Name: Quantificazione del fluoruro nel siero, nellosso e nei denti in un modello murino mediante diffusione facilitata da esametildisilossano e misurazioni con elettrodo a ioni selettivi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-08-28T12:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Scopri la quantificazione del fluoruro nel siero, nell'osso e nei denti di topi mediante diffusione facilitata da esametildisilossano e elettrodo a ioni selettivi. Questo metodo sensibile consente misurazioni accurate su campioni biologici di piccole dimensioni.

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La ricerca descritta in questa pubblicazione è stata sostenuta dalla Japan Society for the Promotion of Science; JSPS Overseas Research Fellowships 202560528 (S.Y.), Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP); 2024/07452-9 (J.S.T.) e dal National Institute of Dental and Craniofacial Research dei National Institutes of Health; R01DE027648 (M.S.) e K02DE029531 (M.S.).

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Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interessi.

Le misurazioni del fluoruro sono state effettuate utilizzando un elettrodo ionoselettivo specifico per il fluoruro (ISE) contenente un fluoruro di lantanio (LaF&#8323;membrana cristallina38,39. Questa membrana forma legami La–F altamente stabili, determinando una marcata preferenza per gli ioni fluoruro rispetto agli altri alogenuri. Secondo la letteratura elettrochimica consolidata e le specifiche del produttore, il LaF&#8323; la membrana presenta coefficienti di selettività molto bassi per il cloruro, indicando che gli ioni cloruro non producono un'interferenza misurabile nelle condizioni utilizzate in questo protocollo. Sebbene il cloruro sia naturalmente presente nei denti e nell'osso, la sua attività non influenza il potenziale dell'elettrodo, e il segnale registrato riflette specificamente l'attività del fluoruro. Il limite di rilevamento di 0,02 ppm corrisponde alla concentrazione minima quantificabile validata dal produttore per l'elettrodo selettivo al fluoruro Orion. Questo limite rappresenta la concentrazione più bassa di fluoruro alla quale l'elettrodo mantiene una risposta nernstiana stabile e una relazione lineare con la curva di calibrazione. Poiché il limite di rilevamento è definito dalle caratteristiche della membrana dell'elettrodo e validato dal produttore, non è stato necessario alcun ulteriore determinazione sperimentale per questo protocollo; tuttavia, per quanto riguarda l'estremo superiore della gamma di rilevamento, gli autori hanno osservato che masse di fluoruro superiori a circa 38.000&#160;ng in un tubo da 50&#160;&#181;L La trappola di NaOH ha determinato una risposta elettrodica non lineare, indicando che la curva di calibrazione non è più affidabile a carichi di fluoruro molto elevati. Questa non linearità è probabilmente dovuta al superamento del range ottimale di forza ionica e di attività per l'elettrodo nelle condizioni sperimentali utilizzate, piuttosto che a un limite superiore intrinseco dell'ISE stesso. Per campioni che si prevede contengano masse di fluoro superiori a questa soglia, è consigliabile aumentare il volume della trappola di NaOH per mantenere le misurazioni entro il range dinamico lineare dell'elettrodo.
Questa considerazione dovrebbe essere presa in considerazione quando si applica il protocollo a campioni con contenuto di fluoro insolitamente elevato. Poiché il passaggio di diffusione consuma l'intero volume del campione, non è stato possibile eseguire misure duplicate né esperimenti di aggiunta e recupero sui campioni biologici. Per garantire accuratezza e precisione analitica, in ogni serie di misurazioni sono stati inclusi standard di controllo qualità (QC) contenenti concentrazioni note di fluoro. Questi standard QC sono stati processati e misurati esattamente come i campioni sperimentali. In tutte le serie di analisi, le concentrazioni di fluoro misurate negli standard QC sono risultate costantemente entro il 5% rispetto ai valori attesi. Per ogni serie di 10–20 campioni, sono stati preparati parallelamente due set indipendenti di 5–6 campioni di calibrazione, e una curva di calibrazione è stata registrata prima di ogni sessione di misurazione. L'intervallo di calibrazione è stato adattato per ogni analisi in modo da approssimare le masse attese di fluoro nei campioni, che dipendevano dal tipo di campione, dalla massa di materiale aggiunta alla capsula di diffusione e dal gruppo di trattamento e dall'età dell'animale. Per le misurazioni su siero, gli standard di calibrazione corrispondevano a concentrazioni di fluoro di circa 0,06–1,20 ppm nel campione. Per le misurazioni su osso e dente, gli standard di calibrazione corrispondevano a concentrazioni di fluoro di circa 19–7.600 ppm nel campione.
Questo protocollo fornisce un approccio sensibile e riproducibile per la quantificazione della massa di ioni fluoruro nel siero, nell'osso e nei denti, mediante diffusione facilitata da esametildisilossano seguita da analisi con elettrodo selettivo per ioni. Il metodo cattura in modo affidabile il fluoruro rilasciato da diverse matrici biologiche e consente una valutazione quantitativa dell'accumulo di fluoruro dopo esposizione controllata. Risultati rappresentativi ottenuti da topi adolescenti e adulti mostrano chiare differenze dipendenti dall'età e dalla dose nel deposito di fluoruro nei diversi tessuti, evidenziando l'utilità di questo approccio nello studio del metabolismo e della tossicocinetica del fluoruro in vivo.
