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<ol><li>Chen, S., Zhu, H., Jounaidi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+snapshots+of+natural+killer+cells+functions%2C+signaling%2C+molecular+mechanisms+and+clinical+utilization%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Comprehensive snapshots of natural killer cells functions, signaling, molecular mechanisms and clinical utilization.</a> Signal Transduct Target Ther. , (2024).</li>
<li>Liesche, C., Sauer, P., Prager, I., Urlaub, D., Claus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-fluorescent+protein+reporters+allow+parallel+quantification+of+natural+killer+cell-mediated+granzyme+and+caspase+activities+in+single+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Single-fluorescent protein reporters allow parallel quantification of natural killer cell-mediated granzyme and caspase activities in single target cells.</a> Front Immunol. , (2018).</li>
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<li>Liu, E., Tong, Y., Dotti, G., Shaim, H., Savoldo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cord+blood+NK+cells+engineered+to+express+IL-15+and+a+CD19-targeted+CAR+show+long-term+persistence+and+potent+antitumor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Cord blood NK cells engineered to express IL-15 and a CD19-targeted CAR show long-term persistence and potent antitumor activity.</a> Leukemia. , (2018).</li>
<li>Mensali, N., Dillard, P., Hebeisen, M., Lorenz, S., Theodossiou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NK+cells+specifically+TCR-dressed+to+kill+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">NK cells specifically TCR-dressed to kill cancer cells.</a> EBioMedicine. , (2019).</li>
<li>Nowak, J., Bentele, M., Kutle, I., Zimmermann, K., Lühmann, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR-NK+cells+targeting+HER1+%28EGFR%29+show+efficient+anti-tumor+activity+against+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+%28HNSCC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">CAR-NK cells targeting HER1 (EGFR) show efficient anti-tumor activity against head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC).</a> Cancers (Basel). , (2023).</li>
<li>Granger, J. E., Appledorn, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+measurement+of+apoptosis+and+immune+cell+killing+using+live-cell+imaging+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Kinetic measurement of apoptosis and immune cell killing using live-cell imaging and analysis.</a> Methods Mol Biol. , (2021).</li>
<li>Duffy, J., Rider, A., Loneman, D., Thakkar, D., Mullen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALK%2B+LBCL+and+PBL+share+a+similar+plasmablastic+transcriptional+identity+but+show+divergent+signaling+dependencies+and+therapeutic+vulnerabilities%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">ALK+ LBCL and PBL share a similar plasmablastic transcriptional identity but show divergent signaling dependencies and therapeutic vulnerabilities.</a> Blood. , (2025).</li>
<li>Kandarian, F., Sunga, G. M., Arango-Saenz, D., Rossetti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+flow+cytometry-based+cytotoxicity+assay+for+the+assessment+of+human+NK+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A flow cytometry-based cytotoxicity assay for the assessment of human NK cell activity.</a> J Vis Exp. (126), e56191(2017).</li>
<li>Klingemann, H., Boissel, L., Toneguzzo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cells+for+immunotherapy+-+advantages+of+the+NK-92+cell+line+over+blood+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Natural killer cells for immunotherapy - advantages of the NK-92 cell line over blood NK cells.</a> Front Immunol. , (2016).</li>
<li>Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD107a+as+a+functional+marker+for+the+identification+of+natural+killer+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity.</a> J Immunol Methods. , (2004).</li>
<li>Valiante, N. M., Uhrberg, M., Shilling, H. G., Lienert-Weidenbach, K., Arnett, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+and+structurally+distinct+NK+cell+receptor+repertoires+in+the+peripheral+blood+of+two+human+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Functionally and structurally distinct NK cell receptor repertoires in the peripheral blood of two human donors.</a> Immunity. , (1997).</li>
<li>Wang, Y., Zhang, Y., Hughes, T., Zhang, J., Caligiuri, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fratricide+of+NK+cells+in+daratumumab+therapy+for+multiple+myeloma+overcome+by+ex+vivo-expanded+autologous+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Fratricide of NK cells in daratumumab therapy for multiple myeloma overcome by ex vivo-expanded autologous NK cells.</a> Clin Cancer Res. , (2018).</li>
