Immunolocalizzazione tridimensionale nei meiociti del mais

La nostra ricerca si concentra sullo sviluppo di un approccio tridimensionale per lo studio dei meiociti maschili del mais e la visualizzazione delle proteine meiotiche in singole cellule. Oltre al mais, questo protocollo può essere applicato allo studio dei meiociti in riso, segale, orzo e frumento. Per iniziare, procurarsi piante di mais allo stadio V13 con infiorescenze ancora in crescita all'interno del fusto.

Nella settimana della fissazione degli anteri in metafase, premere delicatamente il fusto ingrossato nel rigonfiamento indossando guanti per verificare se è abbastanza morbido da poter essere aperto. Dopo aver preparato i tamponi necessari, preparare una camera umida posizionando da cinque a dieci tovaglioli di carta inumiditi all'interno di una scatola di plastica. Rimuovere l'acqua in eccesso dalla camera.

Utilizzando una lametta, aprire il fusto al livello dell'infiorescenza per esporre i rami dello spigo e i rami laterali. Dopo aver dissezionato e raccolto i rami laterali, avvolgerli in salviette umide all'interno di una camera umida, mantenendo la camera a temperatura ambiente. Utilizzando un microscopio stereoscopico, raccogliere gli anteri freschi dai fiori in una piastra di Petri da 35 millimetri contenente due millilitri di buffer A 1X o BA. Identificare le fasi mitotiche in base a dimensione e colore.

Dopo aver trasferito le antere in una nuova piastra di Petri da 35 millimetri, aggiungere tre millilitri di soluzione fissativa alle antere. Sigillare la piastra di Petri con parafilm per prevenire l'evaporazione della formaldeide. Posizionare la piastra di Petri da 35 millimetri su quella più grande posta su uno shaker rotatorio, impostato a 40-60 giri al minuto a temperatura ambiente per 45 minuti.

Lavare le antere con tre millilitri di 1 XBA. Dopo aver trasferito le antere in una piccola piastra di Petri, sigillare la piastra e posizionarla su un agitatore rotatorio a temperatura ambiente per 45 minuti, con la velocità impostata tra 40 e 60 giri al minuto. Utilizzando pinzette pulite, trasferire le antere in una piccola piastra di Petri da 35 millimetri contenente tre millilitri di 1 XBA.

Dopo aver sigillato accuratamente la piastra di Petri con della pellicola parafilm, posizionare la piastra piccola all'interno di una piastra più grande. Dopo averla coperta con della carta d'alluminio, conservare il campione a quattro gradi Celsius fino al momento dell'uso. Nel primo giorno, preparare due millilitri di soluzione di acrilamide mescolando volumi uguali di acrilamide e due XBA.

Depurare la soluzione di acrilammide sotto vuoto per cinque-dieci minuti prima di aggiungere il solfito di sodio e il persolfato di ammonio. Aliquotare 100 microlitri di una miscela uno a uno di acrilammide e due XBA in provette da 1,5 millilitro in base al numero di vetrini preparati. Posizionare pezzi di parafilm di due centimetri per due centimetri sopra una piastra di Petri e disporli sotto un microscopio stereoscopico da dissezione.

Dopo aver tagliato la punta della pipetta con le forbici, prelevare 50 microlitri di soluzione BA con gli anteri sulla parafilm. Pipettare 25 microlitri di soluzione BA su un'altra area della parafilm. Dopo aver tenuto gli anteri con la pinzetta, utilizzando un bisturi, tagliarne le punte.

Dopo aver estruso i meiociti, utilizzare una pipetta per trasferirli nella goccia di BA da 25 microlitri e mescolare delicatamente. Pipettare 10 microlitri della miscela di meiociti su un'altro coprioggetto. Aggiungere rapidamente cinque microlitri di solfito di sodio e cinque microlitri di perossosolfato di ammonio in un tubo da 1,5 millilitri contenente l'acrilamide e due XBA.

Pipettare cinque microlitri di questa miscela sul vetrino e mescolarla con le meiociti. Posizionare un vetrino rivestito di poli-lisina sopra a un angolo di 45 gradi. Dopo aver lasciato polimerizzare completamente per 30-50 minuti a temperatura ambiente, separare con attenzione i vetri con una lametta.