Un punto di forza fondamentale di questo protocollo è l'uso di piastre di diffusione che separano fisicamente la reazione di rilascio del fluoruro dall'ambiente di cattura del fluoruro. La progettazione sigillata con paraffina minimizza lo scambio con l'atmosfera e garantisce un'efficiente cattura degli ioni fluoruro liberati da goccioline di idrossido di sodio presenti sul coperchio. L'acido solforico saturo con HMDS fornisce una spinta forte e costante per il rilascio di fluoruro dai tessuti mineralizzati, inclusi strutture altamente calcificate come ossa e denti. La successiva misurazione mediante elettrodo selettivo per ioni, calibrata con standard abbinati per diffusione, consente una quantificazione accurata su un'ampia gamma dinamica. Un altro vantaggio di questo approccio è la capacità di quantificare il fluoruro in campioni biologici estremamente piccoli. I tessuti mineralizzati di topi, in particolare gli incisivi mandibolari, producono soltanto 3–5 mg di residuo incinerito per dente. I metodi analitici convenzionali spesso richiedono masse campionarie più elevate o contenuti maggiori di fluoruro per ottenere un rilevamento affidabile. Al contrario, la progettazione basata sulla diffusione concentra tutto il fluoruro rilasciato dall'intero campione in un volume ridotto e ben definito, permettendo una quantificazione accurata anche in campioni minuti con bassa massa assoluta di fluoruro. Questa caratteristica è particolarmente utile per studi che coinvolgono animali di piccole dimensioni, disponibilità limitata di tessuto o strutture mineralizzate microdissezionate.
Un limite principale di questo metodo è il limite di rilevamento dell'elettrodo selettivo per ioni (ISE) utilizzato in questo studio (0,02 ppm). I campioni di siero provenienti da animali di controllo privi di fluoruro sono spesso risultati al di sotto di questa soglia, impedendo la quantificazione di concentrazioni estremamente basse di fluoruro. Per misurare concentrazioni traccia pari o inferiori al limite di rilevamento, potrebbe essere necessario aumentare la massa o il volume del campione aggiunto alla capsula di diffusione, se disponibile, oppure ricorrere a tecniche analitiche alternative. Inoltre, il metodo richiede una diffusione notturna e un'attenta manipolazione di reagenti corrosivi, il che potrebbe limitare la produttività in studi ad alto volume. Sebbene l'ISE consenta una quantificazione sensibile del fluoruro totale, non è in grado di valutare la distribuzione spaziale all'interno dei tessuti. Approcci complementari, come la microscopia elettronica a scansione abbinata alla spettroscopia con raggi X a dispersione di energia (SEM-EDX) o l'emissione di raggi gamma indotta da particelle (PIGE), possono essere integrati per visualizzare e mappare la distribuzione del fluoruro da scala microscopica a macrosopica. Queste metodiche basate sull'imaging permettono di valutare l'accumulo localizzato di fluoruro nei tessuti mineralizzati o molli, integrando così le misurazioni effettuate con l'ISE e fornendo una valutazione più completa del contenuto di fluoruro nei tessuti.
Diversi fattori tecnici ricorrenti possono influenzare l'accuratezza e l'affidabilità della diffusione e della misurazione del fluoruro in questo protocollo, e le nostre osservazioni evidenziano come la preparazione della calibrazione, la sigillatura delle capsule per diffusione, il controllo del pH, le prestazioni dell'elettrodo e la manipolazione dei campioni influenzino complessivamente la qualità dei dati. Possibili cause di una curva di calibrazione non lineare (R2 &#60; 0,99) o di letture di campioni tissutali al di fuori dell'intervallo atteso includono errori di calcolo del volume della soluzione madre di NaF aggiunta alla capsula di diffusione o errori di pipettaggio durante la preparazione degli standard di calibrazione. Azione consigliata: preparare almeno due set indipendenti di campioni di calibrazione per ogni analisi, in modo da avere un set di riserva nel caso in cui una curva di calibrazione cada al di fuori dell'intervallo atteso. Una sigillatura incompleta della capsula di diffusione può causare una perdita di fluoruro durante il processo di diffusione, producendo letture artificialmente basse. Questo si verifica tipicamente quando viene applicata una quantità insufficiente di vaselina sul bordo del coperchio della capsula di diffusione. Azione consigliata: applicare una quantità abbondante di vaselina intorno al bordo del coperchio della capsula di diffusione e premere con fermezza per garantire una sigillatura completa. Errori di pipettaggio durante l'aggiunta della soluzione di acido acetico alla trappola di NaOH possono spostare il pH del campione al di fuori dell'intervallo ottimale di pH 5,0, causando un recupero inaccurato del fluoruro. Azione consigliata: verificare il pH di ogni campione con carta indicatrice del pH e scartare qualsiasi campione con valore al di fuori del pH 5. I campioni di calibrazione possono inoltre cadere al di fuori dei limiti validi di registrazione dell'elettrodo selettivo al fluoruro. Concentrazioni inferiori a 0,02 ppm sono al di sotto del limite di rilevamento dell'elettrodo. Azione consigliata: non utilizzare campioni di calibrazione contenenti meno di 0,02 ppm di fluoruro. Al contrario, campioni di calibrazione con concentrazioni di fluoruro eccessivamente elevate possono alterare la forza ionica della soluzione e produrre risposte non lineari dell'elettrodo. Azione consigliata: all'inizio del progetto, preparare soluzioni di calibrazione che coprano un ampio intervallo di concentrazione di fluoruro per determinare l'intervallo lineare di funzionamento dell'elettrodo specifico utilizzato. Se i campioni tissutali superano questo intervallo lineare, ridurre la massa del tessuto o aumentare il volume della trappola di NaOH e regolare di conseguenza il volume di acido acetico per mantenere il pH a 5. Difficoltà nel ottenere curve di calibrazione lineari nell'intervallo 0,02–1 ppm: una causa comune è l'invecchiamento dell'elettrodo. Elettrodi selettivi al fluoruro più vecchi perdono sensibilità a concentrazioni molto basse di fluoruro. Azione consigliata: sostituire l'elettrodo selettivo al fluoruro. Letture instabili del potenziometro (segnale che deriva o salta) si verificano tipicamente quando la superficie sensibile dell'elettrodo non è completamente immersa nella soluzione campione. Azione consigliata: abbassare l'elettrodo in modo che la superficie sensibile sia completamente coperta dal campione liquido.
Nel complesso, questo protocollo fornisce un approccio solido, basato sulla calibrazione, per la quantificazione del fluoro in diverse matrici biologiche ed è particolarmente adatto per studi volti a indagare l'esposizione al fluoro, il deposito nei tessuti e gli esiti tossicologici in modelli murini.

