Name: Ricostituzione dellassemblaggio di actina ramificata mediato dalla miosina-I in un saggio di motilità della coda di cometa di actina basato su microsfere (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-09-03T13:05:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Scopri un saggio di motilità della coda di cometa di actina per studiare l'interazione tra miosina-I, actina e il complesso Arp2/3. Questo metodo permette analisi quantitative dell'assemblaggio della rete di actina e della generazione di forza.

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Ringraziamo il dottor Daniel Safer e Rick Wike per l'eccellente assistenza tecnica nella purificazione delle proteine. Ringraziamo il dottor Roberto Dominguez, in particolare la dottoressa Malgorzata Boczkowska e il dottor Grzegorz Rebowski, per aver generosamente fornito il complesso Arp2/3 e le proteine CapZ. Ringraziamo inoltre il dottor Luther Pollard, la dottoressa Faviolla A. Báez-Cruz e tutti i membri dei laboratori Ostap e Dominguez per i preziosi contributi durante tutto il progetto. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione degli Istituti Nazionali di Sanità R37 GM057247 (a E.M.O.). E.M.O. e M.X. sono stati parzialmente sostenuti dalla National Science Foundation (CMMI-1548571). ChatGPT è stato utilizzato per assistere nella revisione linguistica durante la preparazione del manoscritto. Gli autori hanno esaminato e modificato tutti i contenuti assistiti dall'intelligenza artificiale e si assumono piena responsabilità per il manoscritto finale.

<ol>
	<li>Blanchoin L, Boujemaa-Paterski R, Sykes C, Plastino J. Actin dynamics, architecture, and mechanics in cell motility. Physiol Rev. 2014;94(1):235-63.</li>
	<li>Svitkina T. The actin cytoskeleton and actin-based motility. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2018;10(1).</li>
	<li>Papalazarou V, Machesky LM. The cell pushes back: The Arp2/3 complex is a key orchestrator of cellular responses to environmental forces. Curr Opin Cell Biol. 2021;68:37-44.</li>
	<li>Krendel M, Gauthier NC. Building the phagocytic cup on an actin scaffold. Curr Opin Cell Biol. 2022;77:102112.</li>
	<li>Yang C, et al. Actin polymerization promotes invagination of flat clathrin-coated lattices in mammalian cells by pushing at lattice edges. Nat Commun. 2022;13(1):6127.</li>
	<li>Clarke DN, Martin AC. Actin-based force generation and cell adhesion in tissue morphogenesis. Curr Biol. 2021;31(10):R667-R80.</li>
	<li>McConnell RE, Tyska MJ. Leveraging the membrane-cytoskeleton interface with myosin-1. Trends Cell Biol. 2010;20(7):418-26.</li>
	<li>Almeida CG, et al. Myosin 1b promotes the formation of post-Golgi carriers by regulating actin assembly and membrane remodelling at the trans-Golgi network. Nat Cell Biol. 2011;13(7):779-89.</li>
	<li>McIntosh BB, Ostap EM. Myosin-I molecular motors at a glance. J Cell Sci. 2016;129(14):2689-95.</li>
	<li>Pedersen RTA, Drubin DG. Type I myosins anchor actin assembly to the plasma membrane during clathrin-mediated endocytosis. J Cell Biol. 2019;218(4):1138-47.</li>
	<li>Barger SR, et al. Membrane-cytoskeletal crosstalk mediated by myosin-I regulates adhesion turnover during phagocytosis. Nat Commun. 2019;10(1):1249.</li>
	<li>Manenschijn HE, et al. Type-I myosins promote actin polymerization to drive membrane bending in endocytosis. eLife. 2019;8.</li>
	<li>Smith SL, et al. Class-I myosin responds to changes in membrane tension during clathrin-mediated endocytosis in human induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2026;123(9):e2532817123.</li>
	<li>Loisel TP, Boujemaa R, Pantaloni D, Carlier MF. Reconstitution of actin-based motility of Listeria and Shigella using pure proteins. Nature. 1999;401(6753):613-6.</li>
	<li>Akin O, Mullins RD. Capping protein increases the rate of actin-based motility by promoting filament nucleation by the Arp2/3 complex. Cell. 2008;133(5):841-51.</li>
	<li>Boujemaa-Paterski R, et al. Directed actin assembly and motility. Methods Enzymol. 2014;540:283-300.</li>
	<li>Sykes C, Plastino J. Reconstitution of actin-based motility with commercially available proteins. J Vis Exp. 2022;(188).</li>
	<li>Xu M, et al. Myosin-I synergizes with Arp2/3 complex to enhance the pushing forces of branched actin networks. Sci Adv. 2024;10(37):eado5788.</li>
	<li>Kawska A, et al. How actin network dynamics control the onset of actin-based motility. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012;109(36):14440-5.</li>
	<li>Cameron LA, Footer MJ, van Oudenaarden A, Theriot JA. Motility of ActA protein-coated microspheres driven by actin polymerization. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999;96(9):4908-13.</li>
	<li>Bernheim-Groswasser A, et al. The dynamics of actin-based motility depend on surface parameters. Nature. 2002;417(6886):308-11.</li>
	<li>van der Gucht J, Paluch E, Plastino J, Sykes C. Stress release drives symmetry breaking for actin-based movement. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102(22):7847-52.</li>
	<li>Achard V, et al. A &#34;primer&#34;-based mechanism underlies branched actin filament network formation and motility. Curr Biol. 2010;20(5):423-8.</li>
	<li>Noireaux V, et al. Growing an actin gel on spherical surfaces. Biophys J. 2000;78(3):1643-54.</li>
	<li>Theriot JA, Mitchison TJ, Tilney LG, Portnoy DA. The rate of actin-based motility of intracellular Listeria monocytogenes equals the rate of actin polymerization. Nature. 1992;357(6375):257-60.</li>
	<li>Bieling P, et al. WH2 and proline-rich domains of WASP-family proteins collaborate to accelerate actin filament elongation. EMBO J. 2018;37(1):102-21.</li>
	<li>Funk J, et al. A barbed end interference mechanism reveals how capping protein promotes nucleation in branched actin networks. Nat Commun. 2021;12(1):5329.</li>
	<li>Gautreau AM, Fregoso FE, Simanov G, Dominguez R. Nucleation, stabilization, and disassembly of branched actin networks. Trends Cell Biol. 2022;32(5):421-32.</li>
	<li>Nakamura F, Osborn E, Janmey PA, Stossel TP. Comparison of filamin A-induced cross-linking and Arp2/3 complex-mediated branching on the mechanics of actin filaments. J Biol Chem. 2002;277(11):9148-54.</li>
	<li>Colin A, et al. Friction patterns guide actin network contraction. Proc Natl Acad Sci U S A. 2023;120(39):e2300416120.</li>
	<li>Colin A, et al. Recycling of the actin monomer pool limits the lifetime of network turnover. EMBO J. 2023;42(9):e112717.</li>
	<li>Suarez C, et al. Reconstitution of the transition from a lamellipodia- to filopodia-like actin network with purified proteins. Eur J Cell Biol. 2023;102(4):151367.</li>
