Imaging quantitativo delle cellule vive della forma nucleare e della dinamica della cromatina durante lo sviluppo e lo stress ambientale nella radice di Arabidopsis thaliana
5 giugno 2026
Questo processo utilizza microscopia confocale in combinazione con un nucleo e una linea di marcatori di cromatina marcati fluorescentmente in Arabidopsis thaliana per registrare simultaneamente la dinamica del nucleo e della cromatina nelle radici di Arabidopsis e indagare i cambiamenti in queste dinamiche in risposta a segnali di sviluppo e ambientali.
La nostra ricerca indaga geni e meccanismi che permettono il recupero radicale a lungo termine dallo stress osmotico per rafforzare le colture contro la siccità. Sebbene sviluppato per radici di arabidopsis, questo protocollo può essere adattato a sistemi con linee di marcatori proteici fluorescenti. Preparate le piantine di crescita contenenti piantine di Arabidopsis thaliana per l'imaging.
Pipetta 60 microlitri di acqua pura su un vetrino di vetro. Depongo tre radici di piantina di A. thaliana di sei giorni nell'acqua. Posiziona un copritore numero 1,5 millimetri 22x22 millimetri sopra le radici senza coprire le foglie.
Nelle impostazioni del microscopio confocale, imposta il tempo di esposizione del laser a 1.000 millisecondi. Nelle impostazioni del combinatore laser, imposta il laser a 488 nanometri al 50% per l'imaging con proteine fluorescenti verdi, o GFP. Imposta il laser da 561 nanometri al 50% per l'imaging di proteine fluorescenti rosse, o RFP.
Immagini il campione usando un obiettivo 20X senza zoom ottico. Imposta la dimensione del passo della Z slice a 0,3 micrometri. Imposta l'intervallo di imaging a un minuto e la durata totale dell'imaging a 10 minuti.
Individua le radici e seleziona fino a 20 fette Z. Cattura immagini a 16 bit. Avvia l'acquisizione del time lapse e salva il time lapse come file TIFF usando la compressione lossless.
Sposta i dati acquisiti su un computer per l'analisi. Apri il software ImageJ o Fiji. Clicca e trascina il file VSI nella finestra principale di ImageJ o dell'applicazione Fiji.
Nel prompt Opzioni di importazione Bio Format, clicca su OK in basso a destra. Poi, nel prompt Opzioni Serie Bio Format, assicurati che la Serie 1 sia selezionata. Clicca su OK in basso a sinistra.
Una volta caricata l'immagine, suddividi i segnali selezionando Immagine. Seleziona Colore e scegli Canali Divisi. Visualizza le finestre separate generate per i nuclei etichettati con GFP e la cromatina etichettata con RFP.
Determina quale delle due finestre dell'immagine corrisponde alla cromatina. Dopo aver cliccato sulla finestra dell'immagine della cromatina, applica l'operazione progetto Z selezionando Immagine, scegliendo Pile e poi cliccando su Progetto Z dalla finestra principale di ImageJ. Cambia il tipo di proiezione su massima intensità.
Assicurati che All Time Frames sia attivo e clicca su OK per generare la proiezione. Apri il menu del contrasto premendo Control Shift C, oppure selezionando Immagine e Aggiusta, e poi cliccando su Luminosità o Contrasto dalla finestra principale di ImageJ. Fai scorrere la barra minima verso sinistra finché la cromatina non è chiaramente visibile.
Naviga fino ai plugin. Clicca sulla freccia verso il basso nel menu Plugin per scorrere fino all'opzione Tracciamento. Seleziona Tracciamento e clicca su SeguitoCompagno.
Conferma che le impostazioni di calibrazione siano accurate e clicca su Next. Seleziona Rilevatore di Soglia e clicca su Avanti. Sposta all'ultimo fotogramma del time lapse sulla finestra dell'immagine.
Clicca su Auto accanto alla Soglia di Intensità e clicca su Anteprima. Regola la Soglia di Intensità e clicca su Anteprima. Ripeti il processo di regolazione e anteprima finché tutta la cromatina non è inclusa con il minimo rumore, e clicca su Next.
Permette che il rilevamento iniziale della soglia si completi e clicca su Next. Regola manualmente la soglia finché non è visibile solo la cromatina e clicca su Next. Regola la visualizzazione dell'immagine fluorescente e clicca su Avanti.
Seleziona Simple LAP Tracker e clicca su Next. Imposta la distanza massima di collegamento a 5 micron, la distanza massima di chiusura a 15 micron, la distanza massima di chiusura a 1, e clicca su Next. Lascia completare il tracciamento.
Osserva le tracce mostrate nella finestra originale dell'immagine e clicca su Next. Premi il pulsante verde più nell'angolo in basso a sinistra per creare un filtro. Seleziona il numero di punti in modalità pista.
Regola il cursore della soglia. Assicurati che la modalità filtro sia impostata su Sopra, poi clicca su Next. Clicca sul pulsante Tracce in basso nella pagina Opzioni di visualizzazione.
Seleziona Esporta in CSV. Ignora la pagina di traccia integrata e clicca su Next. Rivedi i risultati dell'analisi di TrackMate.