Il fluoruro è un anione presente in natura e un livello ottimale di fluoruro è efficace nella prevenzione delle carie dentali1,2,3,4,5. Negli Stati Uniti (U.S.), la fluorizzazione dell'acqua potabile a 0,7 ppm è stata attuata come strategia di salute pubblica per ridurre l'incidenza delle carie e promuovere la salute orale6. Tuttavia, l'ingestione prolungata di quantità eccessive di fluoruro può avere effetti avversi su diversi tessuti. Un'elevata esposizione al fluoruro altera la formazione dello smalto7,8,9, modifica la formazione ossea10 e compromette l'integrità scheletrica11.
A livello cellulare, l'esposizione al fluoruro induce diverse alterazioni metaboliche, tra cui lo stress ossidativo12, lo stress del reticolo endoplasmatico13, modificazioni epigenetiche che alterano l'espressione genica14 e l'apoptosi negli ameloblasti15,16,17,18. A livello globale, concentrazioni elevate di fluoro nelle acque sotterranee (&#62;1,5 ppm) rappresentano un problema sanitario significativo. Un recente studio di modellizzazione predittiva ha stimato che circa 180 milioni di persone in tutto il mondo potrebbero essere colpite da un'esposizione eccessiva al fluoro, con il carico maggiore che si verifica in Asia e in Africa1. Oltre all'acqua potabile, l'esposizione al fluoro avviene anche attraverso alimenti (ad esempio, prodotti ittici; ~1,9 ppm), bevande (ad esempio, tè; 0,5–6 ppm19) e prodotti dentali come il dentifricio20 (1.000–1.500 ppm).
Comprendere l'esposizione al fluoro, il suo metabolismo e il deposito nei tessuti è quindi essenziale per valutare sia i benefici terapeutici sia le possibili conseguenze tossicologiche. La quantificazione accurata del fluoro in campioni biologici — inclusi urina, siero, osso e denti — rappresenta un componente fondamentale di questo ambito di studio. Tuttavia, la misurazione è analiticamente complessa a causa del comportamento chimico del fluoro e della sua elevata affinità per matrici ricche di calcio. Circa il 99% del fluoro presente nell'organismo si accumula in tessuti mineralizzati come osso e denti21. Per affrontare queste difficoltà, sono state sviluppate diverse tecniche analitiche, tra cui la potenziometria con elettrodo iono-selettivo (ISE), la cromatografia ionica, saggi colorimetrici, procedure titrimetriche e metodi basati su attivazione nucleare22. Tra queste, la tecnica di diffusione facilitata dall'esametildisilossano (HMDS) abbinata alla misurazione mediante elettrodo selettivo per il fluoro si è affermata come uno degli approcci più affidabili e diffusi per le matrici biologiche, grazie alla sua sensibilità, riproducibilità e compatibilità con svariati tipi di campione23,24,25,26,27,28,29.
Nonostante la disponibilità di diversi metodi analitici, ciascun approccio presenta limitazioni che possono restringerne l'uso nella ricerca sperimentale o clinica. La cromatografia ionica offre elevata sensibilità e selettività, ma richiede strumentazione specializzata e un'estesa preparazione del campione30,31. I saggi colorimetrici, come il metodo SPADNS (sodium 2‑(parasulfophenylazo)‑1,8-dihydroxynaphthalene-3,6‑disulfonate), sono semplici ed economici, ma risultano suscettibili a interferenze dovute alla torbidezza e ai cromofori endogeni, il che ne limita l'affidabilità in campioni biologici complessi22,32,33. I metodi titrimetrici sono economici e diretti, ma mancano della sensibilità necessaria per la rilevazione di tracce di fluoro nella maggior parte dei campioni biologici34. Le tecniche basate su metodi nucleari o di attivazione offrono una sensibilità eccezionale, ma richiedono l'accesso a reattori o fonti di neutroni basati su acceleratori, risultando quindi impraticabili per un uso di routine in laboratorio35. Al contrario, la diffusione facilitata da HMDS seguita dalla misurazione mediante elettrodo selettivo per ioni (ISE) rappresenta un compromesso pratico tra sensibilità, costo e accessibilità, garantendo al contempo il completo rilascio del fluoro sia dai tessuti molli che da quelli mineralizzati. Questo approccio risulta particolarmente vantaggioso per studi su piccoli animali, in cui la disponibilità di tessuto è limitata e le strutture mineralizzate, come gli incisivi del topo, forniscono soltanto 3–5 mg di residuo incenerito per dente.
La capacità del metodo di diffusione–ISE di concentrare tutto il fluoruro rilasciato in un piccolo volume definito consente una quantificazione accurata anche in campioni estremamente ridotti. Ciò rende il metodo particolarmente adatto per studi tossicocinetici, esperimenti dose–risposta e indagini sul metabolismo del fluoruro durante le diverse fasi dello sviluppo. Piccoli roditori, in particolare topi C57BL/6J, sono stati ampiamente utilizzati come modelli animali per studiare gli effetti del fluoruro7,9,12,29,36 .
In questo protocollo, gli autori applicano la tecnica di diffusione facilitata da HMDS seguita dalla misurazione con elettrodo selettivo per il fluoruro per quantificare il fluoruro nel siero, nell'osso e nei denti prelevati da topi esposti a una dose elevata di fluoruro (125 ppm) rispetto ai controlli non trattati. Gli autori confrontano inoltre l'accumulo di fluoruro in topi adolescenti (6 settimane all'inizio del trattamento) e maturi (18 settimane all'inizio del trattamento) per valutare le differenze dipendenti dall'età nel metabolismo del fluoruro e nel suo deposito nei tessuti. Gli incisivi mandibolari sono stati scelti come tessuto dentale rappresentativo poiché gli incisivi dei roditori erompono in modo continuo e raggiungono un equilibrio stazionario tra eruzione e usura occlusale all'incirca a 7 settimane di età. Questo modello di crescita continua fornisce un gradiente costante e accessibile di sviluppo dello smalto, rendendo gli incisivi murini un modello ampiamente utilizzato e ben validato per lo studio della formazione dello smalto e della fluorosi dentale.