	<li>Pollard LW, Boczkowska M, Dominguez R, Ostap EM. Myosin-1C differentially displaces tropomyosin isoforms altering their inhibition of motility. J Biol Chem. 2024;300(8):107539.</li>
	<li>Thompson CP, et al. Non-muscle tropomyosins inhibit myosin-19 and dynamically localize to mitochondrially associated actin filaments. J Biol Chem. 2026;302(5):111377.</li>
	<li>Bussonnier M, et al. Mechanical detection of a long-range actin network emanating from a biomimetic cortex. Biophys J. 2014;107(4):854-62.</li>
	<li>Paluch E, van der Gucht J, Joanny JF, Sykes C. Deformations in actin comets from rocketing beads. Biophys J. 2006;91(8):3113-22.</li>
	<li>Lewis JH, Lin T, Hokanson DE, Ostap EM. Temperature dependence of nucleotide association and kinetic characterization of Myo1b. Biochemistry. 2006;45(38):11589-97.</li>
	<li>Baez-Cruz FA, Ostap EM. Drosophila class-I myosins that can impact left-right asymmetry have distinct ATPase kinetics. J Biol Chem. 2023;299(8):104961.</li>
	<li>Lin T, Tang N, Ostap EM. Biochemical and motile properties of Myo1b splice isoforms. J Biol Chem. 2005;280(50):41562-7.</li>
	<li>Lebreton G, et al. Molecular to organismal chirality is induced by the conserved myosin 1D. Science. 2018;362(6417):949-52.</li>
	<li>Spudich JA, Watt S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. J Biol Chem. 1971;246(15):4866-71.</li>
	<li>Boczkowska M, et al. X-ray scattering study of activated Arp2/3 complex with bound actin-WCA. Structure. 2008;16(5):695-704.</li>
	<li>Rao JN, Madasu Y, Dominguez R. Mechanism of actin filament pointed-end capping by tropomodulin. Science. 2014;345(6195):463-7.</li>
	<li>Putkey JA, Slaughter GR, Means AR. Bacterial expression and characterization of proteins derived from the chicken calmodulin cDNA and a calmodulin processed gene. J Biol Chem. 1985;260(8):4704-12.</li>
	<li>Schindelin J, et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 2012;9(7):676-82.</li>
	<li>Greenberg MJ, Ostap EM. Regulation and control of myosin-I by the motor and light chain-binding domains. Trends Cell Biol. 2013;23(2):81-9.</li>
	<li>Lewis JH, et al. Calcium regulation of myosin-I tension sensing. Biophys J. 2012;102(12):2799-807.</li>
	<li>Manceva S, et al. Calcium regulation of calmodulin binding to and dissociation from the Myo1c regulatory domain. Biochemistry. 2007;46(42):11718-26.</li>
	<li>Mullins RD, Bieling P, Fletcher DA. From solution to surface to filament: actin flux into branched networks. Biophys Rev. 2018;10(6):1537-51.</li>
	<li>Mooren OL, et al. Reconstitution of Arp2/3-nucleated actin assembly with proteins CP, V-1, and CARMIL. Curr Biol. 2024;34(22):5173-86.e4.</li>
	<li>Pollard LW, et al. Genetically inspired in vitro reconstitution of Saccharomyces cerevisiae actin cables from seven purified proteins. Mol Biol Cell. 2020;31(5):335-47.</li>
	<li>Marcy Y, Prost J, Carlier MF, Sykes C. Forces generated during actin-based propulsion: a direct measurement by micromanipulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004;101(16):5992-7.</li>
	<li>Dayel MJ, et al. In silico reconstitution of actin-based symmetry breaking and motility. PLoS Biol. 2009;7(9):e1000201.</li>
	<li>Hammer JA 3rd, Sellers JR. Walking to work: roles for class V myosins as cargo transporters. Nat Rev Mol Cell Biol. 2011;13(1):13-26.</li>
	<li>Buss F, Kendrick-Jones J. How are the cellular functions of myosin VI regulated within the cell. Biochem Biophys Res Commun. 2008;369(1):165-75.</li>
	<li>Spudich JA, Sivaramakrishnan S. Myosin VI: an innovative motor that challenged the swinging lever arm hypothesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 2010;11(2):128-37.</li>
	<li>Self T, et al. Shaker-1 mutations reveal roles for myosin VIIA in both development and function of cochlear hair cells. Development. 1998;125(4):557-66.</li>
	<li>Crawley SW, et al. Intestinal brush border assembly driven by protocadherin-based intermicrovillar adhesion. Cell. 2014;157(2):433-46.</li>
	<li>Houdusse A, Titus MA. The many roles of myosins in filopodia, microvilli and stereocilia. Curr Biol. 2021;31(10):R586-R602.</li>
	<li>Bohil AB, Robertson BW, Cheney RE. Myosin-X is a molecular motor that functions in filopodia formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006;103(33):12411-6.</li>
	<li>Fitz GN, et al. Protrusion growth driven by myosin-generated force. Dev Cell. 2023;58(1):18-33.</li>
	<li>Quintero OA, et al. Human Myo19 is a novel myosin that associates with mitochondria. Curr Biol. 2009;19(23):2008-13.</li>
	<li>Zimmet A, et al. Cryo-EM structure of NPF-bound human Arp2/3 complex and activation mechanism. Sci Adv. 2020;6(23):eaaz7651.</li>
	<li>Giardini PA, Fletcher DA, Theriot JA. Compression forces generated by actin comet tails on lipid vesicles. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003;100(11):6493-8.</li>
	<li>Upadhyaya A, Chabot JR, Andreeva A, Samadani A, van Oudenaarden A. Probing polymerization forces by using actin-propelled lipid vesicles. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003;100(8):4521-6.</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in conflitto o altri conflitti di interesse.

Il saggio di motilità delle perle con coda a cometa di actina è un sistema ben consolidato di ricostruzione in vitro per studiare l'assemblaggio ramificato dell'actina mediato dal complesso Arp2/3 e il suo ruolo nella generazione di forze protrusive14,15,16,17. Questo sistema è stato ampiamente utilizzato per analizzare la regolazione biochimica dell'assemblaggio ramificato dell'actina14,15,26,27,31,49,50,51 e la generazione di forze20,21,22,23,52, fornendo al contempo un quadro per studi quantitativi delle proprietà emergenti della materia attiva nelle reti di actina19,35,36,53. Incorporando la miosina, in particolare la miosina-I18, in questo sistema ricostruito, il saggio modificato consente di indagare come l'accoppiamento miosina-actina moduli l'assemblaggio dell'actina e la produzione di forza all'interfaccia della membrana, un ambito ancora relativamente poco esplorato. In particolare, la miosina-I in questo sistema può essere facilmente sostituita da altri motori della miosina per esaminarne i rispettivi ruoli nel rimodellamento della rete di actina e nella generazione di forze. Ad esempio, potrebbero essere incorporate la miosina V (trasporto di carichi)54, la miosina VI (traffico endocitico e dinamica della membrana)55,56, la miosina VII e XV (organizzazione delle stereociglia e dei microvilli)57,58,59, la miosina X (formazione dei filopodi)60,61 e la miosina XIX (dinamica mitocondriale)62 per studiare come diverse classi di miosina contribuiscano all'organizzazione dell'actina e ai processi fisiologici ad essa associati.
