Microiniezione di interleucina-6 nel flusso sanguigno delle larve di pesce zebra TSC per studiare comportamenti simili a disturbi neuropsichiatrici

La mia ricerca analizza come l'infiammazione indotta da IL-6 interagisce con mutazioni genetiche a rischio per l'autismo per influenzare lo sviluppo e il funzionamento del cervello. A differenza dell'infiammazione indotta in modo generalizzato dal LPS, questo protocollo aumenta selettivamente l'IL-6, consentendo un'indagine precisa degli effetti neurosviluppati specifici della citochina. Per iniziare, procurarsi gli aghi per microiniezione, i reagenti necessari e gli embrioni di pesce zebra di due giorni dopo la fecondazione.

Preparare una soluzione di agarosio al 1% peso per volume nel mezzo E3, e riscaldarla fino a quando l'agarosio è completamente disciolto e la soluzione diventa limpida. Lasciare raffreddare brevemente la soluzione di agarosio. Versare circa 30 millilitri in una piastra di Petri da 100 millimetri per garantire uno strato uniforme sulla superficie.

Quando l'agarosio è ancora liquido, ma inizia a solidificare, posizionare delicatamente un stampo in silicone sulla superficie per creare scanalature uniformi. Trasferire circa 100 embrioni corionati di due giorni dopo la fecondazione in una piccola piastra di Petri da 50 millimetri rivestita con agarosio. Aggiungere quattro millilitri di soluzione di pronasi appena preparata alla piastra, assicurandosi che gli embrioni siano completamente immersi.

Incubare a temperatura ambiente per tre-cinque minuti. Al microscopio stereoscopico, monitorare il rilascio degli embrioni dai corioni. Ruotare o agitare delicatamente la piastra a intervalli per favorire la rimozione enzimatica dei corioni.

Continuare fino a quando la maggior parte degli embrioni viene liberata dalle corioni. Lavare accuratamente gli embrioni trasferendoli attraverso cinque o sei cambi di mezzo embrionale E3 fresco. Assicurarsi che tutte le corioni e i residui di pronasi vengano rimossi per prevenire danni alle larve e mantenere condizioni di coltura ottimali.

Utilizzando una pipetta di vetro di Pasteur, trasferire circa 50 larve dechorionate in una piastra di Petri da 100 millimetri contenente 40 millilitri di mezzo E3. Mantenere le larve nel mezzo E3 fino alla microiniezione. Sotto un microscopio stereoscopico, utilizzare pinzette fini per rompere con attenzione la punta della capillare di vetro precedentemente preparata, generando una micropipetta con un'apertura di circa tre micrometri di diametro.

Preparare una soluzione di cloruro di sodio allo 0,9% peso/volume per le iniezioni di controllo. E una soluzione di due picogrammi per nanolitro di Interleuchina 6 o IL-6 in cloruro di sodio allo 0,9% per le iniezioni di IL-6. Aggiungere un microlitro di blu di tripano allo 0,05% per ogni 10 microlitri di soluzione da iniettare per facilitarne la visualizzazione durante l'iniezione.

Con una pipetta, caricare la soluzione in una punta microloader. Successivamente, utilizzare la punta microloader per riempire all'indietro l'ago da iniezione micropipettato preparato con circa tre microlitri di soluzione di iniezione, assicurandosi che non vengano introdotte bolle d'aria. Fissare l'ago da iniezione caricato nel supporto per capillari da collegare al sistema di microiniezione.

Quindi posizionare una piccola goccia di olio minerale su un vetrino di calibrazione. Calibrare il volume di iniezione espellendo gocce nell'olio minerale. Misurare il diametro delle gocce utilizzando il vetrino di calibrazione dotato di scala da 0,01 millimetri.