<table><tbody><tr><td>Acido acetico, glaciale</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Supelco, GR ACS</td><td>AX0073-6</td></tr><tr><td>Crogioli in allumina</td><td>Advalue Technology</td><td>12 mm OD &amp;times; 25 mm H, AL-6212</td><td>AL-6212</td></tr><tr><td>Bilancia analitica</td><td>VWR</td><td>VWR 124B2, d = 0,1 mg</td><td>&amp;mdash;</td></tr><tr><td>Disintegratore a sferette</td><td>Benchmark</td><td>BeadBug 6</td><td>&amp;mdash;</td></tr><tr><td>Ago per siringa con punta smussata</td><td>Amazon</td><td>Ago industriale con punta smussata, 14 G &amp;times; 0,5 pollici</td><td>X001TT8KX1</td></tr><tr><td>Anidride carbonica</td><td>AirGas</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td></tr><tr><td>Cappa chimica</td><td>Mott Manufacturing</td><td>Modello 7421040</td><td>&amp;mdash;</td></tr><tr><td>Saccarosio D(+)</td><td>Thermo Scientific</td><td>99,7% per biochimica</td><td>177142500</td></tr><tr><td>Soluzione di riempimento per elettrodo</td><td>Thermo Scientific</td><td>Orion IonPlus Filling Solution</td><td>900061</td></tr><tr><td>Soluzione di alcol etilico</td><td>Koptec</td><td>140 Proof</td><td>2401</td></tr><tr><td>Congelatore, &amp;minus;80 &amp;deg;C</td><td>Thermo Scientific</td><td>Revco RDE Series</td><td>&amp;mdash;</td></tr><tr><td>Guanti resistenti al calore</td><td>Fisher Scientific</td><td>Bel-Art Clavies Biohazard Autoclave Gloves</td><td>H13201</td></tr><tr><td>Esametildisilossano (HMDS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>TCI H0091, &gt;98%</td><td>H0091</td></tr><tr><td>Perossido di idrogeno</td><td>VWR</td><td>J.T. Baker, 30%</td><td>2204-01</td></tr><tr><td>Elettrodo selettivo per ioni</td><td>Thermo Scientific</td><td>Orion Fluoride ISE, doppio canale</td><td>9609BNWP</td></tr><tr><td>Mixer magnetico</td><td>VWR</td><td>360 Stirrer</td><td>&amp;mdash;</td></tr><tr><td>Spatola micro</td><td>Amazon</td><td>Spatola per incisione della cera #7A, in acciaio inossidabile</td><td>&amp;mdash;</td></tr><tr><td>Microcentrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>5427R</td><td>5404000131</td></tr><tr><td>Forno muffola</td><td>Thermo Scientific</td><td>Thermolyne Small Benchtop Muffle Furnace, 1,3 L, FB1315M</td><td>FB1315M</td></tr><tr><td>Forno</td><td>Boekel Scientific</td><td>Boekel RapidFISH</td><td>240200</td></tr><tr><td>Soluzione di paraformaldeide in PBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>4% Paraformaldeide in PBS</td><td>J19943-K2</td></tr><tr><td>Piastra di Petri</td><td>VWR</td><td>60 &amp;times; 15 mm, non trattata</td><td>25384-092</td></tr><tr><td>Paraffina solida</td><td>Thermo Scientific</td><td>Paraffina solida, bianca, pura</td><td>417090010</td></tr><tr><td>Carta indicatrice del pH</td><td>Fisher Scientific</td><td>pH-Fix 4,5&amp;ndash;10,0</td><td>92120,3</td></tr><tr><td>Piatto in porcellana</td><td>Fisher Scientific</td><td>Crogiolo Fisherbrand, 5 mL, 20 mm di altezza, forma alta</td><td>FB-965-B</td></tr><tr><td>Potenziometro</td><td>Thermo Scientific</td><td>Orion Dual Star pH/ISE Meter</td><td>2115102</td></tr><tr><td>Stativo con morsetto</td><td>VWR</td><td>Morsetto anulare, 15 cm</td><td>470104-526</td></tr><tr><td>Alimento per roditori</td><td>Bio-Serv</td><td>F1515, AIN-76A, &amp;frac12; pellet</td><td>F1515</td></tr><tr><td>Sollevatore a forbice</td><td>Amazon</td><td>Sollevatore a forbice da laboratorio</td><td>&amp;mdash;</td></tr><tr><td>Imbuto separatore</td><td>Fisher Scientific</td><td>Eisco, vetro borosilicato, 2 L</td><td>S89285</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>Certificato ACS, cristallino</td><td>S271-1</td></tr><tr><td>Fluoruro di sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>Certificato ACS, in polvere</td><td>S299-100</td></tr><tr><td>Iodrato di sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>Pellets bianchi</td><td>BP359-500</td></tr><tr><td>Sferette in acciaio inossidabile</td><td>Fisher Scientific</td><td>Scientific Industries, 5 mm, 100 pezzi</td><td>SI-CS05</td></tr><tr><td>Acido solforico</td><td>Fisher Scientific</td><td>Grado ACS</td><td>A300-500</td></tr><tr><td>TISAB II</td><td>Thermo Scientific</td><td>Orion IonPlus Application Solution</td><td>940909</td></tr><tr><td>Desiccante sotto vuoto</td><td>Fisher Scientific</td><td>Bel-Art Space Saver Vacuum Desiccator, 10 pollici</td><td>F42010-0000</td></tr><tr><td>Filtro sotto vuoto</td><td>Fisher Scientific</td><td>Flow Bottle-Top Filter, PES, 90 mm, 0,2 &amp;micro;m</td><td>597-4520</td></tr><tr><td>Rocker variabile</td><td>MidSci</td><td>LabDoctor / Benchmark Scientific</td><td>&amp;mdash;</td></tr></tbody></table>