Il saggio è altamente riproducibile a condizione che diversi parametri critici siano attentamente controllati. In primo luogo, la presenza di G-actina monomerica di alta qualità è essenziale per una robusta formazione delle code a cometa. Si raccomanda di purificare la G-actina da polvere di acetone di muscolo scheletrico di coniglio seguendo protocolli consolidati41. Dopo 2–3 giorni di dialisi, l'actina monomerica dovrebbe essere ulteriormente purificata mediante filtrazione su gel con Sephacryl S-300 in G-buffer (2 mM Tris-HCl, pH 8.0; 0,2 mM ATP; 0,1 mM CaCl2; 1 mM NaN3; e 0,5 mM DTT). Vanno utilizzate le frazioni raccolte immediatamente dopo il picco di eluizione. La G-actina purificata mantiene tipicamente una forte attività di polimerizzazione per 2–3 settimane quando conservata ghiacciata a 4 °C e può rimanere utilizzabile fino alla quarta settimana, sebbene le prestazioni generalmente declinino successivamente. Una ridotta robustezza delle code a cometa, caratterizzata da reti di actina rade e fragili e da una crescita irregolare delle code, indica spesso una qualità compromessa dell'actina. In secondo luogo, l'attività delle proteine promotrici della nucleazione (NPF) determina in modo critico la formazione delle code a cometa. Il dominio WCA marcatto con GST di origine commerciale, derivato dalla proteina del sindrome di Wiskott-Aldrich neuronale umana (N-WASP) (GST-VCA), fornisce un'attività di nucleazione robusta e sostenuta, e la dimerizzazione del GST ne potenzia ulteriormente l'attività63. Si raccomanda di validare qualsiasi costrutto NPF mediante un saggio di polimerizzazione dell'actina marcata con pirène prima del rivestimento delle perle. L'attività del GST-VCA commerciale può essere utilizzata come standard di riferimento. È importante notare che il GST-VCA commerciale utilizzato in questo caso non contiene una regione poliprolinica e quindi non interagisce con i complessi profilina–actina26. In terzo luogo, una visualizzazione affidabile della crescita delle code a cometa richiede una preparazione accurata di vetrini e coprioggetti. Si raccomanda di pulire accuratamente vetrini e coprioggetti con acqua ed etanolo, seguita da una pulizia al plasma immediatamente prima dell'uso. Quando disponibili, i coprioggetti silanizzati con polietilenglicole26 sono preferibili poiché riducono al minimo l'adsorbimento non specifico delle proteine e migliorano la riproducibilità. L'inclusione di una concentrazione adeguata di BSA nella miscela di movimento può ulteriormente ridurre le interazioni superficiali non specifiche e favorire prestazioni costanti del saggio. In quarto luogo, il volume del campione applicato alla camera è fondamentale per misurazioni affidabili15,16,17. Un volume eccessivo del campione provoca la deriva delle perle, impedendo un tracciamento accurato dell'allungamento della coda a cometa. Al contrario, un volume insufficiente comprime le perle tra vetrino e coprioggetto, aumentando l'attrito e immobilizzando le perle. Questo vincolo meccanico può alterare la morfologia della coda a cometa e modificare la cinetica di crescita misurata. Pertanto, l'ottimizzazione sia dell'altezza della camera che del volume del campione è essenziale per ottenere risultati riproducibili. Si raccomanda di ottimizzare empiricamente il volume del campione per ogni configurazione sperimentale. Quando si utilizza un coprioggetto di dimensioni 22 mm × 22 mm come descritto qui, l'applicazione di 2,1–2,3 µL della miscela di movimento produce un'altezza della camera di circa 4,3 µm, garantendo un posizionamento stabile di perle con diametro di 2,0 µm senza deriva eccessiva o compressione.&#160;Quando si utilizza un coprioggetto di dimensioni diverse, il volume del campione deve essere adeguato di conseguenza per ottenere un riempimento uniforme della camera, un posizionamento stabile delle perle e una deriva minima del campione.
Se le code di cometa non si formano, verificare la capacità di polimerizzazione dell'actina e l'attività dei fattori di nucleazione (NPF). Se la rottura di simmetria non avviene, regolare la concentrazione di CP per modulare la densità della rete. Reti eccessivamente dense resistono alla frattura, mentre reti troppo rarefatte mancano di integrità strutturale. Se le perline rivestite di miosina non mostrano differenze rispetto alle perline di controllo, confermare la densità superficiale della miosina e l'attività del motore. Per il controllo di qualità, il criterio di accettazione è funzionale e non basato su una soglia numerica assoluta. Una nuova preparazione è considerata accettabile se,&#160;riproduce la formazione e la crescita delle code di cometa osservate con una preparazione precedentemente validata (come mostrato in&#160;Figura 3). Inoltre, ogni nuova preparazione di miosina, complesso Arp2/3, NPF, CapZ o actina deve essere valutata utilizzando i pertinenti saggi di controllo di qualità e confrontata con una preparazione precedentemente validata prima dell'uso, per garantire coerenza negli esperimenti quantitativi (vedere Sezione del protocollo 3.1).
Nell'interpretare i risultati, si devono considerare diversi limiti di questo saggio. In primo luogo, l'intensità di fluorescenza viene utilizzata come indicatore relativo e non calibrato della densità della rete di actina; pertanto, i confronti devono essere effettuati solo tra campioni acquisiti con impostazioni identiche e analizzati utilizzando lo stesso protocollo di sogliatura. In secondo luogo, la motilità delle perline, la crescita delle code a cometa e l'efficienza di crescita forniscono letture indirette del comportamento della rete generatrice di forza, ma non costituiscono misurazioni dirette della forza. Sono necessarie misurazioni meccaniche dirette, come il trappolamento ottico o i saggi di deformazione della membrana calibrati in forza64,65, per quantificare le forze prodotte dalla rete. In terzo luogo, questo saggio non risolve direttamente l'ultrastruttura della rete di actina, ad esempio l'orientamento dei filamenti, la densità delle ramificazioni o l'organizzazione locale della miosina.&#160;Approcci complementari, come la microscopia elettronica o l'imaging a super-risoluzione, potrebbero essere necessari per la caratterizzazione della struttura a scala nanometrica&#160;. Infine, l'uso di perline rigide di dimensioni micrometriche fornisce un'interfaccia semplificata e sperimentalmente gestibile, ma non riproduce la deformabilità, l'eterogeneità della curvatura, la mobilità lipidica o la complessità molecolare delle membrane cellulari. Lo sviluppo futuro di interfacce più fisiologicamente rilevanti sarà quindi fondamentale per indagare come i componenti del citoscheletro si coordinino nel bordo lamellare della cellula.
Nel complesso, questo approccio di ricostruzione consente un controllo preciso sulla composizione e concentrazione delle proteine, permettendo di analizzare meccanicamente singoli componenti in modi difficilmente ottenibili nei sistemi cellulari. Fornisce una piattaforma versatile per studiare come i motori molecolari rimodellino reti di actina ramificate e modulino la generazione di forza a interfacce simili a membrane. Con un'adeguata validazione, il saggio può essere esteso per esaminare come diverse classi di miosina, varianti mutanti o associate a malattie dei motori, e proteine leganti l'actina sensibili alla forza regolino il feedback meccanico all'interno di reti di actina dinamiche. Più in generale, questo sistema aiuta a collegare l'attività motoria su scala molecolare all'organizzazione citoscheletrica e alla funzione meccanica su scala mesoscopica, con implicazioni per la motilità cellulare, l'endocitosi e il rimodellamento della membrana.