Quindi, posizionarli con il lato del pad rivolto verso l'alto in una piastra di Petri. Lavare il vetrino con un millilitro di PBS 1X integrato con un millimolare di acido etilendiamminotetraacetico, o EDTA, e 1% di Triton a temperatura ambiente per due ore. Preparare e combinare anticorpi primari provenienti da specie ospiti diverse per garantire segnali distinti durante la rilevazione.

Aggiungere 50 microlitri dell'anticorpo primario diluito al centro del vetrino coprioggetto contenente il tampone. Successivamente, posizionare la piastra di Petri in una camera umidificata per tutta la notte. Al secondo giorno, preparare 500 millilitri di soluzione di lavaggio contenente un XPBS, 0,1% di Tween 20 e un millimolare di EDTA.

Utilizzando una pipetta, rimuovere la soluzione overnight. Lavare il coprivetrino due volte con un millilitro di buffer di lavaggio. Dopo aver rimosso il buffer, aggiungere nuovamente un millilitro di buffer di lavaggio e incubare per un'ora a temperatura ambiente.

Ripetere questo passaggio di lavaggio altre sette volte. Dopo l'ultimo lavaggio, coprire la piastra e lasciarla tutta la notte in una camera umida. Preparare gli anticorpi secondari diluendoli in un rapporto di uno a 50 nel buffer di blocco.

Dopo aver rimosso la soluzione di lavaggio, aggiungere 50 microlitri dell'anticorpo secondario diluito al centro di ogni tampone. Successivamente, posizionare la piastra di Petri in una camera umida per due ore a temperatura ambiente. Dopo aver rimosso la soluzione dal pozzetto, lavare quattro volte con un millilitro di tampone di lavaggio per un'ora ciascuno a temperatura ambiente.

Lavare il pozzetto con un millilitro di PBS per 10 minuti e ripetere questo processo altre due volte. Aggiungere 500 microlitri di DAPI, preparato a una concentrazione finale di un microgrammo per millilitro, nel pozzetto e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver rimosso la prolungata gold da quattro gradi Celsius, farla scongelare fino a raggiungere la temperatura ambiente.

Lavare i vetrini con un millilitro di PBS per 30 minuti e ripetere due volte. Dopo aver rimosso la soluzione di lavaggio finale, aggiungere due gocce di agente antifade prolungato al centro del pad. Una volta sollevato il coprioggetto dalla pozzetta, montarlo sui vetrini etichettati.

Utilizzando il vuoto, rimuovere l'eccesso di glicerolo dai bordi del vetrino e sigillare con due strati di vernice per unghie. Osservare i vetrini al microscopio utilizzando lunghezze d'onda di eccitazione e filtri appropriati per acquisire le immagini. La colorazione con DAPI ha mostrato un nucleo ben definito e una marcatura del cromatina, insieme a una colorazione citoplasmatica più tenue del DNA dei plastidi e dei mitocondri.

Assenza di assenza della divisione uno o AFD1, asinaptica uno o ASY1 e Zipper1 o ZYP1 localizzati sui cromosomi e nel citoplasma durante la preleptotene. In stadi successivi, il segnale si concentrò sui cromosomi, mentre una quantità significativa di ZYP1 rimase nel citoplasma prima della sinapsi completa. La coesina meiotica AFD1 formò una struttura lineare solo dopo la zigotene.

Contemporaneamente alla formazione dei filamenti lineari del complesso sinaptinemico. Il segnale ASY1 divenne relativamente debole dopo che ZYP1 e AFD1 furono caricati nelle strutture lineari. Questo protocollo consente ai ricercatori di studiare la co-localizzazione e la dinamica delle proteine, la localizzazione subcellulare nativa, l'architettura cromosomica tridimensionale, il progresso meiotico e le fasi della meiosi.

La sfida principale di questo protocollo consiste nella selezione accurata di combinazioni compatibili di anticorpi primari e secondari. Studi futuri possono basarsi su questo lavoro confrontando la meiosi maschile e femminile per indagare il meccanismo molecolare alla base dell'atelcasmia.