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Questo lavoro è stato sostenuto dal Cancer Biology and Precision Therapeutics Center, China Medical University, nell'ambito del programma Featured Areas Research Center Program nel quadro del progetto Higher Education Sprout Project del Ministero dell'Istruzione (MOE) a Taiwan (CBPTC-PROJ-5-2).
Ringraziamo il Centro di Biologia del Cancro e Terapie di Precisione per aver fornito finanziamenti e supporto accademico.

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Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interessi.

Diversi passaggi di questo protocollo sono fondamentali per ottenere risultati affidabili e riproducibili. In primo luogo, la qualità e la purezza dell'isolamento dei PBMC influenzano direttamente il rendimento dei macrofagi e l'efficienza della differenziazione. Un'accurata stratificazione del sangue diluito sul gradiente di Ficoll e una centrifugazione con freno disattivato sono essenziali per preservare l'interfaccia del buffy coat. Un'insufficiente lisi dei globuli rossi o un'incubazione eccessiva con il buffer lisic...

Il cancro al seno è la neoplasia più frequentemente diagnosticata tra le donne in tutto il mondo, con circa 2,3 milioni di nuovi casi ogni anno1. La malattia è clinicamente eterogenea e viene classificata in almeno quattro sottotipi molecolari principali in base allo stato dei recettori ormonali—recettore per gli estrogeni (ER) e recettore per il progesterone (PR)—e all'espressione dell'oncogene del recettore 2 del fattore di crescita epidermico umano (HER2)2. I tumori del tipo luminal A esprimono ER e/o PR senza sovraespressione di HER2 (ER/PR+ e HER2−); i tumori del tipo luminal B esprimono contemporaneamente ER/PR e HER2 (ER/PR+ e HER2+); i tumori HER2+ sono caratterizzati da un'elevata espressione di HER2 indipendentemente dallo stato dei recettori ormonali; infine, il carcinoma mammario triplo negativo (TNBC) non esprime nessuno dei tre marcatori (ER−, PR− e HER2−)2,3. Tra questi sottotipi, il TNBC rappresenta la forma clinicamente più difficile da trattare e costituisce circa il 15–20% di tutti i tumori mammari. I pazienti affetti da TNBC presentano il decorso della malattia più aggressivo, con prognosi peggiore e minore sopravvivenza globale a 5 anni, a causa della scarsa risposta alla chemioterapia convenzionale e dell'assenza di terapie mirate efficaci3,4. Inoltre, il TNBC mostra una spiccata tendenza alle metastasi viscerali, in particolare ai polmoni entro 5 anni dalla diagnosi, e i pazienti con TNBC avanzato o metastatico (mTNBC) hanno una sopravvivenza mediana che raramente supera i 2 anni5,6. Queste statistiche evidenziano la necessità urgente e insoddisfatta di nuove strategie terapeutiche per il TNBC.
L'ambiente tumorale (TME) svolge un ruolo fondamentale nella progressione del cancro al seno e nell'evasione immunitaria. I macrofagi associati al tumore sono tra le cellule immunitarie più abbondanti all'interno del TME e sono stati recentemente riconosciuti come mediatori critici dell'immunità innata anti-tumorale7,8,9. Sebbene storicamente i macrofagi tumorali (TAM) siano stati suddivisi in stati pro-infiammatori "M1" e pro-tumorali "M2", questo modello binario non riesce a cogliere l'effettiva eterogeneità dei macrofagi. Al contrario, i TAM occupano uno spettro funzionale dinamico, che evolve in risposta ai diversi segnali biochimici presenti nel TME. In questo complesso contesto, le cellule tumorali alterano attivamente l'attività dei macrofagi attraverso varie strategie di evasione immunitaria, in particolare la sovraespressione di segnali "non mangiarmi". L'asse CD47/SIRPα è stato il primo checkpoint immunitario innato identificato in questo contesto6,10 