La polimerizzazione dell'actina ramificata mediata dal complesso delle proteine correlate all'actina 2/3 (Arp2/3) genera le forze protrusive principali che guidano diversi processi cellulari, tra cui la motilità cellulare, l'endocitosi, la fagocitosi e la formazione di complessi di adesione cellulare1,2,3,4,5,6. Al bordo anteriore delle cellule in migrazione, i fattori che promuovono la nucleazione (NPF) attivano il complesso Arp2/3 sulla membrana plasmatica, avviando l'assemblaggio di una rete dendritica di actina che spinge in avanti la membrana. I motori della miosina-I spesso colocalizzano con queste reti di actina ramificata alle interfacce della membrana e sono coinvolti nella regolazione&#160;dell'organizzazione dell'actina&#160;e nella modulazione della generazione di forza7,8,9,10,11,12,13. Nonostante le crescenti evidenze del contributo della miosina-I ai processi meccanici dipendenti dall'actina, i meccanismi molecolari attraverso cui la miosina-I interagisce con l'assemblaggio ramificato dell'actina mediato da Arp2/3 per modulare l'architettura della rete e l'output meccanico rimangono poco chiari.
Per colmare questa lacuna, abbiamo incorporato la miosina-I nel ben consolidato sistema di motilità di perline con coda cometa di actina14,15,16,17 per ricostruire l'interazione tra miosina-I, actina e il complesso Arp2/3 sulla superficie di perline di dimensioni micrometriche. L'obiettivo generale di questo metodo è studiare quantitativamente in che modo l'accoppiamento miosina-actina influisce sull'assemblaggio dell'actina ramificata, sull'architettura della rete, sulla rottura di simmetria e sulla motilità delle perline a un'interfaccia simile a una membrana. In questo saggio, la miosina-I e i fattori di nucleazione (NPF) vengono co-ricoperti su perline su scala micrometrica per mimare la loro colocalizzazione alla membrana plasmatica18. Dopo l'avvio della polimerizzazione, gli NPF legati alla superficie stimolano l'assemblaggio ramificato dell'actina dipendente da Arp2/3, portando alla formazione di un involucro di actina, alla rottura di simmetria e allo sviluppo di una coda cometa polarizzata&#160;che determina la propulsione della perla14,19,20,21,22,23. Variando sistematicamente la densità superficiale della miosina18 e modulando la densità della rete di actina attraverso la concentrazione della proteina di cappuccio (CP)15,19,24, questo metodo consente un'analisi quantitativa della cinetica di assemblaggio dell'actina, dell'efficienza di crescita, dell'architettura della rete e della motilità delle perline, fornendo letture indirette relative alle variazioni dell'output meccanico dipendenti dalla miosina-I.
Il saggio offre anche vantaggi distinti rispetto ad approcci complementari. Rispetto ai saggi di polimerizzazione in massa, come i saggi con actina-pirene, questo sistema di movimento delle microsfere consente la visualizzazione diretta dell'assemblaggio dell'actina ramificata e del movimento delle microsfere indotto dalla polimerizzazione dell'actina. A differenza degli studi cellulari, in cui funzioni proteiche sovrapposte e ambienti cellulari complessi possono oscurare i singoli contributi e complicare l'interpretazione, questo saggio permette un controllo preciso sulla composizione, concentrazione e organizzazione superficiale delle proteine, consentendo così un'indagine sistematica su come la miosina-I interagisce con l'assemblaggio dell'actina mediato da Arp2/3 in condizioni biochimiche definite.
Questo metodo è particolarmente adatto per studiare come i componenti del citoscheletro si coordinano in un ambiente simile a una membrana&#160;interfaccia per regolare l'architettura della rete di actina e il relativo output meccanico. Sebbene il presente protocollo sia ottimizzato per l'assemblaggio di actina ramificata mediato da miosina-I, il suo design modulare potrebbe essere adattato in futuro per esaminare altre classi di miosine associate alla membrana (ad esempio miosina VI, VII, X, XV e XIX) e/o proteine leganti l'actina (ad esempio formine, vasodilatatore-stimolata fosfoproteina (VASP), cortactina, coronina o tropomiosina). Tali adattamenti richiederebbero la validazione dell'immobilizzazione, dell'attività e della densità superficiale delle proteine. Inoltre, il saggio è compatibile con strategie di marcatura tipo pulse-chase. L'inserimento di actina fotoconvertibile o fotoattivabile, oppure di subunità Arp2/3 marcate, potrebbe consentire la misurazione dei tassi di turnover dei filamenti e di dissociazione dei rami all'interno della rete in crescita25Nel complesso, questo saggio fornisce una piattaforma versatile per esaminare le interazioni molecolari tra motori associati alle membrane, filamenti di actina e proteine leganti l'actina, nonché per indagare come i motori e le proteine leganti l'actina regolino il rimodellamento della rete e la generazione di forze a interfacce simili a membrane.14,15,26,27,28,29,30,31,32,33,34Più in generale, costituisce anche una piattaforma minima e regolabile di materia attiva per lo studio dei principi fisici alla base della dinamica fuori equilibrio guidata dai motori molecolari, come la rottura di simmetria, l'auto-organizzazione, il feedback meccanochimico e altri comportamenti emergenti nelle reti attive di actomiosina.18,19,20,21,22,23,35,36, con possibili implicazioni per la fisica della materia attiva e l'ingegneria dei materiali.