Regolare la pressione di iniezione per ottenere un volume di goccia di circa un nanolitro. Anestetizzare i larve in piccoli lotti aggiungendo tricaina al mezzo E3 fino a una concentrazione finale di 1X per minimizzare lo stress e garantire una sedazione costante. Trasferire singole larve di due giorni post-fecondazione su una piastra di iniezione con agarosio solidificato.

Posizionare la piastra sotto il microscopio stereoscopico. Utilizzando una pipetta di vetro, orientare delicatamente ciascun larva in modo che il dotto di Cuvier sia chiaramente visibile e accessibile. Posizionare la punta della micropipetta nel punto di ingresso del dotto di Cuvier, seguendo il movimento delle cellule sanguigne verso il cuore sotto il microscopio stereoscopico.

Iniettare la prima goccia della soluzione preparata nel dotto di Cuvier. Dopo circa 20 secondi, iniettare una seconda goccia nel dotto di Cuvier. Dopo l'iniezione, trasferire delicatamente le larve in una nuova piastra di Petri da 100 millimetri contenente 40 millilitri di mezzo E3.

Riportare le larve in un incubatore a 28,5 gradi Celsius per il recupero. Il giorno successivo, ripetere la procedura di microiniezione come precedentemente dimostrato. A cinque giorni dalla fecondazione, utilizzare le larve per applicazioni successive, tra cui saggi comportamentali, imaging cerebrale o analisi di immunofluorescenza.

La microiniezione di IL-6 non ha influenzato la vitalità delle larve rispetto alle iniezioni di cloruro di sodio. I tassi di sopravvivenza a cinque giorni dalla fecondazione non differivano tra i gruppi iniettati con IL-6 e quelli iniettati con NACL, indicando che il regime di somministrazione è ben tollerato e non introduce tossicità non specifica. Le microiniezioni hanno leggermente ridotto la vitalità rispetto ai fratelli non iniettati.

I mutanti omozigoti per il complesso della sclerosi tuberosa 2, o TSC2, hanno mostrato livelli di base di prostaglandina E2 o PGE2 significativamente più elevati rispetto ai fratelli di tipo selvaggio. I mutanti eterozigoti per TSC2 hanno mostrato un lieve aumento, non significativo, della PGE2 basale rispetto ai fratelli di tipo selvaggio. I livelli di PGE2 sono aumentati notevolmente nei mutanti eterozigoti per TSC2 dopo microiniezione di IL-6.

Il test del campo aperto ha mostrato che i mutanti TSC2 presentavano un comportamento simile all'ansia aumentato rispetto ai fratelli di tipo selvatico nei controlli non iniettati, e le microiniezioni di IL-6 non hanno influenzato questo comportamento. I mutanti TSC2 eterozigoti e omozigoti hanno trascorso significativamente più tempo nella zona periferica dell'arena ed hanno mostrato una ridotta esplorazione del centro rispetto ai fratelli di tipo selvatico sia nei controlli non iniettati che nei larve TSC2 iniettati con IL-6. Le iniezioni di IL-6 hanno aumentato i modelli di nuoto ripetitivi e stereotipati, in particolare nei mutanti TSC2 eterozigoti.

La proporzione di mutanti eterozigoti TSC2 a cui è stata iniettata IL-6 e che mostravano un comportamento ripetitivo a circuito chiuso era significativamente aumentata rispetto ai controlli a cui era stato iniettato cloruro di sodio. Questo protocollo consente studi controllati sull'infiammazione indotta da IL-6 per valutare gli effetti dell'interazione tra geni e ambiente sullo sviluppo neurologico e sul comportamento nel pesce zebra. Tra le considerazioni fondamentali per l'esecuzione di questo protocollo vi sono l'utilizzo di aghi di dimensioni costanti, un volume di iniezione preciso di due nanolitri e la riduzione al minimo del tempo dei larvi fuori dal mezzo E3. Studi futuri potranno indagare come l'infiammazione indotta da IL-6 e il rischio genetico agiscano congiuntamente sullo sviluppo cerebrale e sul comportamento.