm x 10 mm</td><td>Corning</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish regular size</td><td>Merck</td><td>P5731</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Merck</td><td>P1851</td><td></td></tr><tr><td>Pipet tips (0.5-10 uL) sterile&nbsp;</td><td>Merck/Corning</td><td>AXYT300</td><td></td></tr><tr><td>Pipet tips (200 uL) sterile</td><td>Merck/Corning</td><td>AXYT200Y&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pipet tips (1000 uL) sterile</td><td>Merck/Corning</td><td>AXYT1000BRS</td><td></td></tr><tr><td>Razor blade - single edged</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Rocking platform shaker</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Spermine</td><td>Merck</td><td>85590</td><td></td></tr><tr><td>Spermidine&nbsp;</td><td>Merck</td><td>S2626</td><td></td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Merck</td><td>S8143</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Merck</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Ultra pure Acrylamide</td><td>Invitrogen</td><td>15512023</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

immunolocalizzazione tridimensionale nei meiociti del mais

Three-Dimensional Immunolocalization In Maize Meiocytes

Immunolocalizzazione tridimensionale nei meiociti del mais

During meiotic prophase I, the physical configuration of chromosomes varies widely across developmental stages, fortunately these stage-specific ...

La nostra ricerca si concentra sullo sviluppo di un approccio tridimensionale per lo studio dei meiociti maschili del mais e la visualizzazione delle proteine meiotiche in singole cellule. Oltre al mais, questo protocollo può essere applicato allo studio dei meiociti in riso, segale, orzo e frumento. Per iniziare, procurarsi piante di mais allo stadio V13 con infiorescenze ancora in crescita all'interno del fusto.Nella settimana della fissazione degli anteri in metafase, premere delicatamente il fusto ingrossato nel rigonfiamento indossando guanti per verificare se è abbastanza morbido da poter essere aperto. Dopo aver preparato i tamponi necessari, preparare una camera umida posizionando da cinque a dieci tovaglioli di carta inumiditi all'interno di una scatola di plastica. Rimuovere l'acqua in eccesso dalla camera.Utilizzando una lametta, aprire il fusto al livello dell'infiorescenza per esporre i rami dello spigo e i rami laterali. Dopo aver dissezionato e raccolto i rami laterali, avvolgerli in salviette umide all'interno di una camera umida, mantenendo la camera a temperatura ambiente. Utilizzando un microscopio stereoscopico, raccogliere gli anteri freschi dai fiori in una piastra di Petri da 35 millimetri contenente due millilitri di buffer A 1X o BA. Identificare le fasi mitotiche in base a dimensione e colore.Dopo aver trasferito le antere in una nuova piastra di Petri da 35 millimetri, aggiungere tre millilitri di soluzione fissativa alle antere. Sigillare la piastra di Petri con parafilm per prevenire l'evaporazione della formaldeide. Posizionare la piastra di Petri da 35 millimetri su quella più grande posta su uno shaker rotatorio, impostato a 40-60 giri al minuto a temperatura ambiente per 45 minuti.Lavare le antere con tre millilitri di 1 XBA. Dopo aver trasferito le antere in una piccola piastra di Petri, sigillare la piastra e posizionarla su un agitatore rotatorio a temperatura ambiente per 45 minuti, con la velocità impostata tra 40 e 60 giri al minuto. Utilizzando pinzette pulite, trasferire le antere in una piccola piastra di Petri da 35 millimetri contenente tre millilitri di 1 XBA.Dopo aver sigillato accuratamente la piastra di Petri con della pellicola parafilm, posizionare la piastra piccola all'interno di una piastra più grande. Dopo averla coperta con della carta d'alluminio, conservare il campione a quattro gradi Celsius fino al momento dell'uso. Nel primo giorno, preparare due millilitri di soluzione di acrilamide mescolando volumi uguali di acrilamide e due XBA.Depurare la soluzione di acrilammide sotto vuoto per cinque-dieci minuti prima di aggiungere il solfito di sodio e il persolfato di ammonio. Aliquotare 100 microlitri di una miscela uno a uno di acrilammide e due XBA in provette da 1,5 millilitro in base al numero di vetrini preparati. Posizionare pezzi di parafilm di due centimetri per due centimetri sopra una piastra di Petri e disporli sotto un microscopio stereoscopico da dissezione.Dopo aver tagliato la punta della pipetta con le forbici, prelevare 50 microlitri di soluzione BA con gli anteri sulla parafilm. Pipettare 25 microlitri di soluzione BA su un'altra area della parafilm. Dopo aver tenuto gli anteri con la pinzetta, utilizzando un bisturi, tagliarne le punte.Dopo aver estruso i meiociti, utilizzare una pipetta per trasferirli nella goccia di BA da 25 microlitri e mescolare delicatamente. Pipettare 10 