<table><tbody><tr><td>Sale di sodio dell'adenosina 5&amp;prime;-trifosfato, idrato</td><td>Sigma</td><td>A26209</td><td>Utilizzato per preparare tamponi contenenti ATP; aliquotare e conservare a &amp;minus;20&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Complesso Arp2/3</td><td>Preparato in laboratorio</td><td>N/D</td><td>Utilizzato per nucleare reti di actina ramificate; purificato secondo la bibliografia 42.</td></tr><tr><td>Colorante fluorescente Biotina-CF640</td><td>Biotium</td><td>80032</td><td>Utilizzato per etichettare fluorescentemente i microsfera di controllo; proteggere dalla luce e conservare a &amp;minus;80&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Myo1d biotinilata</td><td>Preparato in laboratorio</td><td>N/D</td><td>Proteina motrice utilizzata per rivestire microsfere rivestite di miosina; preparata come descritto nelle bibliografie 18 e 38&amp;ndash;40.</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>Utilizzata per i tamponi di bloccaggio e conservazione delle microsfere; preparare una soluzione madre filtrata.</td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td>Componente del tampone utilizzato nel tampone X e negli esperimenti di interruzione del calcio.</td></tr><tr><td>Calmodulina</td><td>Preparato in laboratorio</td><td>N/D</td><td>Aggiunta alle reazioni contenenti miosina e al tampone di conservazione delle microsfere; purificata secondo la bibliografia 44.</td></tr><tr><td>Microsfere di polistirene carbossilato (diametro 2,0 &amp;micro;m)</td><td>Polysciences</td><td>18327-10</td><td>Utilizzate come supporto solido per il rivestimento con fattore di promozione della nucleazione, NeutrAvidina, colorante fluorescente e miosina; conservare a 4&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Camera CCD</td><td>Teledyne</td><td>01-RET-R6-R-M-14-C-OC</td><td>Utilizzata per l'acquisizione di immagini fluorescenti durante la microscopia a intervalli.</td></tr><tr><td>Colorazione Coomassie Brilliant Blue</td><td>Sigma</td><td>B7920</td><td>Utilizzata per colorare i gel SDS-PAGE prima dell'analisi densitometrica.</td></tr><tr><td>Coprioggetti, 22 mm &amp;times; 22 mm, #1.5</td><td>Globe</td><td>1404-15</td><td>Utilizzati con vetrini per assemblare camere a compressione.</td></tr><tr><td>Ditiotreitolo (DTT)</td><td>GoldBio</td><td>DTT10</td><td>Agente riducente utilizzato nei tamponi e nelle miscele di motilità; conservare a &amp;minus;20&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Pompa per vuoto a scroll asciutta</td><td>Agilent Technologies</td><td>IDP3B01</td><td>Utilizzata per far funzionare il sistema di pulizia al plasma.</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>GoldBio</td><td>E-217-100</td><td>Chelegante del calcio utilizzato nel tampone M, nel tampone di motilità e nel pretrattamento dell'actina.</td></tr><tr><td>Sorgente luminosa esterna</td><td>Leica</td><td>EL6000</td><td>Sorgente luminosa a alogenuri metallici per microscopia fluorescente.</td></tr><tr><td>Fiji (ImageJ)</td><td>Open source</td><td>N/D</td><td>Utilizzato per l'analisi della lunghezza delle code a cometa, dell'intensità di fluorescenza e della densità della rete (versione 2.16.0/1.54p).</td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza</td><td>Leica</td><td>DMIRB</td><td>Microscopio a epifluorescenza invertito utilizzato per l'acquisizione di immagini di code a cometa di actina.</td></tr><tr><td>Acido acetico glaciale</td><td>Fisher Chemical</td><td>BP2401-212</td><td>Componente della soluzione di decolorazione per gel SDS-PAGE; corrosivo, maneggiare con le opportune precauzioni.</td></tr><tr><td>GST-VCA</td><td>Cytoskeleton</td><td>VCG03-A</td><td>Fattore di promozione della nucleazione utilizzato per l'assemblaggio dell'actina mediato da Arp2/3; aliquotare e conservare a &amp;minus;80&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>GoldBio</td><td>H-400-1</td><td>Reagente tampone utilizzato nel tampone X, nel tampone M e nel tampone di motilità.</td></tr><tr><td>CapZ umano</td><td>Preparato in laboratorio</td><td>N/D</td><td>Proteina di cappuccio utilizzata per regolare la densità della rete di actina; purificata secondo la bibliografia 43.</td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>Spectrum Chemical</td><td>M1035</td><td>Componente del tampone utilizzato nei tamponi di reazione e nel pretrattamento dell'actina.</td></tr><tr><td>Software di imaging MetaMorph</td><td>Molecular Devices</td><td>N/D</td><td>Utilizzato per il controllo del microscopio e l'acquisizione delle immagini (versione 7.10.4.459).</td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Sigma</td><td>MX0485-3</td><td>Componente della soluzione di decolorazione per gel SDS-PAGE; infiammabile, maneggiare secondo le procedure di sicurezza istituzionali.</td></tr><tr><td>Methylcellulosa</td><td>Sigma</td><td>M0387</td><td>Aggiunta al tampone di motilità per aumentare la viscosità della soluzione (1500 cP).</td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio</td><td>Corning</td><td>2947-75X25</td><td>Utilizzati per assemblare camere a compressione per la microscopia.</td></tr><tr><td>Proteina NeutrAvidina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31000</td><td>Utilizzata per immobilizzare proteine biotinilate sulle superfici delle microsfere; aliquotare e conservare a &amp;minus;80&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Scala molecolare di proteine precolorate PageRuler Plus</td><td>Thermo Scientific</td><td>26619</td><td>Marcatore del peso molecolare utilizzato per l'analisi SDS-PAGE; conservare a &amp;minus;20&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Pulitore al plasma</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td>Utilizzato per pulire al plasma vetrini e coprioggetti prima dell'assemblaggio della camera.</td></tr><tr><td>Filtro per siringa in polietersolfone, 0,22 &amp;micro;m</td><td>Sigma</td><td>SLGPR33RS</td><td>Utilizzato per filtrare la soluzione madre di albumina sierica bovina prima dell'aliquotatura.</td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP366-1</td><td>Sale utilizzato per mantenere la forza ionica nei tamponi per saggi.</td></tr><tr><td>Actina da muscolo scheletrico di coniglio</td><td>Preparato in laboratorio</td><td>N/D</td><td>Purificata secondo la bibliografia 41 e utilizzata come G-actina per saggi di assemblaggio delle code a cometa di actina.</td></tr><tr><td>Microcentrifuga refrigerata</td><td>Eppendorf</td><td>EP-5415R</td><td>Utilizzata per la sedimentazione delle microsfere durante la preparazione e i passaggi di lavaggio.</td></tr><tr><td>Mixer rotante (rotatore da banco)</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-04397-40</td><td>Utilizzato durante le incubazioni di rivestimento delle microsfere per mantenere la sospensione.</td></tr><tr><td>Tampone di corsa Tris/Glicina/SDS (10&amp;times;)</td><td>Bio-Rad</td><td>1610732</td><td>Diluire a 1&amp;times; prima dell'elettroforesi SDS-PAGE.</td></tr><tr><td>Grasso per vuoto</td><td>High Vac Depot</td><td>408524</td><td>Utilizzato per sigillare le camere a compressione prima dell'imaging a fluorescenza.</td></tr><tr><td>Gel SDS-poliacrilammide con gradiente 4%&amp;ndash;20%</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>XP04205BOX</td><td>Utilizzato per l'analisi SDS-PAGE di proteine associate alle microsfere; conservare a 4&amp;deg;C.</td></tr></tbody></table>

ricostituzione dell'assemblaggio di actina ramificata mediato dalla miosina-i in un saggio di motilità della coda di cometa di actina basato su microsfere

Reconstituting Myosin-I-Mediated Branched Actin Assembly in a Bead-Based Actin Comet-Tail Motility Assay

La polimerizzazione dell'actina ramificata mediata dal complesso dell'actina correlata proteina 2/3 (Arp2/3) fornisce le principali forze propulsive per una varietà di processi cellulari, tra cui la migrazione cellulare, l'endocitosi e la fagocitosi. Si è dimostrato che i motori miosina-I, che spesso colocalizzano con le reti di actina ramificata al bordo anteriore della cellula, partecipano anche a questi processi e si ritiene che regolino l'organizzazione della rete di actina e la produzione meccanica di forza. Tuttavia, i meccanismi molecolari attraverso cui la miosina-I interagisce con il complesso Arp2/3 per modulare l'assemblaggio dell'actina ramificata e la generazione di forza rimangono in gran parte sconosciuti. Descriviamo qui un saggio in vitro altamente regolabile di motilità di perle con code cometee di actina, che ricapitola l'interazione tra miosina-I, actina e il complesso Arp2/3 al bordo anteriore della cellula sulla superficie di perle di dimensioni micrometriche. Questo metodo deriva da saggi ben consolidati di code cometee di actina, immobilizzando contemporaneamente la miosina-I insieme a fattori di promozione della nucleazione (NPFs) sulle superfici delle perle, creando così un'interfaccia di assemblaggio dell'actina simile a una membrana. Il saggio consente la visualizzazione e l'analisi quantitativa dell'assemblaggio della rete di actina, della densità della rete, della motilità delle perle e dell'efficienza di crescita. Fornisce inoltre letture indirette e qualitative del potenziamento della forza mediato dalla miosina-I nelle reti di actina ramificata. Questo protocollo include la funzionalizzazione delle perle, l'assemblaggio della reazione, l'analisi mediante imaging a fluorescenza, l'analisi quantitativa delle immagini e strategie di risoluzione dei problemi, offrendo una piattaforma riproducibile per lo studio dell'assemblaggio dell'actina regolato dalla miosina-I in interfacce simili a membrane.