e, più di recente, il CD24 si è rivelato un nuovo e potente segnale antifagocitico11,12. Il CD24 è una piccola glicoproteina di tipo mucina, fortemente glicosilata, ancorata alla membrana cellulare tramite un legame glicosilfosfatidilinositolo13. In condizioni fisiologiche, è espresso in diverse linee cellulari immunitarie, ma viene spesso sovraespresso nei tumori solidi, inclusi i tumori del seno, ovarico, pancreatico e colorettale14. Sulle cellule tumorali, il CD24 si lega al recettore inibitorio sialic acid–binding immunoglobulin-like lectin 10 (Siglec-10) espresso sui macrofagi. Questa interazione induce la fosforilazione dei domini del motivo inibitorio basato su tirosina dell'immunorecettore (ITIM) nella coda citoplasmatica del Siglec-10, attivando le fosfatasi SHP-1 e SHP-2 che sopprimono il segnale fagocitico a valle11. È stato dimostrato che il blocco dell'interazione CD24/Siglec-10 mediante anticorpo monoclonale aumenta in modo significativo la fagocitosi da parte dei macrofagi di tumori umani esprimenti CD24. Il nostro recente studio ha inoltre mostrato che l'eliminazione genica di CD24a in cellule tumorali del seno aumenta la loro suscettibilità alla fagocitosi da parte dei macrofagi in un modello murino di carcinoma mammario triplo negativo9.
La fagocitosi mediata da cellule e da anticorpi (ADCP) è un meccanismo fondamentale attraverso il quale gli anticorpi indirizzano i macrofagi alla fagocitosi delle cellule tumorali15,16. Dopo essersi legati agli antigeni espressi dalle cellule tumorali, la regione Fc dell'anticorpo interagisce con i recettori Fcγ (FcγRs) presenti sui macrofagi, innescando cascate di segnalazione intracellulari che portano al riarrangiamento del citoscheletro, alla formazione della coppa fagocitica e all'inglobamento della cellula bersaglio17.
In questo studio, abbiamo sviluppato e validato un protocollo di imaging in tempo reale su cellule vive per misurare la fagocitosi mediata da anticorpi di cellule tumorali del seno da parte di macrofagi. Il metodo utilizza macrofagi derivati da cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) di donatori umani sani, differenziati con il fattore di stimolazione delle colonie dei macrofagi (M-CSF) e successivamente stimolati con lipopolisaccaride (LPS) e interferone gamma (IFN-γ). L'analisi mediante citometria a flusso ha confermato l'upregolazione di CD80 all'interno della popolazione CD11b⁺ dopo la stimolazione (Figura 1), supportando il fenotipo classico di attivazione. Questo stato di attivazione conferisce una robusta capacità di fagocitosi mediata da anticorpi, rendendolo particolarmente adatto alla valutazione della fagocitosi cellulare dipendente da anticorpi (ADCP). Le cellule tumorali del seno positive per CD24, marcate con GFP, fungono da cellule bersaglio e vengono opsonizzate con un anticorpo monoclonale terapeutico anti-CD24 prima della co-coltura. Gli eventi fagocitici vengono registrati per un periodo di 16 h mediante un microscopio automatizzato in condizioni ambientali controllate. Per consentire una valutazione quantitativa in parallelo con una visualizzazione dinamica, viene eseguito un saggio endpoint separato in condizioni di co-coltura identiche, permettendo una misurazione rigorosa della fagocitosi dopo la rimozione delle cellule bersaglio non internalizzate. Questo protocollo fornisce una piattaforma standardizzata, riproducibile e ricca di informazioni visive per valutare l'ADCP mediata da un anticorpo anti-CD24. In particolare, l'integrazione dell'imaging in time-lapse con una strategia complementare di quantificazione basata su endpoint consente la valutazione simultanea della cinetica e dell'entità della fagocitosi. Il metodo può essere adattato per indagare