quantificazione del fluoruro nel siero, nell'osso e nei denti in un modello murino mediante diffusione facilitata da esametildisilossano e misurazioni con elettrodo a ioni selettivi

Quantification of Fluoride in Serum, Bone, and Teeth in a Murine Model Using Hexamethyldisiloxane-Facilitated Diffusion and Ion-Selective Electrode Measurements

La quantificazione dei livelli di fluoro nei tessuti biologici è essenziale per comprendere l'esposizione, il metabolismo e la tossicità del fluoro. Questo protocollo descrive un metodo sensibile e riproducibile per misurare la massa di ioni fluoruro nel siero, nell'osso e nei denti, mediante diffusione facilitata da esametildisilossano (HMDS) seguita da analisi con elettrodo selettivo per ioni (ISE). Campioni biologici, inclusi siero, osso femorale e incisivi mandibolari, vengono raccolti da topi esposti a trattamenti controllati di fluoro. I campioni ossei e dentali vengono calcinati, macinati e idratati, mentre il siero viene processato direttamente. Ciascun campione viene trasferito in una capsula da diffusione contenente acqua ultrapura e sigillata con un coperchio rivestito di vaselina, sul quale sono presenti gocce di idrossido di sodio che fungono da trappole per il fluoro. L'iniezione di acido solforico saturo di HMDS inizia il rilascio e la diffusione del fluoro, consentendo agli ioni fluoruro liberati di essere catturati quantitativamente nelle trappole. Dopo una diffusione notturna, le gocce delle trappole per il fluoro vengono unite in un singolo campione, acidificate al range di pH richiesto e portate a un volume definito per la misurazione tramite ISE. Capsule di calibrazione preparate con masse note di fluoro generano una curva standard per la quantificazione, e campioni di controllo qualità verificano la stabilità dell'elettrodo. Risultati rappresentativi ottenuti da topi adolescenti e adulti esposti a 0 o 125 ppm di fluoro dimostrano la capacità del metodo di rilevare differenze dipendenti dall'età e dalla dose nei livelli di fluoro nel siero, nell'osso e nei denti. Questo protocollo fornisce un approccio solido, basato su calibrazione, per quantificare il fluoro in diverse matrici biologiche ed è particolarmente adatto a studi che indagano l'esposizione al fluoro, il deposito nei tessuti e gli esiti tossicologici in modelli murini. Un vantaggio fondamentale di questo metodo è la sua capacità di quantificare con precisione il fluoro in campioni estremamente piccoli, inclusi i 3–5 mg di residuo calcinato ottenuti dagli incisivi individuali del topo, poiché il processo di diffusione concentra tutto il fluoro rilasciato in un volume misurabile inferiore a 100&#160;µL.