Il saggio di motilità con perline a coda di cometa di actina è stato utilizzato per studiare l'effetto dell'attività della miosina-I sull'assemblaggio ramificato di actina mediato dal complesso Arp2/3 al margine anteriore della cellula, riproducendo scenari in cui la miosina-I associata alla membrana coordina con la polimerizzazione dell'actina per promuovere la protrusione della membrana7,8,9,10,11,12,13. Per imitare la colocalizzazione della miosina-I e dei fattori di nucleazione dell'actina (NPFs) all'interfaccia membrana-actina, entrambe le proteine sono state co-ricoperte sulla superficie di perline su scala microscopica, ricostituendo così la loro vicinanza spaziale in un sistema in vitro controllato (Figura 1A,B).
<img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71259/71259fig1.jpg" /> 
Figura 1. Ricostruzione dell'assemblaggio di actina ramificata mediato da miosina-I su microsferette. (A) Schema che illustra le interazioni tra miosina-I, fattori di promozione della nucleazione (NPF), il complesso della proteina 2/3 correlata all'actina (Arp2/3), la proteina di cappuccio (CP) e l'actina globulare (G-actina) nel margine anteriore della cellula. (B) Schema della funzionalizzazione delle sferette. Le sferette di controllo e quelle rivestite con miosina sono state ricoperte con NPF e neutravidina. La neutravidina è stata coniugata o con un colorante fluorescente far-red biotinilato per le sferette di controllo o con Drosophila Myo1d biotinilato per le sferette rivestite con miosina. (C) Serie temporale rappresentativa che mostra la crescita della coda cometa di actina, dalla rottura della simmetria alla formazione della coda cometa polarizzata, per una sferetta di controllo e una sferetta rivestita con miosina. Il pannello finale mostra entrambe le sferette nello stesso campo visivo. Barra della scala, 5 µm. I pannelli B e C sono riprodotti/modificati da Xu et al., Science Advances, DOI: 10.1126/sciadv.ado5788 (2024), AAAS, con autorizzazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71259/71259fig1large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
Per valutare meglio il contributo specifico della miosina-I all'assemblaggio dell'actina, è stata costruita anche una perla di controllo corrispondente. Le perle di controllo erano identiche alle perle rivestite con miosina, con l'unica differenza che la miosina-I era stata sostituita con un colorante fluorescente biotinilato nel vicino infrarosso coniugato alla neutravidina (Figura 1B). Mescolando entrambi i tipi di perle nella stessa camera di reazione e acquisendone le immagini nel medesimo campo visivo, è stato possibile effettuare un confronto diretto dell'assemblaggio dell'actina ramificata in presenza e in assenza di miosina-I in condizioni sperimentali identiche (Figura 1C). Inoltre, variando il rapporto tra miosina e fattore di nucleazione (NPF) sulla superficie della perla, è stato possibile esaminare sistematicamente l'effetto della miosina-I a diverse densità superficiali (Figura 2A,B). Inoltre, la densità della rete di actina poteva essere regolata modificando la concentrazione della proteina di cappuccio (CP), generando reti che andavano da strutture densamente impacchettate e resistenti alla rottura di simmetria a architetture allentate e soggette a fratture15,19,24. Questo approccio ha permesso di studiare in che modo la miosina-I influenza l'assemblaggio dell'actina ramificata in reti con diversa densità e integrità strutturale (Figura 2A,B).
<img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71259/71259fig2.jpg" /> 
Figura 2. Morfologia della coda a cometa dell'actina&#160;attraverso diverse densità superficiali della miosina e concentrazioni di proteina di cappuccio. (A) Immagini fluorescenti rappresentative di 2-&#181;m-beads di diametro rivestite con densità superficiali diverse di miosina e assemblate in reazioni contenenti 30–200 nM di proteina di cappuccio (CP), 4 &#181;M actina con actina marcata al 5% con rodamina e 200 nM di Arp2/3&#160;complesso. Per ogni condizione, le perle di controllo e le perle rivestite con miosina sono state immaginate nello stesso campo visivo. Le densità superficiali di miosina e del fattore di promozione della nucleazione (NPF) sono state determinate mediante elettroforesi in gel di poliacrilammide in presenza di dodecilsolfato di sodio, come descritto al punto 2.3. Le immagini sono state acquisite 20–35 minuti dopo l'avvio della reazione. Luminosità e contrasto sono stati regolati in modo lineare e identico all'interno di ogni coppia di perle controllo–miosina, ma sono stati scalati indipendentemente tra le diverse condizioni per una migliore visualizzazione. Barra della scala, 5 &#181;m. (BMappa qualitativa del saggio che riassume gli esiti delle code a cometa in funzione delle concentrazioni di CP e delle densità superficiali di miosina. Ogni punto dati rappresenta una coppia di microsferette controllo–miosina abbinata nella condizione indicata. I simboli indicano gli esiti osservati, inclusi microsferette rivestite di miosina che promuovono la rottura di simmetria, code più lunghe, code simili, code più corte, assenza di formazione della coda a cometa o strutture simili a astri. I dati sono stati raccolti da più di 20 esperimenti indipendenti, con l'analisi di oltre 10 coppie di microsferette per ogni condizione. Questa figura è riprodotta/modificata da Xu et al., Science Advances, DOI: 10.1126/sciadv.ado5788 (2024), AAAS, con autorizzazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71259/71259fig2large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
Mescolando i componenti del saggio, le NPF di superficie stimolavano l'assemblaggio ramificato di actina mediato dal complesso Arp2/3 attorno alla superficie della microsfera. In una reazione tipica e riuscita, l'actina appariva inizialmente come un guscio rado attorno alla microsfera. Procedendo la polimerizzazione, il guscio si espandeva e la rete diventava più densamente intrecciata. L'assemblaggio continuo di actina sulla superficie della microsfera determinava una crescita esterna della rete, che poteva portare alla rottura della simmetria e alla formazione di una coda cometa polarizzata. Una volta stabilita la coda cometa, la continua nucleazione e polimerizzazione dell'actina sulla superficie della microsfera sosteneva un movimento sostenuto della microsfera (Figura 1C). Queste caratteristiche sequenziali di formazione del guscio di actina, rottura della simmetria, allungamento della coda cometa e propulsione della microsfera fungevano da indicatori visivi del corretto funzionamento del saggio.