<li>Cichocki, F., Bjordahl, R., Gaidarova, S., Mahmood, S., Abujarour, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPSC-derived+NK+cells+maintain+high+cytotoxicity+and+enhance+in+vivo+tumor+control+in+concert+with+T+cells+and+anti-PD-1+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">iPSC-derived NK cells maintain high cytotoxicity and enhance in vivo tumor control in concert with T cells and anti-PD-1 therapy.</a> Sci Transl Med. , (2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Advanced RPMI-1640 medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12633020</td><td>Basal medium per NK-92 e media di coltura per NK umani primari (vedere il protocollo per la formulazione completa)</td></tr><tr><td>Anti-human CD107a antibody, PE-Cy7 conjugated (clone H4A3)</td><td>BioLegend</td><td>328618</td><td>Marcatore di degranulazione per citometria a flusso</td></tr><tr><td>Anti-human CD16 antibody, BV785 conjugated (clone 3G8)</td><td>BioLegend</td><td>302046</td><td>Citometria a flusso</td></tr><tr><td>Anti-human CD56 antibody, BV421 conjugated (clone HCD56)</td><td>BioLegend</td><td>318328</td><td>Citometria a flusso</td></tr><tr><td>Benchtop centrifuge with swinging bucket rotor compatible with 15-mL tubes and 96-well plates (Eppendorf Centrifuge 5810R)</td><td>Eppendorf</td><td>5811000015</td><td>Usato per il pelleting delle cellule e la centrifugazione delle piastre (100&ndash;300 &times; g)</td></tr><tr><td>Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C34554</td><td>Colorante per la proliferazione cellulare per l'etichettatura delle cellule bersaglio</td></tr><tr><td>Cytek Aurora spectral flow cytometer (or equivalent)</td><td>Cytek Biosciences</td><td>N7-00003</td><td>Usato per l'acquisizione e l'analisi della citometria a flusso</td></tr><tr><td>DAPI (4&prime;,6-diamidino-2-phenylindole)</td><td>BioLegend</td><td>422801</td><td>Colorante nucleare per la discriminazione vivo/morto</td></tr><tr><td>Deep-well 96-well plate</td><td>USA Scientific</td><td>1896-2110</td><td>Usato per la preparazione degli anticorpi</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231-100</td><td>Reagente per la criopreservazione</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Avantor</td><td>76419-584</td><td>Supplementazione del mezzo basale; usato nel buffer FACS (2% FBS)</td></tr><tr><td>General Purpose Water Bath, 10 L (37 &deg;C)</td><td>PolyScience</td><td>WBE10</td><td>Per lo scongelamento delle cellule</td></tr><tr><td>GlutaMAX (L-alanyl-L-glutamine supplement)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>Fonte stabile di glutammina</td></tr><tr><td>Human AB serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4522-100ML</td><td>Supplemento per i media di coltura per NK umani primari</td></tr><tr><td>IncuCyte SX5 live-cell imaging system</td><td>Sartorius</td><td>4816</td><td>Imaging live delle cellule in tempo reale e analisi Cell-by-Cell</td></tr><tr><td>LUNA-FL dual fluorescence cell counter (or equivalent)</td><td>Logos Biosystems</td><td>L20001</td><td>Conteggio cellulare automatizzato</td></tr><tr><td>Parafilm M (4 in &times; 250 ft roll)</td><td>Genesee</td><td>16-101</td><td>Sigillatura e conservazione delle piastre</td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS), sterile (pH 7.2&ndash;7.4)</td><td>Corning</td><td>21-020-CV</td><td>Usato per lavaggi e preparazione del buffer FACS</td></tr><tr><td>Poly-D-lysine (0.1 mg/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A3890401</td><td>Reagente per il rivestimento delle piastre</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-2</td><td>Antibiotico</td></tr><tr><td>Recombinant human interleukin-2 (IL-2)</td><td>R&amp;D Systems</td><td>202-IL-500</td><td>Citochina</td></tr><tr><td>RosetteSep Human NK-cell enrichment kit</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>15065</td><td>Cocktail per l'arricchimento delle cellule NK umane</td></tr><tr><td>SYTOX Orange dead cell stain</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S34861</td><td>Colorante di vitalità per l'imaging delle cellule vive</td></tr><tr><td>Trypan Blue 0.4%</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td>Colorante di vitalità per il conteggio delle cellule</td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12604039</td><td>Per il distacco delle cellule aderenti</td></tr><tr><td>UltraPure EDTA (0.5 M, pH 8.0)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575020</td><td>Usato per la preparazione del buffer FACS</td></tr><tr><td>15-mL conical-bottom centrifuge tubes</td><td>Corning</td><td>352097</td><td>Sterili</td></tr><tr><td>24-well tissue culture plate (tissue culture&ndash;treated)</td><td>Corning</td><td>3524</td><td>Usato per il recupero delle cellule NK</td></tr><tr><td>96-well clear round-bottom plate (tissue culture&ndash;treated)</td><td>Corning</td><td>3799</td><td>Usato per co-colture e saggi di citometria a flusso</td></tr><tr><td>96-well flat clear-bottom black polystyrene plate (tissue culture&ndash;treated)</td><td>Corning</td><td>3603</td><td>Compatibile con i sistemi di imaging delle cellule vive</td></tr></tbody></table>