Per dimostrare l'applicazione di questo protocollo per la misurazione delle concentrazioni di fluoro (F-) in materiali biologici, sono stati ottenuti campioni da sieri, ossa e incisivi mandibolari prelevati da topi sottoposti a trattamenti controllati di fluoro. Topi maschi C57BL/6J sono stati assegnati a due categorie d'età, adolescenti (6 settimane) e adulti (18 settimane), e hanno ricevuto acqua deionizzata priva di fluoro (0 ppm F⁻) oppure acqua potabile addizionata con fluoruro di sodio (125 ppm F⁻) per un periodo di esposizione di 6 settimane. Ogni combinazione di età e trattamento includeva cinque animali. Al termine del periodo di esposizione, sono stati prelevati siero, femori e incisivi mandibolari, e i campioni sono stati preparati e analizzati seguendo il protocollo descritto. Di seguito sono riportate le concentrazioni rappresentative di fluoro misurate nel siero, nell'osso e nei denti.
<img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71488/71488fig4.jpg" /> 
Figura 4: Concentrazioni di fluoro misurate nel siero, nell'osso femorale e negli incisivi mandibolari. Topi maschi C57BL/6J sono stati assegnati a due categorie d'età, adolescenti (6 settimane, barra aperta) e adulti (18 settimane, barra piena), e hanno ricevuto acqua deionizzata priva di fluoro (0 ppm F⁻) oppure acqua potabile addizionata con fluoruro di sodio (125 ppm F⁻) per un periodo di esposizione di 6 settimane. Al termine del periodo di esposizione, i livelli di fluoro sono stati misurati in (A) siero, (B) osso femorale e (C) incisivi mandibolari provenienti dagli stessi gruppi di trattamento. I valori nel siero al di sotto del limite di rilevamento (&#60;0,02 ppm) sono stati riportati per motivi di visualizzazione ma esclusi dall'analisi statistica. I dati sono espressi come media ± DS. Il confronto tra i gruppi adolescenti e adulti è stato effettuato mediante il test di Mann–Whitney U con correzione di Bonferroni–Dunn per confronti multipli. *p &#60; 0,05, **p &#60; 0,01 (N = 5/gruppo). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71488/71488fig4large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
Concentrazioni di fluoro nel siero 
Nei gruppi di adolescenti e adulti trattati con 0 ppm di fluoro, le concentrazioni di fluoro nel siero erano al di sotto del limite di rilevamento dell'elettrodo iono-selettivo (&#60;0,02 ppm). Nei gruppi trattati con 125 ppm, il fluoro nel siero è aumentato a 0,3 ± 0,2 ppm nel gruppo degli adolescenti e a 0,7 ± 0,2 ppm nel gruppo degli adulti (p = 0,06). Il confronto tra il gruppo di adolescenti e quello di adulti trattati con 125 ppm è stato effettuato mediante il test di Mann-Whitney U con correzione di Bonferroni-Dunn per confronti multipli. *p &#60; 0,05, **p &#60; 0,01 (N = 5/gruppo). I gruppi trattati con 0 ppm sono stati esclusi dall'analisi statistica. (Figura 4A, Tabella 1).
Concentrazioni di fluoro nell'osso femorale 
Nei gruppi trattati con 0 ppm, le concentrazioni di fluoro nel femore erano significativamente più basse negli animali adolescenti (292 ± 39 ppm) rispetto agli animali adulti (896 ± 55 ppm) (p &#60; 0,01). Al contrario, nei gruppi trattati con 125 ppm, le concentrazioni di fluoro negli adolescenti (4.108 ± 482 ppm) erano significativamente più elevate rispetto agli animali adulti (2.966 ± 612 ppm) (p = 0,04). I confronti tra i gruppi adolescenti e adulti sono stati effettuati utilizzando un test U di Mann-Whitney con correzione di Bonferroni-Dunn per confronti multipli. *p &#60; 0,05, **p &#60; 0,01 (N = 5/gruppo). (Figura 4B, Tabella 1). Figura 5A mostra il rapporto di aumento delle concentrazioni di fluoro nel femore tra i trattamenti a 0 ppm e 125 ppm per ciascun gruppo d'età. Gli adolescenti hanno mostrato un aumento di 14 volte nei livelli di fluoro a 125 ppm, mentre i topi adulti hanno mostrato un aumento di 3 volte.
Concentrazioni di fluoro negli incisivi mandibolari 
Nei gruppi 0 ppm, le concentrazioni di fluoro negli incisivi mandibolari erano significativamente più basse negli adolescenti (35 ± 4 ppm) rispetto agli animali adulti (123 ± 23 ppm) (p = 0,03). Nei gruppi trattati con 125 ppm, le concentrazioni di fluoro negli incisivi aumentarono fino a 5641 ± 955 ppm negli adolescenti e a 4392 ± 1694 ppm negli animali adulti. I confronti tra i gruppi adolescenti e adulti sono stati effettuati mediante un test U di Mann-Whitney con correzione di Bonferroni-Dunn per confronti multipli. *p &#60; 0,05, **p &#60; 0,01 (N = 5/gruppo). (Figura 4C, Tabella 1). Sebbene le concentrazioni assolute di fluoro a 125 ppm non differissero in modo significativo tra i gruppi d'età, l'aumento rispetto al valore a 0 ppm fu significativamente maggiore negli adolescenti (incremento di 161 volte) rispetto ai topi adulti (incremento di 36 volte) (Figura 5B).