Clicca su Sovrapposizione di cattura e poi scegli Esegui. Salva il video selezionando File e cliccando su Salva come, poi scegliendo GIF. Le cellule radicali trattate con sale apparivano stressate, mentre i fochi centromerici apparivano più grandi rispetto alle condizioni di controllo.
La velocità della cromatina era significativamente più alta nelle condizioni di controllo rispetto a quelle trattate con cloruro di sodio a 100 millimolari. Questo protocollo consente il tracciamento e la quantificazione del movimento delle proteine marcate fluorescenti nel tempo nelle radici di arabidopsis. La sfida più importante in questo protocollo è ottenere immagini di alta qualità, poiché lo sbiancamento fotografico e la deriva del campione possono rendere difficile il tracciamento.
Studi futuri dovrebbero indagare i meccanismi alla base del ridotto movimento della cromatina osservato nel nostro studio.
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Overview
The nucleus in eukaryotic cells exhibits dynamic shape changes, which are altered under stress conditions such as cancer in animals or abiotic stress in plants. This study developed a live-cell imaging pipeline in Arabidopsis thaliana roots using dual fluorescent markers for the nuclear envelope and chromatin to quantify nuclear and chromatin dynamics under control and salt-stressed conditions. Confocal microscopy combined with Fiji/ImageJ and TrackMate enabled quantitative analysis, revealing reduced chromatin movement under salt stress. The method provides a robust approach to study how abiotic stressors affect nuclear architecture and chromatin dynamics in plant cells.
Key Study Components
Area of Science
- Plant cell biology
- Nuclear dynamics
- Chromatin mobility
- Abiotic stress response
Background
- Nuclear shape is dynamic in live cells, not static as traditionally depicted.
- Altered nuclear morphology is associated with cancer in animal cells and environmental stress in plants.
- The nuclear envelope interacts with chromatin to influence gene expression.
- Limited knowledge exists on how abiotic stress affects nuclear shape, movement, and chromatin dynamics in plants.
Purpose of Study
- To develop a pipeline for quantifying nuclear and chromatin dynamics in live plant cells.
- To apply this method to assess changes under abiotic stress, specifically salt stress.
- To validate the approach by measuring chromatin movement in control and stressed conditions.
- To enable future analysis of nuclear and chromatin responses to environmental stressors in Arabidopsis roots.
Methods Used
- Live-cell imaging of Arabidopsis thaliana roots using confocal microscopy.
- Use of a dual fluorescently tagged marker line (nuclear envelope protein and chromatin).
- Image acquisition under control and salt-stressed conditions.
- Analysis of nuclear and chromatin dynamics using Fiji/ImageJ with the TrackMate plugin.
- Particle tracking to quantify chromatin speed and movement.
Main Results
- Chromatin movement was significantly reduced in salt-stressed roots compared to control.
- The dual-tagging system allowed simultaneous visualization of nuclear envelope and chromatin.
- TrackMate enabled accurate particle tracking and quantification of dynamics.
- The method successfully captured live, quantitative changes in nuclear and chromatin behavior.
Conclusions
- The developed pipeline allows for quantitative live-cell imaging of nuclear shape and chromatin dynamics in plant roots.
- Salt stress leads to decreased chromatin mobility, indicating altered nuclear dynamics under abiotic stress.
- This approach can be applied to study nuclear responses to various environmental stressors.
- The method provides a foundation for linking nuclear architecture to gene regulation and stress adaptation in plants.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Quantitative live-cell imaging of nuclear shape and chromatin dynamics in Arabidopsis roots provides a robust platform for dissecting cellular responses to environmental stress at high resolution. This approach enables predictive confidence in linking nuclear architecture changes to gene regulation, supporting early discovery and mechanistic de-risking in plant biotechnology pipelines. The method's quantitative outputs facilitate risk-adjusted decisions for trait development and stress adaptation research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of nuclear and chromatin behavior under defined stress conditions.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying dynamic nuclear responses to abiotic stimuli.
- Facilitates functional validation of nuclear envelope and chromatin-associated targets.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, quantitative imaging assays for nuclear and chromatin dynamics.
- Enables reproducible measurement of stress-induced changes in live plant cells.
- Supports scalable screening of genetic or chemical modulators affecting nuclear architecture.
Translational & Preclinical Research
- Aligns nuclear and chromatin dynamics with stress adaptation phenotypes in model systems.
- Enables continuity from discovery to preclinical validation of stress resilience traits.
- Supports predictive de-risking for translational research in crop improvement.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging and analysis pipeline integrates from early discovery through screening and translational research in plant biotechnology.
- Discovery Biology: Quantifies nuclear and chromatin dynamics to clarify stress response pathways.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Provides particle tracking and statistical outputs for robust condition comparison.
- Translational Research: Links nuclear architecture changes to stress adaptation, supporting trait validation.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable imaging and analysis workflow adaptable to diverse plant models and stressors.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in nuclear and chromatin target validation.
- Operational Value: Standardizes live-cell imaging and quantitative analysis for reproducibility.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for stress adaptation trait development.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of genetic or chemical interventions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy and live-cell imaging.
- Needs access to dual fluorescent marker lines and image analysis software (Fiji/ImageJ, TrackMate).
- Demands cross-team standardization for imaging protocols and data analysis.
- Adaptable to other plant species with suitable marker development.
- Limited by availability of compatible fluorescent markers for target systems.