altri bersagli immunoterapici diretti ai macrofagi. Questo protocollo è particolarmente indicato per valutare l'ADCP mediata da anticorpi monoclonali terapeutici diretti contro antigeni di superficie sulle cellule tumorali. È adatto per lo screening comparativo di anticorpi candidati, la caratterizzazione dose-risposta e studi meccanicistici sull'interazione Fc–FcγR, inclusi gli effetti del blocco dei segnali "non mangiarmi" (ad esempio, CD47–SIRPα). Poiché il saggio utilizza macrofagi umani primari, è anche appropriato per studi traslazionali che richiedono la valutazione della variabilità tra donatore e donatore prima dello sviluppo clinico.
<img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71461/71461fig1.jpg" /> 
Figura 1. Generazione e validazione mediante citometria a flusso di macrofagi stimolati con IFN-γ/LPS ottenuti da cellule mononucleate del sangue periferico. Pannello superiore: le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) vengono isolate da donatori sani mediante centrifugazione su gradiente di densità utilizzando soluzione di Ficoll a 400 × g per 30 min a 20°C, con tutti i reagenti pre-equilibrati a 20°C ± 2°C. Le PBMC isolate vengono coltivate nel mezzo ImmunoCult-SF integrato con 100 ng/mL di fattore stimolante le colonie di macrofagi (M-CSF) per 7 giorni per indurre la differenziazione in macrofagi (giorno 0–7), con aggiunta di mezzo al giorno 5. Al giorno 8, i macrofagi differenziati vengono stimolati con 100 ng/mL di IFN-γ e 1 µg/mL di LPS per 48 h (giorno 8–10). Le cellule vengono quindi sottoposte ad analisi mediante citometria a flusso. Pannello inferiore: analisi citometrica dei macrofagi. Le cellule sono state marcate con un pannello di superficie costituito da CD11b-FITC, CD80-PE e CD206-PerCP-Cy5.5, seguito dall'aggiunta di DAPI prima dell'acquisizione per escludere le cellule morte. Strategia di gating: le cellule sono state innanzitutto selezionate in base alla vitalità (DAPI⁻), quindi identificate come CD11b⁺ in un grafico CD11b-FITC versus FSC-A per confermare l'identità macrofagica. Gli eventi vitali CD11b⁺ sono stati successivamente analizzati in un grafico a dispersione CD80 versus CD206 per confermare la popolazione CD80⁺CD206⁻ indotta dalla stimolazione con IFN-γ/LPS. A destra: grafico a dispersione rappresentativo di CD11b-FITC versus FSC-A che mostra come il 99,8% delle cellule selezionate fosse CD11b⁺, confermando l'identità macrofagica. A sinistra: la maggior parte delle cellule CD11b⁺ rientrava nel quadrante CD80⁺CD206⁻ (Q1: 95,2%), indicando il previsto fenotipo pro-infiammatorio nelle condizioni di stimolazione applicate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71461/71461fig1large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
Gli utenti dovrebbero considerare diversi limiti nell'applicare questa tecnica. In primo luogo, la variabilità tra donatori nei macrofagi derivati da PBMC può introdurre una varianza sostanziale nell'output fagocitico, e si raccomanda di utilizzare più donatori (n ≥ 3), riportando i dati individuali di ciascun donatore insieme ai risultati raggruppati. In secondo luogo, il formato di co-coltura in 2D non riproduce il microambiente tumorale, e i risultati dovrebbero essere convalidati in modelli tridimensionali o in vivo prima di trarre conclusioni cliniche. In terzo luogo, la finestra di imaging di 16 ore cattura eventi fagocitici precoci ma non riflette processi a lungo termine come la presentazione dell'antigene o l'attivazione immunitaria secondaria. Pertanto, l'uso combinato di imaging in tempo reale e quantificazione al termine dell'esperimento fornisce un quadro complementare che migliora sia l'interpretabilità che la riproducibilità delle misurazioni di ADCP.