<img alt="Figura 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71488/71488fig5.jpg" /> 
Figura 5: Gli adolescenti mostrano un maggiore incremento multiplo nell'accumulo di fluoro nell'osso e negli incisivi rispetto ai topi adulti. Variazione multipla delle concentrazioni di fluoro da un trattamento con 0 ppm a 125 ppm di fluoro in topi adolescenti (barra vuota) e adulti (barra piena). (A) Osso femorale e (B) Incisivo mandibolare dagli stessi gruppi di trattamento. I dati sono espressi come media ± DS. I confronti tra i gruppi adolescenti e adulti sono stati effettuati mediante un test t non appaiato. * p &#60; 0,05, (N = 5/gruppo). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71488/71488fig5large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Campione</td>
			<td colspan="4">Siero</td>
			<td colspan="4">Femore</td>
			<td colspan="4">Incisivo Mandibolare</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gruppo d'età</td>
			<td colspan="2">Adolescente</td>
			<td colspan="2">Matura</td>
			<td colspan="2">Adolescente</td>
			<td colspan="2">Matura</td>
			<td colspan="2">Adolescente</td>
			<td colspan="2">Matura</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gruppo di trattamento</td>
			<td>0 ppm</td>
			<td>125 ppm</td>
			<td>0 ppm</td>
			<td>125 ppm</td>
			<td>0 ppm</td>
			<td>125 ppm&#160;</td>
			<td>0 ppm</td>
			<td>125 ppm&#160;</td>
			<td>0 ppm</td>
			<td>125 ppm</td>
			<td>0 ppm</td>
			<td>125 ppm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>&#60; 0.02</td>
			<td>0.2</td>
			<td>&#60; 0.02</td>
			<td>0.8</td>
			<td>324</td>
			<td>4576</td>
			<td>933</td>
			<td>3081</td>
			<td>37</td>
			<td>4824</td>
			<td>161</td>
			<td>3229</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>&#60; 0.02</td>
			<td>0.1</td>
			<td>&#60; 0.02</td>
			<td>0.8</td>
			<td>229</td>
			<td>3778</td>
			<td>924</td>
			<td>3326</td>
			<td>39</td>
			<td>5451</td>
			<td>127</td>
			<td>2654</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>&#60; 0.02</td>
			<td>0.7</td>
			<td>&#60; 0.02</td>
			<td>1.0</td>
			<td>300</td>
			<td>4683</td>
			<td>877</td>
			<td>3713</td>
			<td>31</td>
			<td>5544</td>
			<td>112</td>
			<td>6997</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>&#60; 0.02</td>
			<td>0.4</td>
			<td>&#60; 0.02</td>
			<td>0.5</td>
			<td>323</td>
			<td>3832</td>
			<td>807</td>
			<td>2519</td>
			<td>35</td>
			<td>5114</td>
			<td>103</td>
			<td>4169</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>&#60; 0.02</td>
			<td>0.3</td>
			<td>&#60; 0.02</td>
			<td>0.5</td>
			<td>283</td>
			<td>3669</td>
			<td>937</td>
			<td>2192</td>
			<td>N/A</td>
			<td>7271</td>
			<td>111</td>
			<td>4909</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media</td>
			<td>&#60; 0.02</td>
			<td>0.3</td>
			<td>&#60; 0.02</td>
			<td>0.7</td>
			<td>292</td>
			<td>4108</td>
			<td>896</td>
			<td>2966</td>
			<td>35</td>
			<td>5641</td>
			<td>123</td>
			<td>4392</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DS</td>
			<td>NA</td>
			<td>0.2</td>
			<td>NA</td>
			<td>0.2</td>
			<td>39</td>
			<td>482</td>
			<td>55</td>
			<td>612</td>
			<td>3</td>
			<td>955</td>
			<td>23</td>
			<td>1694</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 1: Misurazioni individuali di fluoro nel siero, nell'osso femorale e negli incisivi mandibolari. La Tabella 1 elenca le concentrazioni individuali di fluoro (ppm F⁻) misurate nel siero, nell'osso femorale e nei campioni di incisivo mandibolare di topi adolescenti e adulti esposti a 0 ppm oppure 125 ppm di fluoro. Per ogni tipo di tessuto, i dati sono presentati in colonne corrispondenti ai quattro gruppi sperimentali: adolescenti 0 ppm, adolescenti 125 ppm, adulti 0 ppm e adulti 125 ppm. Ogni colonna include i cinque valori individuali registrati (N = 5), seguiti dalla media calcolata e dalla deviazione standard (DS). Nel gruppo di siero di adolescenti trattati con 0 ppm, tutti i valori registrati erano al di sotto del limite di rilevamento dell'elettrodo ionoselettivo (&#60;0,02 ppm). La tabella fornisce i dati numerici grezzi alla base dei valori riassuntivi e dei confronti statistici mostrati in Figura 4.