Come riportato nel nostro studio originale18 e illustrato nella Figura 2A,B, la morfologia delle code a cometa risultava sensibile sia alla concentrazione di CP sia alla densità superficiale della miosina. In condizioni standard del saggio (200 nM complesso Arp2/3, 50 nM CP, rapporto miosina:NPF = 0,43:1), le perline rivestite di miosina generavano tipicamente code di actina a cometa più rade o più diffuse rispetto alle perline di controllo (Figura 2A). A basse concentrazioni di CP (&#60;30 nM), l’actina si assemblava in gusci densi e resistenti alla frattura. In queste condizioni, le perline di controllo spesso rimanevano incapsulate e non subivano la rottura di simmetria, mentre le perline rivestite di miosina avevano maggiori probabilità di rompere la simmetria ed emergere dal guscio di actina circostante (Figura 2A,B). Ad alte concentrazioni di CP (&#62;200 nM), la coesione della rete risultava ridotta e la presenza della miosina ulteriormente destabilizzava la rete di actina, promuoveva il distacco dell’actina e impediva la formazione di code a cometa stabili (Figura 2A,B). Questi risultati dipendenti dalle condizioni forniscono parametri utili che i ricercatori possono impiegare per identificare regimi di saggio appropriati e risolvere problemi di prestazione del saggio.
L'effetto della miosina-I sulla morfologia della coda cometica di actina può essere valutato misurando l'intensità media di fluorescenza della coda cometa. La regione della coda cometa è stata definita utilizzando una soglia di intensità, come descritto al passaggio 4.2, e successivamente è stata misurata l'intensità media di fluorescenza all'interno di questa regione (Figura 3A). In condizioni di imaging equivalenti, in cui perline di controllo e perline rivestite di miosina sono state immaginate nello stesso campo visivo, questo valore ha funto da indicatore relativo e non calibrato della densità della rete di actina, con un'intensità media più bassa che indica una rete più rada. Nelle condizioni standard del saggio, le perline rivestite di miosina generavano tipicamente code cometee con un'intensità media di fluorescenza inferiore rispetto alle perline di controllo, coerentemente con una densità apparente della rete ridotta (Figura 3C).
<img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71259/71259fig3.jpg" /> 
Figura 3. Flusso di lavoro per la quantificazione della cinetica di crescita delle code a cometa dell'actina e dell'efficienza di assemblaggio. (A) Serie temporale rappresentativa della crescita della coda a cometa da una perla controllo e da una perla rivestita con miosina in rapporto 0,43:1 in presenza di 50 nM di proteina di cappuccio (CP). I contorni neri indicano le regioni di interesse (ROI) delle code a cometa identificate utilizzando Fiji per misurare l'intensità di fluorescenza. Condizioni della reazione: 4 µM di actina con il 5% di actina marcata con rodamina, 200 nM del complesso proteina correlata all'actina 2/3 (Arp2/3) e 50 nM di CP. Barra della scala, 5 µm. (B) Lunghezza della coda a cometa riportata in funzione del tempo per la coppia rappresentativa di perle controllo–miosina mostrata nel pannello (A). L'insetto mostra l'intervallo temporale utilizzato per l'adattamento lineare, e le velocità di crescita della coda sono state determinate dalle pendenze delle rette interpolate. (C) Intensità di fluorescenza totale normalizzata della coda a cometa riportata in funzione del tempo per la coppia rappresentativa di perle controllo–miosina mostrata nel pannello (A). Le perle controllo e quelle con miosina sono state normalizzate rispetto all'intensità media di fluorescenza delle perle controllo tra 1100 e 1300 s. L'insetto mostra l'intervallo temporale utilizzato per l'adattamento lineare, e le velocità di assemblaggio della fluorescenza sono state calcolate dalle pendenze delle rette interpolate. (D) Tabella riassuntiva che mostra la velocità di crescita della coda, la velocità di assemblaggio della fluorescenza e l'efficienza di crescita per la coppia rappresentativa di perle controllo–miosina mostrata nel pannello (A). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71259/71259fig3large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
L'effetto della miosina-I sulla cinetica di crescita delle code a cometa può essere quantificato misurando nel tempo sia l'allungamento della coda a cometa che l'accumulo della fluorescenza dell'actina. Nella maggior parte degli esperimenti, le code a cometa crescevano a una velocità approssimativamente costante durante i primi ~10 min dopo la rottura della simmetria. Man mano che i componenti della polimerizzazione si esaurivano, l'allungamento rallentava progressivamente e cessava tipicamente circa 30 min dopo l'avvio della reazione. Per quantificare la cinetica di crescita, la lunghezza della coda a cometa e l'intensità totale della fluorescenza sono state riportate in grafico in funzione del tempo (Figura 3B,C). I primi 7–10 punti dati, corrispondenti alla fase iniziale lineare, sono stati interpolati mediante regressione lineare (Figura 3B,C, insetti). Le pendenze di questi interpolazioni rappresentavano rispettivamente la velocità iniziale di crescita della coda e la velocità di assemblaggio della fluorescenza dell'actina. L'efficienza di crescita è stata definita come il rapporto tra la velocità di crescita della coda a cometa e la velocità di assemblaggio della fluorescenza dell'actina, quantificando così l'efficacia con cui la polimerizzazione dell'actina veniva convertita in uno spostamento produttivo della perla (Figura 3D). Nell'esempio rappresentativo mostrato in Figura 3A–D, la perla rivestita di miosina ha mostrato una velocità di crescita della coda di 0,60 µm/min (0,010 µm/s), rispetto a 0,57 µm/min (0,0095 µm/s) per la perla di controllo (Figura 3B,D). Le corrispondenti efficienze di crescita erano rispettivamente 5,6 e 4,5 µm/unità di intensità, indicando un valore superiore di circa 1,2 volte per la perla rivestita di miosina (Figura 3D). In condizioni standard, le perle rivestite di miosina mostravano tipicamente velocità di crescita paragonabili a quelle delle perle di controllo (miosina: 0,69 ± 0,10 µm/min; controllo: 0,66 ± 0,20 µm/min), insieme a una velocità di assemblaggio della fluorescenza dell'actina più bassa (circa 0,76 volte quella del controllo) e un'efficienza di crescita superiore di circa 1,4 volte, come riportato precedentemente nel nostro studio originale18. Questi valori sono espressi come media ± DS ottenuta da 11 coppie di perle per condizione, raccolte in cinque esperimenti indipendenti. L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando un test t accoppiato a due code, come descritto nello studio originale18.
Per valutare il contributo dello stroke di potenza della miosina ed escludere la possibilità che gli effetti osservati derivassero da un ingombro sterico dovuto all'occupazione superficiale della miosina, il saggio di motilità delle perle può essere eseguito in condizioni che interrompono l'attività dello stroke di potenza della miosina-I. In questo protocollo, l'attività del motore della miosina-I è stata inibita aggiungendo 1,1 mM di Ca2+ alla miscela di reazione. L'aumento di Ca2+ ha favorito la dissociazione della calmodulina dal braccio leva della miosina-I, riducendo la rigidità del braccio leva e compromettendo la sua capacità di generare forza46,47,48. In queste condizioni, la miosina-I è rimasta dinamicamente associata all'actina, ma non ha sostenuto lo scorrimento dell'actina (Figura 4A,B), fornendo un controllo utile per valutare gli effetti dipendenti dall'attività del motore18.