quantificazione della citotossicità delle cellule nk potenziata dai recettori antigenici chimerici e dagli anticorpi terapeutici tramite imaging a cellule vive e citometria a flusso

Quantifying NK-Cell Cytotoxicity Potentiated by Chimeric Antigen Receptors and Therapeutic Antibodies Using Live-Cell Imaging and Flow Cytometry

Quantificazione della citotossicità delle cellule NK potenziata dai recettori antigenici chimerici e dagli anticorpi terapeutici tramite imaging a cellule vive e citometria a flusso

Natural killer (NK) cells are innate lymphocytes that play a critical role in protective immunity against diverse intracellular pathogens and cancers. ...

Il nostro laboratorio studia il ruolo delle cellule natural killer nella salute e nelle malattie, con l'obiettivo di sfruttarne il potenziale per migliorare i trattamenti contro i tumori solidi e ematologici. Gli attuali saggi di citotossicità delle cellule NK mancano di standardizzazione tra diverse piattaforme e configurazioni. Questo protocollo fornisce metodi riproducibili di imaging in tempo reale e citometria a flusso per una valutazione accurata della citotossicità.Per iniziare, preparare 10 millilitri di SYTOX Orange 2x diluendo la soluzione madre di SYTOX Orange in mezzo di coltura NK-92 in un tubo conico da 15 millilitri. Contare le cellule bersaglio utilizzando un contatore Luna dopo averle mescolate con il blu di tripano oppure impiegare qualsiasi metodo validato di conta cellulare basato sull'esclusione di colorante. Trasferire la quantità necessaria di cellule bersaglio in un tubo conico da 15 millilitri.Centrifugare il tubo a 300G per cinque minuti a temperatura ambiente e scartare il soprannatante. Successivamente, risospendere le cellule bersaglio a una concentrazione finale di 250.000 cellule per millilitro in mezzo 2X SYTOX Orange. Per preparare la cellula effettrice, valutare la vitalità e la concentrazione delle cellule NK-92 ed procedere solo se la vitalità è superiore all'80%, poiché una vitalità inferiore potrebbe influenzare le prestazioni del saggio.Contare e trasferire il numero richiesto di cellule NK-92 in singole provette coniche da 15 millilitri. Dopo la centrifugazione, risospendere le cellule a una concentrazione finale di 500.000 cellule per millilitro. Preparare le diluizioni delle cellule effettrici aggiungendo 240 microlitri di cellule effettrici nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti con fondo rotondo per un rapporto effettrici:bersaglio di due a uno, e aggiungere 120 microlitri di mezzo nei pozzetti rimanenti.Eseguire diluizioni seriali a raddoppio da un rapporto effettore:bersaglio di 2:1 a 0,25:1, mescolando accuratamente mediante pipettaggio almeno cinque volte e cambiando i puntali tra un trasferimento e l'altro. Successivamente, per allestire la co-coltura, procurarsi la piastra a 96 pozzetti con fondo piatto rivestita di polilisina. Immediatamente prima del trasferimento, risospendere accuratamente le cellule bersaglio ed effettore senza formare bolle, quindi aggiungere 100 microlitri di ciascuna sospensione cellulare nei pozzetti appropriati.Quindi, aggiungere 200 microlitri di PBS nei pozzetti inutilizzati circostanti. Centrifugare la piastra a 100G per due minuti a temperatura ambiente. Posizionare la piastra nel sistema di imaging cellulare in tempo reale.Acquisire immagini ogni ora per 24 ore a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Verificare la qualità delle immagini dopo la prima scansione e regolare le impostazioni di acquisizione se necessario. Regolare la separazione spettrale per correggere l'effetto di spillover dell'SYTOX Orange nel canale verde.Verificare che le cellule morte di colore arancione positive non