Questo protocollo descrive la preparazione di piastre per diffusione facilitata da esametildisilossano (HMDS), seguita da misurazioni con elettrodo ionoselettivo per quantificare la massa di ioni fluoruro nel siero, nell'osso e nei denti dei topi. Il metodo fornisce un approccio sensibile, basato su calibrazione, per valutare l'accumulo di fluoro in campioni biologici.

Quantificazione del fluoruro nel siero, nell'osso e nei denti in un modello murino mediante diffusione facilitata da esametildisilossano e misurazioni con elettrodo a ioni selettivi

La quantificazione dei livelli di fluoruro nei tessuti biologici è essenziale per comprendere l'esposizione, il metabolismo e la tossicità del fluoruro. Questo protocollo descrive un...

La nostra ricerca si concentra sulla quantificazione della concentrazione di fluoro nel siero, nelle ossa e nei denti di topi trattati con fluoro. I metodi esistenti richiedono campioni di grandi dimensioni o strumenti costosi. Questo protocollo misura il fluoro in campioni di microlitri o milligrammi.Come primo passo, asportare le ossa delle zampe posteriori da topi C57BL/6J adolescenti e adulti che hanno ricevuto acqua potabile integrata con fluoruro di sodio o priva di fluoruro. Dopo averle essiccate, trasferire le ossa in un crogiuolo di allumina e quindi incinerirle in un forno muffola a 600 gradi Celsius per sei ore, utilizzando una velocità di riscaldamento di 150 gradi Celsius all'ora.Posizionare una piastra di Petri non trattata da 60 per 15 millimetri su una superficie pulita. Utilizzando un ago di siringa caldo da 18 gauge, fondere un piccolo foro nel coperchio della piastra di Petri. Successivamente, con una siringa da 10 millilitri dotata di un ago smussato da 14 gauge, applicare un sigillo continuo di vaselina lungo il bordo interno del coperchio della piastra di Petri. Con una spatola microscopica, macinare le ossa calcinate all'interno di provette microcentrifughe da 1,5 millilitro fino a ottenere una polvere fine e procedere immediatamente all'elaborazione della cenere ossea polverizzata. Smaltire le parti monouso contaminate con la cenere ossea nel flusso di rifiuti chimici istituzionali. Trasferire la cenere ossea macinata in un piccolo contenitore in porcellana per ridurre al minimo la carica elettrostatica e prevenire la dispersione della polvere. Successivamente, posizionare la parte inferiore vuota della piastra di Petri su una bilancia analitica con una sensibilità di almeno 0,1 milligrammo. Utilizzando una spatola microscopica, aggiungere circa 5 milligrammi di cenere ossea e registrare il peso esatto. Coprire immediatamente la cenere pesata con 3 millilitri di acqua ultrapura.Aggiungere 50 microlitri di idrossido di sodio 0,05 normali, in tre gocce, sulla superficie interna del coperchio della piastra di Petri, lontano dal bordo, per formare una trappola per il fluoruro. Capovolgere il coperchio della piastra di Petri senza disturbare le gocce di idrossido di sodio. Sigillare saldamente il coperchio alla base della piastra di Petri con il petrolato. Preparare una soluzione di acido solforico satura di HMDS 3 normali mescolando volumi uguali di acido solforico satura di HMDS 6 normali e acqua ultrapura. Caricare immediatamente 3 millilitri della soluzione preparata in una siringa da 10 millilitri dotata di un ago da 20 gauge. Iniettare la soluzione attraverso il foro nel coperchio nell'acqua presente nella parte inferiore della piastra di diffusione. Ritirare con attenzione l'ago senza schizzare l'acido sulla superficie interna del coperchio. Sigillare rapidamente e completamente il foro di iniezione con un filo di petrolato. Posizionare le piastre di diffusione su un agitatore orbitale regolabile impostato su velocità lenta e incubare tutta la notte a temperatura ambiente.Prima di iniziare le misurazioni, posizionare l'elettrodo selettivo per ioni riempito nel relativo supporto e collegarlo al potenziometro. Posizionare una piastra di Petri non trattata su un elevatore a forbice al di sotto della superficie sensibile dell'elettrodo, assicurandosi che la superficie sensibile sia parallela al fondo della piastra. Sollevare il piano dell'elevatore a forbice finché la piastra di Petri non sia quasi a contatto con l'elettrodo. Trascorso il periodo di incubazione, rimuovere la piastra di diffusione dal rocker. Sollevare con attenzione il coperchio rompendo il sigillo di petrolato. Successivamente, capovolgere il coperchio su una superficie piana senza disturbare le tre gocce del trappola per fluoruro. Quindi, utilizzare una pipetta P20 per aggiungere da 15 a 20 microlitri di acido acetico 0,2 normali a una delle gocce del trappola per fluoruro, e fondere tutte e tre le gocce in un'unica goccia senza cambiare la punta della pipetta. Mantenere il campione combinato sul coperchio capovolto. Impostare una pipetta P100 su 75 microlitri. Aspirare l'intero volume della trappola per fluoruro senza introdurre aria, e regolare il volume del campione esattamente a 75 microlitri utilizzando acqua ultrapura. Procedere immediatamente con la misurazione. Dispensare il campione tra la superficie sensibile dell'elettrodo selettivo per fluoruro e la piastra di Petri. Assicurarsi che l'intera superficie sensibile sia immersa nel liquido senza entrare in contatto con la piastra di Petri. Attendere che la lettura si stabilizzi, quindi registrare il potenziale dell'elettrodo in millivolt ottenuto dal display del potenziometro.Nei topi che assumevano acqua potabile priva di fluoro, la concentrazione effimera di fluoro era significativamente inferiore negli adolescenti rispetto ai topi adulti. Al contrario, l'esposizione a 125 parti per milione di fluoro invertiva questo andamento, con concentrazioni femorali di fluoro significativamente più elevate negli adolescenti rispetto ai topi adulti. Dopo l'esposizione al fluoro, i topi adolescenti mostravano un aumento di 14 volte della concentrazione femorale di fluoro, mentre nei topi adulti l'aumento era minore, pari a circa tre volte.Questo protocollo misura con precisione le concentrazioni di fluoro nel siero e nei tessuti mineralizzati utilizzando volumi di campione molto ridotti. È fondamentale che la cenere pesata con precisione venga trasferita completamente nella capsula di diffusione, poiché qualsiasi perdita comprometterebbe i risultati. Speriamo che studi futuri utilizzino questo approccio per chiarire come l'accumulo di fluoro influisca sulla salute dei tessuti, sul rischio di malattie e sull'invecchiamento.

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L&#39;Assemblea e l&#39;applicazione di &quot;Shear Anelli &#39;: A Novel endoteliale modello per Orbital, unidirezionale e periodica del fluido di flusso e lo stress di taglio

Ha dimostrato qui sono protocolli per isolamento (1) appena endothelial cerebrali intatti "tubi" e misure (2) simultanee di calcio endoteliale e potenziale durante endotelio-derivato hyperpolarization della membrana. Inoltre, questi metodi consentono per la sintonizzazione farmacologico di calcio delle cellule endoteliali e segnali elettrici come variabili sperimentali individuali o interattive.

Misurazioni simultanee di calcio intracellulare e potenziale di membrana nell'endotelio cerebrale Mouse appena isolato ed intatto

Di seguito è descritta una procedura operativa standard semplificata per la profilazione del microbioma che utilizza il sequenziamento e l'analisi metagenomica del rRNA 16S utilizzando strumenti liberamente disponibili. Questo protocollo aiuterà i ricercatori che non hanno familiarità con il campo del microbioma e quelli che richiedono aggiornamenti sui metodi per ottenere una profilazione batterica a una risoluzione più elevata.

Analisi microbiota utilizzando PCR in due fasi e sequenziamento genico rRNA 16S di nuova generazione

Qui, caratterizziamo le risposte di stress proteotossico cellulare nel nematode C. elegans misurando l'attivazione di reporter trascrizionali fluorescenti e analizzando la sensibilità allo stress fisiologico.

Misurazioni delle risposte allo stress fisiologico in C. Elegans

Scopri la quantificazione del fluoruro nel siero, nell'osso e nei denti di topi mediante diffusione facilitata da esametildisilossano e elettrodo a ioni selettivi. Questo metodo sensibile consente misurazioni accurate su campioni biologici di piccole dimensioni.

Quantificazione del fluoruro nel siero, nellosso e nei denti in un modello murino mediante diffusione facilitata da esametildisilossano e misurazioni con elettrodo a ioni selettivi (Video) | JoVE Journal

Quantificazione del fluoruro nel siero, nell'osso e nei denti in un modello murino mediante diffusione facilitata da esametildisilossano e misurazioni con elettrodo a ioni selettivi

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