Caratterizzazione funzionale dei partner individuali pre- e postsinaptici nel sistema nervoso centrale larvale di Drosophila utilizzando CaMPARI

La nostra ricerca si concentra sulla valutazione della connettività sinaptica funzionale tra partner nodi neurali definiti nelle larve vive e dissezionate di Drosophila. I metodi convenzionali richiedono la dissezione o la stimolazione fisica. Questo protocollo utilizza l'optogenetica nelle larve intate, riducendo i reperti.

Per cominciare, sciogli il mezzo di agar di farina di mais nel microonde per 8-10 secondi senza bollire e lascialo raffreddare a temperatura ambiente senza solidificarsi. Prima del raffreddamento completo, aggiungere all-trans-retinal, o ATR, a una concentrazione di 0,5 millimolari per integrare il substrato per le mosche che necessitano di attivazione di csChrimson. Copri completamente le fiale con carta stagnola per evitare l'esposizione alla luce.

Incrocio di femmine vergini portanti i geni CaMPARI e csChrimson con maschi portatori dei geni driver GAL4 e LexA in fiale di plastica contenenti il materiale preparato. Preparare fiale parallele senza ATR come controlli. Incubare le fiale a 25 gradi Celsius fino a quando le larve raggiungono lo stadio di terzo stadio.

Usa un pennello per raccogliere una larva di terzo stadio. Sciacquare la larva in una piastra micro spot a tre pozzetti contenente 0,1 molari PBS per rimuovere eventuali alimenti aderenti. Metti una piccola quantità di argilla da modellare a ogni angolo di un coprire pulito di 18 x 18 millimetri.

Posiziona la larva in una goccia di PBS sul copricapo e lascia che si orienti con il lato ventrale verso il basso. Posiziona un vetrino pulito sul copertura contenente la larva. Fissa il coperchio applicando argilla da modellare agli angoli, usando la giusta pressione necessaria per immobilizzare la larva senza schiacciarla o rompere il vetro.

Posizionare il vetrino contenente la larva sul palco di un microscopio confocale dotato di una lente obiettivo 40x/1.2. Nell'interfaccia software del microscopio, clicca su Live. Poi, sotto il pannello Z Stack, clicca su Set First e poi Set Last seguito da Stop per acquisire una base di Z Stack di neuroni postsinaptici, che esprimono CaMPARI.

Nel menu Canali, imposta il canale verde a 488 nanometri con potenza laser dello 0,8%. Successivamente, imposta il canale rosso da 561 nanometri allo 0,8% di potenza laser. Nel menu Z Stack, imposta il valore dell'Intervallo a 1 micrometro.

Nel menu Acquisizione, scegli Preset per impostare la risoluzione di 256 x 256 pixel. Una linea con valore medio di 2, scansione bidirezionale e velocità di scansione di 9, che consente l'aggiornamento automatico del tempo dei pixel. Esegui tutte le immagini in un ambiente buio, mantenendo parametri di acquisizione identici durante tutto l'esperimento.

Imposta la luce di fotoconversione da 405 nanometri allo 0,5% di potenza laser. E la luce di stimolazione optogenetica da 561 nanometri allo 0,8% di potenza laser. Clicca su Live, poi seleziona Miglior Adattamento sotto il pannello Istogramma.

Permettere a entrambi i laser di stimolare contemporaneamente la larva per 30 secondi, poi interrompere la stimolazione. Durante l'acquisizione di ZStack post-stimolazione utilizzando gli stessi parametri della base, si osserva la fluorescenza rossa di CaMPARI nei neuroni stimolati con laser di larve alimentate con ATR con fotoconversione e controlli minimi. Nel software Fiji ImageJ, clicca su File, poi scegli Apri.

Nella finestra delle opzioni di importazione BioFormat con le impostazioni predefinite, clicca su OK per aprire l'immagine acquisita di ZStack. Nel menu Immagine, scegli Colore e poi Divide Channels per visualizzare i canali rossi e verdi dell'immagine acquisita. Per la sottrazione dello sfondo, clicca su Processo, poi seleziona Sottrai Sfondo.

Nella finestra pop-up, imposta il raggio della palla rotolante a 50 pixel, poi clicca su OK e seleziona Sì nella finestra Process Stack. Poi, nel menu Analizza, seleziona Strumenti, poi scegli ROI Manager per aprire la finestra ROI. Usa lo strumento di selezione a mano libera per delineare le aree di interesse intorno alle singole cellule.

Nella finestra ROI, seleziona Aggiungi per salvare la scaletta selezionata. Poi clicca su Misura per generare risultati di area, media, deviazione standard e densità integrata. Ripetendo il processo per più cellule della stessa larva su canali verdi e rossi separatamente.

Dopo aver esportato i risultati in un foglio di calcolo, misura il rapporto rosso-verde o R per G delle densità integrate per ciascuna cellula, e media questi valori per calcolare il rapporto medio R per G per larva sia per le immagini pre che post-stimolazione. Infine, calcolare la variazione della fluorescenza o delta R per G sottraendo il rapporto R per G pre-stimolazione dal rapporto R per G post-stimolazione per quantificare l'attività calciale post-sinaptica. Gli studi di connettività funzionale tra i neuroni di arborizzazione dendritica di classe IV o cIVda e gli interneuroni del bacino 4 nelle larve del terzo stadio hanno mostrato che gli interneuroni del bacino 4 mostravano fluorescenza verde dovuta all'espressione citosolica di CaMPARI prima della fotoconversione e della stimolazione luminosa optogenica.

Non è stata rilevata alcuna fluorescenza rossa in condizioni di base, confermando l'assenza di fotoconversione prima della stimolazione. L'esposizione simultanea alla luce fotoconvertita e la stimolazione optogenetica hanno portato alla fotoconversione CaMPARI da fluorescenza verde a rossa. L'assenza di fluorescenza rossa nel controllo indica che la fotoconversione è stata specificamente guidata dall'attività neuronale mediata da csChrimson.

La fluorescenza delta rosso rispetto al verde era significativamente più alta negli animali sperimentali rispetto a nessun controllo ATR. Questo protocollo può essere utilizzato per confermare la partnership sinaptica consentendo il tracciamento della stimolazione presinaptica seguita da risposte post-sinaptiche immediate negli animali in fase di sviluppo vivo. Il passaggio più difficile è che una corretta immobilizzazione dell'animale richieda una pressione sufficiente per impedire il movimento senza danneggiare l'animale.

Studi futuri potrebbero permettere il tracciamento, la formazione, il rafforzamento e persino l'eliminazione delle connessioni sinaptiche tra specifiche popolazioni neuronali durante lo sviluppo di un animale.