microlitri della miscela di meiociti su un'altro coprioggetto. Aggiungere rapidamente cinque microlitri di solfito di sodio e cinque microlitri di perossosolfato di ammonio in un tubo da 1,5 millilitri contenente l'acrilamide e due XBA.Pipettare cinque microlitri di questa miscela sul vetrino e mescolarla con le meiociti. Posizionare un vetrino rivestito di poli-lisina sopra a un angolo di 45 gradi. Dopo aver lasciato polimerizzare completamente per 30-50 minuti a temperatura ambiente, separare con attenzione i vetri con una lametta.Quindi, posizionarli con il lato del pad rivolto verso l'alto in una piastra di Petri. Lavare il vetrino con un millilitro di PBS 1X integrato con un millimolare di acido etilendiamminotetraacetico, o EDTA, e 1% di Triton a temperatura ambiente per due ore. Preparare e combinare anticorpi primari provenienti da specie ospiti diverse per garantire segnali distinti durante la rilevazione.Aggiungere 50 microlitri dell'anticorpo primario diluito al centro del vetrino coprioggetto contenente il tampone. Successivamente, posizionare la piastra di Petri in una camera umidificata per tutta la notte. Al secondo giorno, preparare 500 millilitri di soluzione di lavaggio contenente un XPBS, 0,1% di Tween 20 e un millimolare di EDTA.Utilizzando una pipetta, rimuovere la soluzione overnight. Lavare il coprivetrino due volte con un millilitro di buffer di lavaggio. Dopo aver rimosso il buffer, aggiungere nuovamente un millilitro di buffer di lavaggio e incubare per un'ora a temperatura ambiente.Ripetere questo passaggio di lavaggio altre sette volte. Dopo l'ultimo lavaggio, coprire la piastra e lasciarla tutta la notte in una camera umida. Preparare gli anticorpi secondari diluendoli in un rapporto di uno a 50 nel buffer di blocco.Dopo aver rimosso la soluzione di lavaggio, aggiungere 50 microlitri dell'anticorpo secondario diluito al centro di ogni tampone. Successivamente, posizionare la piastra di Petri in una camera umida per due ore a temperatura ambiente. Dopo aver rimosso la soluzione dal pozzetto, lavare quattro volte con un millilitro di tampone di lavaggio per un'ora ciascuno a temperatura ambiente.Lavare il pozzetto con un millilitro di PBS per 10 minuti e ripetere questo processo altre due volte. Aggiungere 500 microlitri di DAPI, preparato a una concentrazione finale di un microgrammo per millilitro, nel pozzetto e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver rimosso la prolungata gold da quattro gradi Celsius, farla scongelare fino a raggiungere la temperatura ambiente.Lavare i vetrini con un millilitro di PBS per 30 minuti e ripetere due volte. Dopo aver rimosso la soluzione di lavaggio finale, aggiungere due gocce di agente antifade prolungato al centro del pad. Una volta sollevato il coprioggetto dalla pozzetta, montarlo sui vetrini etichettati.Utilizzando il vuoto, rimuovere l'eccesso di glicerolo dai bordi del vetrino e sigillare con due strati di vernice per unghie. Osservare i vetrini al microscopio utilizzando lunghezze d'onda di eccitazione e filtri appropriati per acquisire le immagini. La colorazione con DAPI ha mostrato un nucleo ben definito e una marcatura del cromatina, insieme a una colorazione citoplasmatica più tenue del DNA dei plastidi e dei mitocondri.Assenza di assenza della divisione uno o AFD1, asinaptica uno o ASY1 e Zipper1 o ZYP1 localizzati sui cromosomi e nel citoplasma durante la preleptotene. In stadi successivi, il segnale si concentrò sui cromosomi, mentre una quantità significativa di ZYP1 rimase nel citoplasma prima della sinapsi completa. La coesina meiotica AFD1 formò una struttura lineare solo dopo la zigotene.Contemporaneamente alla formazione dei filamenti lineari del complesso sinaptinemico. Il segnale ASY1 divenne relativamente debole dopo che ZYP1 e AFD1 furono caricati nelle strutture lineari. Questo protocollo consente ai ricercatori di studiare la co-localizzazione e la dinamica delle proteine, la localizzazione subcellulare nativa, l'architettura cromosomica tridimensionale, il progresso meiotico e le fasi della meiosi.La sfida principale di questo protocollo consiste nella selezione accurata di combinazioni compatibili di anticorpi primari e secondari. Studi futuri possono basarsi su questo lavoro confrontando la meiosi maschile e femminile per indagare il meccanismo molecolare alla base dell'atelcasmia.

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Biology

Biologia

Ibridazione in situ per la localizzazione precisa delle Trascrizioni nelle piante

Un modo per acquisire nuove conoscenze nella complessità della risposta infiammatoria del cervello è presentato. Descriviamo protocolli basati immunofluorescenza-seguita da analisi confocale tridimensionale per indagare il pattern di co-espressione di marcatori fenotipici microglia / macrofagi in un modello murino di ischemia focale.