<table><tbody><tr><td>Soluzione madre di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) 0,5 M</td><td>Sigma-Aldrich (o equivalente)</td><td>E7889 (o equivalente)</td><td>Utilizzato per preparare una soluzione lavorativa di EDTA 10 mM in PBS per il distacco cellulare</td></tr><tr><td>piastre per coltura cellulare a 24 pozzetti (trattate per coltura cellulare)</td><td>Corning (o equivalente)</td><td>3524</td><td>Utilizzato per la coltura congiunta di macrofagi e cellule tumorali durante il saggio di fagocitosi</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CD206 umano (citometria a flusso)</td><td>BioLegend (o equivalente)</td><td>321122 (o equivalente)</td><td>Marcatore per il fenotipo macrofagico alternativo</td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale anti-umano CD24</td><td>Thermo Fisher Scientific (o equivalente)</td><td>MA1-91384 (o equivalente)</td><td>Utilizzato per opsonizzare le cellule tumorali a fini di fagocitosi dipendente dagli anticorpi</td></tr><tr><td>Sistema automatizzato di imaging in tempo reale su cellule vive con camera di controllo ambientale (ad esempio, Lionheart FX)</td><td>Agilent Technologies (o equivalente)</td><td>Microscopio automatico BioTek Lionheart FX</td><td>Consente l'acquisizione di immagini a lungo termine in time-lapse in condizioni di temperatura controllata e &lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; condizioni</td></tr><tr><td>Software di imaging per l'acquisizione automatizzata di cellule vive (ad es. Gen5)</td><td>Agilent Technologies (o equivalente)</td><td>N/A</td><td>Utilizzato per l'acquisizione e l'analisi di dati di imaging in time-lapse</td></tr><tr><td>Centrifuga (rotore a cestello oscillante)</td><td>Thermo Fisher Scientific (o equivalente)</td><td>Multifuge X4R Pro con rotore TX-1000 (o equivalente)</td><td>Utilizzato per l'isolamento dei PBMC e i passaggi di lavaggio cellulare</td></tr><tr><td>&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubatrice (37&amp;deg;C, 5% &lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Thermo Fisher Scientific (o equivalente)</td><td>Forma a calore diretto &lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Incubatrice (o equivalente)</td><td>Mantiene le condizioni fisiologiche per la coltura cellulare</td></tr><tr><td>&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; alimentazione di gas con regolatore</td><td>Agilent Technologies (o equivalente)</td><td>N/A</td><td>Materiali &lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; per il controllo ambientale di incubatore e sistema di imaging</td></tr><tr><td>Tubi conici (15 mL e 50 mL)</td><td>Corning (o equivalente)</td><td>352070 (o equivalente)</td><td>Utilizzato per l'isolamento, il lavaggio e le fasi di centrifugazione dei PBMC</td></tr><tr><td>Tubi per prelievo del sangue rivestiti con EDTA (vacutainer)</td><td>BD Biosciences (o equivalente)</td><td>367863 (o equivalente)</td><td>Utilizzato per la raccolta di campioni di sangue intero da donatori</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>Cytiva (o equivalente)</td><td>17144003 (o equivalente)</td><td>Mezzo a gradiente di densità per l'isolamento di PBMC</td></tr><tr><td>Citometro a flusso (ad esempio, FACSCanto II)</td><td>BD Biosciences (o equivalente)</td><td>BD FACSCanto II&amp;nbsp;</td><td>Utilizzato per l'analisi fenotipica dei macrofagi</td></tr><tr><td>Microsferette di compensazione (citometria a flusso)</td><td>Biolegend (o equivalente)</td><td>424602</td><td>Utilizzato per controlli di compensazione a singolo colore</td></tr><tr><td>anticorpo FITC anti-CD11b umano (citometria a flusso)</td><td>BioLegend (o equivalente)</td><td>101205 (o equivalente)</td><td>Marcatore utilizzato per identificare i macrofagi</td></tr><tr><td>anticorpo PE anti-umano CD80 (citometria a flusso)</td><td>BioLegend (o equivalente)</td><td>375410 (o equivalente)</td><td>Marcatore associato al fenotipo di macrofago attivato</td></tr><tr><td>Linea cellulare di carcinoma mammario esprimente GFP (MDA-MB-468)</td><td>ATCC (o equivalente)</td><td>HTB-132 (o equivalente)</td><td>Cellule bersaglio utilizzate nel saggio di fagocitosi; la GFP consente la visualizzazione</td></tr><tr><td>Mezzo macrofagico ImmunoCult-SF</td><td>STEMCELL Technologies (o equivalente)</td><td>10961 (o equivalente)</td><td>Mezzo privo di siero utilizzato per la differenziazione dei macrofagi</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;Mezzo Dulbecco modificato di Eagle (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific (o equivalente)</td><td>12100046</td><td>Utilizzato per la coltura e la risospensione delle cellule tumorali</td></tr><tr><td>Anticorpo di controllo per isotipo (IgG)</td><td>Bio X Cell (o equivalente)</td><td>BE0297 (o equivalente)</td><td>Controllo negativo per il saggio di fagocitosi dipendente dagli anticorpi</td></tr><tr><td>Lipopolisaccaride (LPS)</td><td>Sigma-Aldrich (o equivalente)</td><td>L2630 (o equivalente)</td><td>Stimolo utilizzato per attivare i macrofagi in combinazione con IFN-&amp;gamma;</td></tr><tr><td>Interferone gamma umano ricombinante (IFN-&amp;gamma;)</td><td>STEMCELL Technologies (o equivalente)</td><td>78020 (o equivalente)</td><td>Citochina utilizzata per l'attivazione dei macrofagi</td></tr><tr><td>Fattore stimolante le colonie di macrofagi umano ricombinante (M-CSF)</td><td>STEMCELL Technologies (o equivalente)</td><td>78057 (o equivalente)</td><td>Fattore di crescita utilizzato per la differenziazione dei macrofagi</td></tr><tr><td>Pipette di Pasteur o pipette sierologiche</td><td>Jetbiofil (o equivalente)</td><td>GSP010010 (o equivalente)</td><td>Utilizzato per la manipolazione di liquidi durante l'isolamento di PBMC e la coltura cellulare</td></tr><tr><td>PBS (Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;-/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;-free</td><td>Thermo Fisher Scientific (o equivalente)</td><td>BP399-500 (o equivalente)</td><td>Buffer utilizzato per il lavaggio delle cellule e i passaggi di diluizione</td></tr><tr><td>Piastrine di Petri (100 mm, non&amp;ndash;trattato per coltura tissutale</td><td>Corning (o equivalente)</td><td>430591</td><td>Utilizzato per la differenziazione dei macrofagi mediante selezione per adesione</td></tr><tr><td>Buffer per la lisi dei globuli rossi (RBC)</td><td>BioLegend (o equivalente)</td><td>420301 (o equivalente)</td><td>Utilizzato per rimuovere i globuli rossi durante l'isolamento dei PBMC</td></tr><tr><td>Colorante Viobility 405/452 fissabile</td><td>Miltenyi Biotec (o equivalente)</td><td>130-130-404 (o equivalente)</td><td>Utilizzato per valutare la vitalità cellulare durante l'analisi mediante citometria a flusso</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich (o equivalente)</td><td>D9542 (o equivalente)</td><td>Utilizzato per l'esclusione delle cellule morte in citometria a flusso</td></tr></tbody></table>