vengano identificate erroneamente come cellule verdi positive. Per configurare l'analisi cellulare singola di cellule non aderenti, impostare il diametro dell'oggetto atteso a 15 micrometri per corrispondere al diametro cellulare approssimativo. Impostare la sensibilità della soglia e la sensibilità della trama su cinque e la sensibilità del bordo su 10 per facilitare la separazione degli aggregati cellulari.Impostare l'intervallo del filtro per l'area dell'oggetto accettato da 50 a 2.000 micrometri quadrati per escludere detriti e oggetti di grandi dimensioni. Impostare l'eccentricità massima a 0,95 per escludere oggetti non cellulari. Ottenere cellule NK umane primarie coltivate per 16-24 ore.Trasferire 500.000 cellule bersaglio in un tubo conico da 15 millilitri con fondo conico. Lavare le cellule una volta con 10 millilitri di PBS. Centrifugare le cellule a 300G per cinque minuti a temperatura ambiente.Quindi rimuovere il soprannatante. Preparare una soluzione lavorativa di estere succinimidilico di carbossifluoresceina o CFSC a 0,5 micromolare in PBS diluendo un microlitro di soluzione madre di CFSE a cinque millimolari in 10 millilitri di PBS. Ri-sospendere il pellet ottenuto a circa un milione di cellule per millilitro nella soluzione di CFSE.Incubare le cellule per 15 minuti a 37 gradi Celsius, avvolte in foglio di alluminio per proteggerle dalla luce. Quindi arrestare la reazione aggiungendo da cinque a dieci volumi di mezzo di coltura e incubare per cinque minuti a 37 gradi Celsius. Dopo la centrifugazione delle cellule, risospendere il pellet cellulare a 250.000 cellule per millilitro in modo che 100 microlitri contengano 25.000 cellule.Aggiungere 100 microlitri per pozzetto di cellule bersaglio nei pozzetti designati di una piastra rotonda da 96 pozzetti utilizzando una pipetta multicanale. Piastrare ogni condizione in triplice replicato. Successivamente, preparare 200 microlitri di soluzione di anticorpo 4X in mezzo di coltura per cellule NK per ciascun anticorpo in prova e relativo controllo isotipico abbinato.Trasferire le soluzioni di anticorpi in una piastra a pozzetti profondi. Aggiungere 50 microlitri di soluzione di anticorpo in ciascun pozzetto contenente le cellule bersaglio e mescolare accuratamente aspirando e dispensando almeno cinque volte. Aggiungere 50 microlitri di mezzo di coltura delle cellule NK per pozzetto nei pozzetti di controllo senza anticorpo e mescolare accuratamente mediante pipettaggio.Incubare la piastra per 25-30 minuti in condizioni standard di incubazione. Contare ed ottenere 200.000 cellule NK e procedere solo se la vitalità è maggiore o uguale al 75%. Ri-sospendere le cellule a 250.000 cellule per millilitro in 800 microlitri di coltura primaria di cellule NK umane. Aggiungere 50 microlitri per pozzetto di cellule NK nei pozzetti corrispondenti e mescolare accuratamente aspirando e dispensando almeno cinque volte.Successivamente, pipettare 50 microlitri per pozzetto di mezzo di coltura nei pozzetti di controllo e mescolare accuratamente. Ispezionare attentamente la piastra rotonda a 96 pozzetti per verificare che tutti i pozzetti contengano 200 microlitri con livelli di menisco uniformi e assenza di bolle. Centrifugare la piastra per due minuti a 100G, quindi incubarla per 16-18 ore in condizioni standard di incubazione.Centrifugare la piastra per cinque minuti a 300G e scartare il soprannatante. Lavare tutte le pozzette con 200 microlitri per pozzetta di buffer per la fluorescenza attivata dal sorting cellulare o buffer FACS. Preparare una miscela madre di anticorpi di superficie nel buffer FACS come indicato qui.Risospendere le cellule in 50 microlitri per pozzetto di mix master di anticorpi e mescolare