<img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71259/71259fig4.jpg" /> 
Figura 4. Controllo basato sul calcio per valutare l'attività motoria di Myo1d nel saggio di motilità delle perle. (A) Immagini ottenute per sovrapposizione temporale di filamenti di actina in movimento su una superficie rivestita con Myo1d in assenza di calcio elevato o che formano pattern vorticosi non produttivi in presenza di 100 µM di calcio libero. La barra colorata a iride indica la progressione temporale su 61 fotogrammi acquisiti a intervalli di 5 s. Scala: 5 µm. (B) Quantificazione della velocità di scorrimento dell'actina in assenza e in presenza di 100 µM di calcio libero (N = 2 esperimenti indipendenti; n = 25 filamenti). Nessuno scorrimento produttivo dell'actina è stato osservato in presenza di 100 µM di calcio libero in queste condizioni. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard (SD). (C) Coppie rappresentative di perle di controllo e perle rivestite con miosina assemblate in assenza o in presenza di 100 µM di calcio libero. Sono mostrate cinque coppie di perle rappresentative per ciascuna condizione. All'interno di ogni coppia, la perlina di controllo e quella rivestita con miosina sono state immaginate nello stesso campo visivo. Le immagini sono state acquisite circa 15–20 min dopo l'inizio della reazione. Luminosità e contrasto sono stati regolati linearmente e in modo identico all'interno di ciascuna coppia di perle controllo-miosina, ma scalati indipendentemente tra le diverse condizioni. Condizioni della reazione: 4 µM di actina con il 5% di actina marcata con rodamina, 200 nM del complesso proteina legata all'actina 2/3 (Arp2/3) e 50 nM della proteina di cappuccio (CP). Scale: 5 µm. I pannelli A e B sono riprodotti/modificati da Xu et al., Science Advances, DOI: 10.1126/sciadv.ado5788 (2024), AAAS, con autorizzazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71259/71259fig4large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
Quando il saggio è stato eseguito correttamente, le perle rivestite con miosina sottoposte a condizioni di Ca2+ elevato hanno generato code cometee di actina più corte, con densità della rete paragonabili a quelle delle perle di controllo (Figura 4C). Sono mostrate cinque coppie rappresentative di perle di controllo e perle rivestite con miosina provenienti da due esperimenti indipendenti. Questo risultato qualitativo è stato osservato in modo costante in ripetute preparazioni del saggio ed è supportato dall'analisi quantitativa riportata nello studio originale18. Questo risultato atteso indica che le differenze nella rete osservate in condizioni standard dipendono da un attivo colpo di potenza della miosina piuttosto che semplicemente dall'occupazione della superficie da parte della miosina. Pertanto, la condizione di Ca2+ elevato funge da controllo fondamentale per valutare se i cambiamenti nell'organizzazione della rete di actina ramificata derivano dall'attività del motore molecolare della miosina.

Questo protocollo descrive un saggio di motilità di perle con coda cometaria di actina regolabile per analizzare quantitativamente in che modo l'attività del motore molecolare miosina influisce sull'assemblaggio dell'actina ramificata e sull'architettura della rete in un'interfaccia simile a una membrana.

Ricostituzione dell'assemblaggio di actina ramificata mediato dalla miosina-I in un saggio di motilità della coda di cometa di actina basato su microsfere

La polimerizzazione ramificata dell'actina mediata dal complesso della proteina 2/3 correlata all'actina (Arp2/3) fornisce le principali forze di spinta per una varietà di processi cellulari...

Our research focuses on studying how myosin-I shapes branched actin networks and drives force generation at membrane interfaces. Previous cellular studies make it hard to isolate myosin-I effects. This protocol reconstitutes everything in vitro under well-controlled conditions.To begin, gather the required reagents. After preparing the nucleation-promoting factor, or NPF, and neutravidin coating mixture, gently mix the coating mixture by pipetting up and down 5 to 10 times, avoiding bubble formation. Transfer 5 microliters of bead slurry to a microcentrifuge tube. Add 10 microliters of X buffer to the beads and pipette at least five times. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius. Carefully remove the supernatant by tilting the tube and aspirating from the side opposite the bead pellet. Resuspend the washed beads in 50 microliters of the previously prepared coating mixture. Mix the suspension by gentle pipetting and leave a small air bubble to facilitate mixing during incubation. Incubate the beads on a benchtop rotator at 20 revolutions per minute for two hours at 4 degrees Celsius. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius, and carefully remove the supernatant containing excess neutravidin and GST-VCA. Resuspend the coated beads in 200 to 400 microliters of 10 milligrams per milliliter BSA. Incubate the suspension on ice for 30 minutes to block unoccupied binding sites on the bead surface. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius, and carefully remove the supernatant. Resuspend the beads in 50 microliters of 1 milligram per milliliter BSA prepared in X buffer. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius. Remove the supernatant and repeat the wash twice. Store the coated beads in 1 milligram per milliliter BSA prepared in X buffer on ice and use them within one week.To exchange the storage X buffer with the M buffer before myosin coating, divide 50 microliters of neutravidin-NPF-coated beads equally into two microcentrifuge tubes. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius and carefully remove the supernatant. Wash the beads with 25 microliters of 1 milligram per milliliter BSA prepared in M buffer. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius. Carefully remove the supernatant and repeat the wash twice. Resuspend the control beads in 25 microliters of 1 micromolar Biotin-CF640 fluorescent dye diluted from the stock solution in M buffer. Resuspend the myosin beads in 25 microliters of 500 nanomolar to 1 micromolar biotinylated myosin supplemented with 1 to 5 micromolar calmodulin. After covering the tubes with aluminum foil, incubate the bead suspensions on ice for at least 30 minutes. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius, and carefully remove the supernatant containing excess biotinylated myosin or fluorescent dye. Wash the decorated beads with 25 microliters of 1 milligram per milliliter BSA prepared in M buffer. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius. Carefully remove the supernatant and repeat the wash twice. Supplement the myosin-decorated beads with 1 to 5 micromolar calmodulin. Protect all decorated beads from light by covering the tubes with aluminum foil, then store the far-red fluorescent dye-decorated beads or myosin-decorated beads on ice.After bead preparation and decoration, prepare a 50-microliter motility mixture. Initiate the reaction by adding 4 microliters of 50 micromolar G-actin with 5% to 10% of the actin fluorescently labeled. Mix the reaction immediately and designate this time point as time equals 0. Clean the glass slide and coverslip with 70% ethanol, followed by deionized water. Plasma-clean the glass surfaces using ambient air plasma for 10 minutes. Apply 2.3 microliters of the reaction mixture to the glass slide. Place a 22-millimeter by 22-millimeter coverslip over the sample to form a squeeze chamber, with an approximate chamber height of 4.3 micrometers. Seal the chamber with vacuum grease. Using an epifluorescence microscope, acquire fluorescence images.Surface-bound NPFs stimulated branched actin assembly around the bead surface and actin first appeared as a sparse shell surrounding the bead. Continued actin assembly at the bead surface drove outward network growth, which led to symmetry breaking and the formation of a polarized comet tail. Once a comet tail was established, ongoing actin nucleation at the bead surface supported sustained bead movement. Under standard assay conditions, myosin-coated beads typically produce dimmer, sparser, or more diffuse actin comet tails than control beads.This protocol allows researchers to study how membrane-bound myosin motors regulate actin network density, growth kinetics, and polymerization-driven bead movement. The most important consideration is protein quality. Always validate new preparations against a previously validated batch before quantitative experiments. Future studies building on this work can test other membrane-associated myosins, disease-associated motor variants, or actin regulators at the membrane-like interface.

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