imaging time-lapse della fagocitosi di cellule di cancro al seno triplo negativo marcate con proteina fluorescente verde da parte di macrofagi guidata da anticorpi

Time-Lapse Imaging of Antibody-Driven Macrophage Phagocytosis of Green Fluorescence Protein&#8211;Labeled Triple-Negative Breast Cancer Cells

La fagocitosi cellulare dipendente dagli anticorpi è un meccanismo chiave attraverso il quale i macrofagi inglobano cellule tumorali opsonizzate con anticorpi. Questo protocollo descrive un metodo di imaging in tempo reale su cellule vive per visualizzare la fagocitosi mediata da macrofagi dipendente da anticorpi nei confronti di cellule di carcinoma mammario triplo negativo che esprimono la proteina verde fluorescente e il marcatore CD24. I macrofagi sono ottenuti da cellule mononucleate del sangue periferico umano, differenziati con fattore stimolante le colonie di macrofagi e polarizzati mediante interferone gamma e lipopolisaccaride per generare un fenotipo pro-infiammatorio. Le cellule tumorali vengono opsonizzate con un anticorpo monoclonale anti-CD24 prima della co-coltura con i macrofagi, in un rapporto definito tra cellule effettrici e bersaglio. Gli eventi fagocitici vengono registrati nell'arco di 16 h mediante un microscopio automatizzato dotato di controllo ambientale per mantenere condizioni fisiologiche. L'imaging viene eseguito utilizzando canali in campo chiaro e in fluorescenza, consentendo l'identificazione delle cellule tumorali e il monitoraggio del loro inglobamento da parte dei macrofagi. Immagini rappresentative in time-lapse mostrano l'inglobamento progressivo delle cellule tumorali fluorescenti nel tempo. Per consentire una valutazione quantitativa, viene eseguito un saggio parallelo a punto terminale in condizioni di co-coltura identiche, nel quale le cellule tumorali non internalizzate vengono rimosse prima dell'imaging, permettendo una misurazione accurata degli eventi fagocitici. Questo metodo fornisce un approccio standardizzato e riproducibile per visualizzare in vitro la fagocitosi mediata da anticorpi nei macrofagi. In modo importante, l'integrazione dell'imaging in time-lapse con la quantificazione a punto terminale consente una valutazione complementare della cinetica e dell'entità della fagocitosi. Questo protocollo supporta la valutazione di anticorpi terapeutici e di immunoterapie antitumorali dirette ai macrofagi in un contesto in vitro controllato.

La corretta generazione e polarizzazione di macrofagi da PBMC è stata confermata mediante valutazione morfologica e analisi di citometria a flusso (Figura 1). I PBMC isolati mediante centrifugazione su gradiente di densità sono stati coltivati in un mezzo integrato con M-CSF, ottenendo cellule aderenti con morfologia tipica dei macrofagi entro il Giorno 7. Dopo stimolazione con IFN-γ e LPS, le cellule hanno mostrato un fenotipo compatibile con l'attivazione nelle condizioni applicate. L'anal...

Questo protocollo descrive un metodo di imaging cellulare vitale in time-lapse per visualizzare la fagocitosi mediata da macrofagi dipendente da anticorpi di cellule tumorali del seno triplo negative marcate con proteina verde fluorescente, utilizzando macrofagi derivati da cellule mononucleate del sangue periferico e un microscopio automatizzato.

Imaging time-lapse della fagocitosi di cellule di cancro al seno triplo negativo marcate con proteina fluorescente verde da parte di macrofagi guidata da anticorpi

La fagocitosi cellulare anticorpo-dipendente è un meccanismo chiave attraverso il quale i macrofagi inglobano cellule tumorali opsonizzate da anticorpi. Questo protocollo descrive un...

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

La compartimentazione delle proteine ​​sia all'interno della membrana plasmatica o in sedi intracellulari è un meccanismo di regolazione che possono influenzare notevolmente i risultati di segnalazione, di conseguenza, per comprendere la segnalazione è importante studiare il comportamento spaziale e temporale delle proteine ​​coinvolte. Descriviamo qui un sistema basato TIRF microscopia a studiare trasduzione del segnale in cellule T, ma è ampiamente applicabile.

Una tecnica di microscopia TIRF per Real-time, Imaging simultanea del TCR e delle sue proteine ​​associate segnalazione

Questo video mostra un test per monitorare gli eventi di fagocitosi dei globuli rossi (RBC) mediati da macrofagi indipendenti. I globuli rossi umani opsonizzati con immunoglobuline G (IgG) di topo vengono incubati con macrofagi di topo e osservati al microscopio confocale. I globuli rossi sono inghiottiti dai macrofagi attraverso la formazione di una coppa fagocitaria e mirati alla degradazione lisosomiale.

Imaging in tempo reale della fagocitosi macrofagica dei globuli rossi opsonizzati IgG

Si descrive un metodo per l'imaging di risposta...