Tridimensionale confocale Analisi dei marcatori microglia / macrofagi di polarizzazione in Experimental Brain Injury

Ad alta risoluzione intravital immagini con maggiore contrasto fino a 120 micron di profondità in linfonodi di topi adulti si ottiene spazialmente modulando il pattern di eccitazione di un microscopio a due fotoni multifocale. In 100 micron di profondità abbiamo misurato risoluzioni di 487 nm (laterali) e 551 nm (assiale), eludendo così dispersione e diffrazione limiti.

Altamente Risolto intravitale Striped-illuminazione Microscopia dei Centri Germinal

Il protocollo immunofluorescenza indiretta descritto in questo articolo consente il rilevamento e la localizzazione delle proteine ​​nella ghiandola mammaria del mouse. Un metodo completo è dato per la preparazione di campioni della ghiandola mammaria, per eseguire immunoistochimica, per l'immagine delle sezioni di tessuto al microscopio a fluorescenza, e di ricostruire le immagini.

Immunofluorescenza indiretta su sezioni congelate di mouse ghiandola mammaria

Sviluppo di ciglia è vitale per l'organogenesi corretto. Questo protocollo descrive un metodo ottimizzato per etichettare e visualizzare le cellule ciliate di zebrafish.

Visualizzazione di cellule Multiciliated in Zebrafish attraverso un protocollo combinato di tutta Monte fluorescente ibridazione In Situ e immunofluorescenza

Questo protocollo presenta come immagine live e analizzare i meristemi apicali di sparare da specie diverse di piante mediante microscopia confocale a scansione laser.

Formazione immagine confocal Live dei meristemi apicali riprese da diverse specie di piante

Presentiamo qui un protocollo migliorato per la preparazione a montaggio intero e l'immunostaining dei tester Drosophila, adatto per la microscopia confocale e che consente anche un'etichettatura riproducibile e affidabile. Illustriamo questo protocollo attraverso la rappresentazione 3D e la quantificazione degli esperimenti di colocalizzazione sui grandi spermatociti S4-S5.

Immunostaining dei test di Drosophila a montaggio intero per l'analisi confocale 3D di grandi spermatociti

Viene presentato un protocollo di iniezione (agroiniezione) a base di Agrobacterium per l'inoculazione del virus del mosaico a coda di volpe e dei virus del mosaico della canna da zucchero in piantine di mais. L'inoculazione in questo modo porta a infezioni virali, silenziamento genico indotto da virus di geni marcatori e sovraespressione virale di GFP.

Agroinoculazione diretta di piantine di mais per iniezione con cloni infettivi del virus del mosaico della coda di volpe ricombinante e virus del mosaico della canna da zucchero

I primordi delle foglie di mais sono profondamente inguainati e arrotolati, rendendoli difficili da studiare. Qui presentiamo metodi per la preparazione di sezioni trasversali e supporti interi srotolati di primordi di foglie di mais per la fluorescenza e l'imaging confocale.

Metodi migliorati per la preparazione di sezioni trasversali e supporti interi srotolati di Primordia di foglie di mais per fluorescenza e imaging confocale

Questo manoscritto descrive in dettaglio un protocollo di inoculazione ottimizzato che utilizza guaine fogliari di mais staccate per studi citologici, fisiologici e molecolari riproducibili delle interazioni del mais con i patogeni fungini delle piante. Le guaine fogliari facilitano l'osservazione in tempo reale delle interazioni cellulari tra la pianta vivente e il fungo nei tessuti non fissati.

Guaine di mais staccate per l'imaging su cellule vive dell'infezione da patogeni fungini del mais fogliare

Il movimento cromosomico durante la profase meiotica è un fenomeno poco compreso che è fondamentale per la formazione delle spore. Questo protocollo descrive un metodo per acquisire, analizzare e quantificare i movimenti del centromero durante la profase meiotica nei meiociti maschi di Arabidopsis thaliana .

Caratterizzazione con imaging dal vivo dei movimenti del centromero durante la profase meiotica maschile in Arabidopsis thaliana

255 Views.  National Autonomous University of Mexico (UNAM). La nostra ricerca si concentra sullo sviluppo di un approccio 3D per studiare i meiociti maschili del mais e visualizzare le proteine meiotiche in singole cellule. Oltre al mais, questo protocollo può essere applicato per studiare i meiociti nel riso, segale, orzo, frumento. Per iniziare, ottenere piante di mais allo stadio V13 con influorescenze ancora in crescita all'interno dello stelo.Durante la settimana di fissazione degli anteri meiotici, premere delicatamente lo stelo ingrossa...

Immunolocalizzazione tridimensionale nei meiociti del mais

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