accuratamente aspirando e dispensando almeno cinque volte. Incubare la piastra per 15 minuti a quattro gradi Celsius, avvolta in foglio di alluminio per proteggere dalla luce. Aggiungere 150 microlitri per pozzetto di buffer FACS.Dopo la centrifugazione, risospendere le cellule in 100 microlitri per pozzetto di DAPI cinque micromolare nel buffer FACS. Procedere immediatamente all'acquisizione in citometria a flusso senza incubazione pre-acquisizione. Eseguire la citometria a flusso utilizzando lo strumento Cytek Aurora e registrare i canali di fluorescenza per CFSE, BV421, BV785, PE-Cy7, DAPI e qualsiasi altro fluorocromo aggiuntivo.Durante la co-coltura, le cellule effettrici, le cellule bersaglio vive e le cellule morte sono state visualizzate mediante microscopia in tempo reale su cellule vive. Le cellule NK-92 con CAR2 e CAR3 hanno mostrato una cinetica di uccisione più rapida rispetto alle cellule NK-92 con CAR1, in particolare nei primi punti temporali e a parità di rapporto tra effettori e bersagli. L'uccisione delle cellule bersaglio è aumentata con rapporti effettori:bersaglio più elevati, incluso nelle cellule NK-92 di controllo, che hanno dimostrato citotossicità naturale.Le cellule NK-92 CAR2 e CAR3 hanno dimostrato una maggiore potenza a rapporti effettore:bersaglio più bassi nei tempi successivi. Mentre un potenziamento della potenza a rapporti effettore:bersaglio intermedi è stato osservato nei tempi precedenti. Sono stati definiti tre parametri, KR50, KT50 e IKI-50, per quantificare la potenza delle cellule CAR-NK-92, la cinetica di uccisione e la performance citotossica complessiva tra le popolazioni effettore.L'aggiunta di daratumumab da solo non ha ridotto la sopravvivenza delle cellule bersaglio, confermando che l'anticorpo non aveva alcun effetto diretto sulla vitalità delle cellule bersaglio in assenza di cellule effettrici. La co-coltura con cellule NK da sole ha ridotto la sopravvivenza delle cellule bersaglio a circa il 70%, indicando una citotossicità naturale di base. L'aggiunta di daratumumab ha ulteriormente ridotto la sopravvivenza cellulare a circa il 37%, coerentemente con una citotossicità mediata dall'anticorpo potenziata.Al contrario, la condizione con controllo di isotipo ha mostrato una sopravvivenza di circa il 62%, paragonabile a quella della condizione con sole cellule NK. La degranulazione delle cellule NK è risultata minima nella coltura co-coltivata senza anticorpo e massima nella condizione trattata con daratumumab, pari a circa il 31%, mentre il controllo di isotipo ha mostrato una degranulazione intermedia pari a circa il 19%. Questo protocollo consente ai ricercatori di quantificare la citotossicità naturale delle cellule NK, valutare la potenza citotossica di progetti di CAR-NK contro i tumori e confrontare l'efficacia dell'ADCC di anticorpi monoclonali. Un aspetto fondamentale da considerare durante l'esecuzione di questo protocollo è mantenere un conteggio accurato e costante delle cellule NK e delle cellule bersaglio, nonché un'accurata pipettatura e semina, al fine di garantire risultati affidabili e interpretabili.Studi futuri possono sfruttare questi protocolli per esplorare l'evasione immunitaria delle cellule NK, confrontare la suscettibilità tumorale e valutare nuove immunoterapie basate sulle cellule NK in diversi tipi di cancro.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Questo video dimostra l'attività litica delle cellule natural killer contro le cellule bersaglio colorate in modo fluorescente. Il metodo consente la misurazione della citotossicità indotta dalle cellule NK colorando le cellule morte e utilizzando un citometro a flusso per quantificare le cellule bersaglio vive e morte.