Vivo Imaging di risposte droga nel microambiente tumorale in modelli murini di cancro al seno

Qui presentiamo un protocollo per quantificare la fagocitosi delle particelle fluorescenti da parte di una linea cellulare di macrofagi aderenti utilizzando un metodo fluorimetrico. Questo metodo facilita una quantificazione ad alto rendimento dell'internalizzazione delle particelle e della conseguente polimerizzazione dell'actina.

Alta Tecnica Throughput fluorometrica per la valutazione dei macrofagi fagocitosi e polimerizzazione

Questo protocollo descrive l'uso della microscopia multiphoton effettuare prolungato time-lapse imaging di interazioni multicellulari in tempo reale, in vivo a risoluzione singola cellula.

Esteso Time-lapse Imaging intravitale del Real-time multicellulare Dynamics nel microambiente tumorale

Qui descriviamo il modello e l'approccio per studiare le funzioni dei macrofagi alveolari polmonari nelle metastasi del cancro. Per dimostrare il ruolo di queste cellule nelle metastasi, è stato utilizzato il modello singenico (4T1) del carcinoma mammario in combinazione con la deplezione dei macrofagi alveolari con liposomi di clodronato.

Studiare il ruolo dei macrofagi alveolari in Breast Cancer metastasi

Descriviamo una configurazione sperimentale per visualizzare con un'alta risoluzione senza precedenti la formazione e la chiusura di fagosomi in tre dimensioni in macrofagi viventi, utilizzando la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale. Consente il monitoraggio della base della coppa fagocitica, degli pseudopodi estensibili e del sito preciso della scissione fagosomiale.

&quot;Phagosome chiusura Assay&quot; per visualizzare phagosome Formazione in tre dimensioni utilizzando la riflessione totale interna fluorescente Microscopy (TIRFM)

Qui descriviamo i metodi usando la microscopia di confocal di filatura disco ai singoli eventi fagocitica immagine di residenti macrofagi peritoneali del topo. I protocolli possono essere esteso ad altre cellule fagocitiche.

Time-lapse Imaging 3D della fagocitosi dai macrofagi del topo

Fagosoma, la rimozione fagocitica delle cellule apoptotiche, è necessaria per mantenere l'omeostasi ed è facilitata dalla recettori e vie di segnalazione che consentono il riconoscimento, il engulfment e interiorizzazione delle cellule apoptotiche. Qui, presentiamo un protocollo di microscopia di fluorescenza per la quantificazione del fagosoma e l'attività delle vie di segnalazione efferocytic.

Quantificazione del fagosoma da microscopia di fluorescenza di cella singola

In questo studio è stata esaminata l'attività fagocitica dei macrofagi contro le cellule tumorali, in particolare le cellule carcinoma mammario dei topi da 4T1. Il modello di cocoltura a cellule vive è stato stabilito e osservato utilizzando una combinazione di microscopia a contrasto di interferenza fluorescente e differenziale. Questa valutazione è stata immaginata utilizzando un software di imaging per sviluppare video time-lapse multipunto.

Time-Lapse 2D Imaging dell'attività fagocitica in M1 Macrophage-4T1 Mouse Mammary Carcinoma Cells in Co-cultures

Qui presentiamo un protocollo per l'imaging intravitale di Mycobacterium tuberculosis approvato BSL-2 attenuato. Ceppo nel polmone murino utilizzando una finestra polmonare permanente. Questo approccio consente un'analisi longitudinale a risoluzione monocellulare delle prime interazioni ospite-patogeno, inclusa localizzazione bacillare, dinamica vascolare e assorbimento di macrofagi nello stesso microambiente polmonare.

Imaging intravitale dell'attenuazione dell'Auxotrophic Mycobacterium tuberculosis nel polmone murino durante l'infezione intravascolare precoce

National Taiwan University Hospital.  This protocol describes a time-lapse live-cell imaging method to visualize antibody-dependent macrophage phagocytosis of green fluorescent protein–labeled triple-negative breast cancer cells using peripheral blood mononuclear cell–derived macrophages and an automated microscope.

Imaging time-lapse della fagocitosi di cellule di cancro al seno triplo negativo marcate con proteina fluorescente verde da parte di macrofagi guidata da anticorpi

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