Preparazione del campione per il saggio di citotossicità cellulo-mediata Natural Killer per l'analisi citofluorimetrica

Descriviamo una singola cellula saggio ad alta prestazione per misurare la citotossicità delle cellule T quando incubati con cellule tumorali bersaglio. Questo metodo impiega una densa matrice elastomerica di sub-nanolitri pozzetti (~ 100.000 pozzetti / matrice) per confinare spazialmente le cellule T e le cellule bersaglio con rapporti definiti ed è accoppiato al microscopio a fluorescenza per monitorare effettore-bersaglio coniugazione e apoptosi successiva.

Quantitativa High-throughput cella singola test di citotossicità per le cellule T

Questo protocollo descrive un sensibile test di citotossicità basato su cellule. Enumerando la diminuzione della frequenza delle cellule T CD4+ bersaglio vive in presenza di un numero crescente di cellule T CD8+ effettrici, questo test consente la valutazione diretta dell'attività citolitica delle cellule T CD8+ antigene-specifiche.

Saggio di citometria a flusso cellulare per misurare l'attività citotossica

Un metodo semplice ed affidabile è descritto qui di analizzare un insieme di funzioni delle cellule NK come degranulazione, citochine e chemochine ai differenti sottopopolazioni di cellule NK.

Citometria a flusso basato su test per il monitoraggio delle funzioni delle cellule NK

Questo lavoro descrive un flusso di lavoro avanzato per la determinazione accurata e rapida della conta delle cellule NK (Natural Killer) e della citotossicità delle cellule NK in campioni di sangue umano.

Flusso analisi di citometria di Natural Killer cellulare Lytic attività nel Sangue umano intero

Un metodo di basato su citometria di flusso per determinare quantitativamente l'attività citotossica delle cellule natural killer di umane è mostrato qui.

Un'analisi di citotossicità di base di citometria a flusso per la valutazione dell'attività delle cellule NK umane

Descriviamo un sistema quantitativo di analisi della citolisi in vitro in tempo reale per valutare la potenza delle cellule T del recettore dell'antigene chimerico che prendono di mira le cellule tumorali liquide e solide. Questo protocollo può essere esteso per valutare altre cellule echeggiatrici immunitarie, così come i trattamenti combinati.

Un esempio di potenza in tempo reale per le cellule T del recettore dell'antigene chimerico rivolte alle cellule tumorali solide ed ematologiche

Un protocollo per valutare l'uccisione quantitativa delle cellule tumorali da parte delle cellule Jurkat che esprimono il recettore dell'antigene chimerico (CAR) mirato all'antigene tumorale singolo. Questo protocollo può essere utilizzato come piattaforma di screening per una rapida ottimizzazione dei costrutti di cerniera CAR prima della conferma nelle cellule T derivate dal sangue periferico.

Valutazione rapida della citotossicità in vitro del recettore dell'antigene chimerico che esprime Jurkat mediante imaging fluorescente

Qui, presentiamo un metodo per identificare i composti che modulano il meccanismo ADCC, un importante meccanismo di uccisione delle cellule tumorali degli anticorpi antitumorali. L'effetto citotossico delle cellule NK è misurato negli sferoidi delle cellule del cancro al seno in presenza di Trastuzumab. L'analisi delle immagini identifica le cellule killer vive e morte e le cellule bersaglio negli sferoidi.

Quantificazione della citotossicità cellulare anticorpo-dipendente in un modello di sferoide tumorale: applicazione per la scoperta di farmaci

Qui, descriviamo un metodo per creare goccioline a doppia emulsione che incapsulano una cellula T e una cellula bersaglio del cancro per esaminare l'uccisione cellulare a livello di singola cellula. Questo metodo consente la doppia quantificazione sia delle molecole citotossiche che dell'apoptosi delle cellule bersaglio all'interno di un'ampia popolazione di cellule T.

Saggio di citotossicità basato su goccioline per valutare le cellule T del recettore dell'antigene chimerico a livello di singola cellula

Ragon Institute of Mass General, MIT, and Harvard.  Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro in vitro standardizzato per la misurazione coerente della citotossicità naturale, mediata dai recettori degli antigeni chimerici e dipendente dagli anticorpi delle cellule naturali umane, utilizzando imaging a cellule vive e citometria di flusso.

Quantificazione della citotossicità delle cellule NK potenziata dai recettori antigenici chimerici e dagli anticorpi terapeutici tramite imaging a cellule vive e citometria a flusso

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