Software per la Mappatura dei Parametri Microgliali (MMPS): Uno strumento open-source e facile da usare per l'analisi quantitativa della morfologia della microglia

Il software per la mappatura dei parametri microgliali, o MMPS, ci permette di studiare come la ferroptosi alteri le sottopopolazioni microgliali dopo un ictus ischemico. MMPS affronta i principali colli di bottiglia nel campo dell'analisi microgliale, bypassando i requisiti software ingombranti e le conoscenze di codifica necessarie. Per cominciare, apri il repository GitHub sul computer e scarica il software di Mappatura dei Parametri Gliali o il pacchetto autonomo MMPS.

Nella cartella download, fai doppio clic per avviare l'utilità archive e estrarre automaticamente la cartella compressa. Fai doppio clic sull'icona estratta dell'applicazione MMPS per verificare e aprire il pacchetto MMPS. Clicca su seleziona l'opzione cartella immagini e naviga nella directory del computer per trovare i file del progetto.

Concedi i permessi di accesso alle cartelle e scegli la cartella di archiviazione delle immagini. Poi, clicca su seleziona cartella di output, poi scegli la directory di output. Seleziona l'immagine da elaborare, poi scegli l'etichettatura dell'immagine.

Assegna identificatori animali e gruppi di trattamento all'immagine e salva gli input. Per calcolare la dimensione del pixel dell'immagine, seleziona calibra dalla barra della scala. Seleziona i punti di inizio e fine della barra della scala, inserisci la distanza nota della barra della scala in micrometri e clicca su applica.

Seleziona il canale di fluorescenza contenente il segnale microgliale. Seleziona le immagini per l'elaborazione selezionando la casella accanto a ogni nome immagine e analizzale individualmente se la fluorescenza di fondo varia tra le immagini. Rivedi le schede originale, anteprima, processata e maschere per confrontare le fasi di elaborazione delle immagini.

Seleziona l'immagine di anteprima attuale per regolare le impostazioni di elaborazione aggiuntive. Per la sottrazione dello sfondo, imposta il valore della palla rotolante tra cinque e 150 pixel. Per ridurre gli artefatti di illuminazione, si utilizza un valore di denoise di tre e imposta i valori di nitidezza tra uno e due per migliorare la definizione dei bordi.

Dopo aver ottimizzato le impostazioni di elaborazione delle immagini, clicca su immagini selezionate per processare. Poi, seleziona scegli somas, tutte le immagini. Clicca su mostra colore C per la visualizzazione composita RGB.

Seleziona i canali, poi deseleziona i canali inutilizzati se l'immagine appare distorta nel colore. Clicca su regolazioni del display per modificare la luminosità del canale nella visualizzazione RGB. Seleziona microglia soma che mostra DAPI e la molecola adattatrice di legame calcio ionizzata uno, o la colocalizzazione IBA1.

Rimuovi il soma selezionato in modo errato usando il tasto backspace o delete. Premi invio o ritorno per procedere all'immagine successiva. Seleziona la scaletta dei soma dopo che la selezione del soma è completata.

Delinea il perimetro soma di ciascuna cellula microgliale selezionata con almeno otto punti di contorno, escludendo i processi cellulari. Rimuovere i punti di contorno posizionati in modo errato usando annulla l'ultimo punto, cancella o ripasso indietro. Premi invio, ritorno, doppio clic o clic destro per completare ogni schema di soma line.

Clicca su Genera tutte le maschere dopo aver completato la scaletta Soma. Nelle impostazioni di generazione delle maschere, regola l'intensità minima per ridurre i pixel di sfondo e bilanciare la soppressione dello sfondo e la preservazione dei branch. Seleziona QA per tutte le mascherine per iniziare il controllo della qualità delle mascherine e rivedi tutte le mascherine presentate, dalle aree più grandi alle più piccole.

Confronta ogni maschera con la microglia corrispondente usando le schede processate e maschera. Per accettare le maschere, usa la scorciatoia A. Per rifiutare le maschere, usa la scorciatoia da tastiera R.

Per annullare un'accettazione o un rifiuto, premi B. Usa i tasti freccia della tastiera per navigare tra le dimensioni delle maschere. Seleziona la maschera più grande accettabile che catturi con precisione la ramificazione microgliale senza includere cellule vicine, sfondo eccessivo, bordi dell'immagine o barre di scala. Se la maggior parte è inaccurata, usa l'opzione "cancella tutte le maschere" per rigenerare le maschere con un valore di soglia diverso.

Successivamente, seleziona calcolare caratteristiche semplici per calcolare vari parametri per le maschere accettate, poi clicca ok. Per ulteriori analisi, scarica fractalanalysisimagej. Py, sholl.

Py, e SkeletonImageJ. plugin PY. Per analisi frattali e di involucro, apri e esegui l'immagine frattali.

py come plugin di Fiji. Poi inserisci la posizione della directory di output. Inserisci la dimensione del pixel e seleziona l'opzione più grande solo per la maschera per analizzare la maschera accettata più grande per cella.

Per l'analisi dello sholl, open sholl. py come plugin di Fiji. Inserisci la posizione della directory di output, la dimensione desiderata del pixel, la dimensione del passo.

Seleziona usa raggio soma come raggio iniziale, oppure inserisci un valore fisso di raggio soma se non si usano raggi soma derivati da MMPS. Analisi dello scheletro aperto, immagine. py come plugin Fiji per l'analisi degli scheletri.

Naviga e inserisci i percorsi per la directory delle maschere, la directory di output e la dimensione dei pixel quando richiesto. Al termine, esporta tutti i risultati generati dal plugin come file di valori separati da virgole nelle specifiche directory di output. Uno studio di validazione di MMPS utilizzando un modello di neuroinfiammazione dei roditori indotto da lipopolisaccaridi o LPS ha mostrato che l'amministrazione di LPS ha significativamente ridotto la distanza media del centroide e il perimetro cellulare rispetto ai controlli trattati con veicolo.

Non sono state osservate differenze significative nell'area della mascherina, nella rotondità o nell'eccentricità tra i gruppi di trattamento. L'area del soma è stata significativamente aumentata negli animali trattati con LPS rispetto ai controlli con veicoli, compatibile con il rimodellamento morfologico associato all'attivazione delle cellule gliali. Più a valle, analisi morfologiche avanzate hanno mostrato solo una debole correlazione tra rotondità e perimetro della microglia nei ratti trattati con veicoli, e una forte correlazione nei ratti trattati con LPS, suggerendo l'associazione di un'aumentata attivazione microgliale con una riduzione della rotondità e del perimetro.

Inoltre, l'area della maschera ha mostrato forti correlazioni positive con la distanza media del centroide sia nei gruppi con veicolo che in quelli trattati con LPS, coerenti con variazioni nella ramificazione legate all'attivazione microgliale. Questo protocollo consente ai ricercatori di studiare la ramificazione microgliale intricata, l'omogeneità morfologica e la complessità strutturale. Ottenere immagini immunofluorescenti ad alta risoluzione è fondamentale per utilizzare accuratamente il MMPS.

Studi futuri possono utilizzare la MMPS per studiare come gli inibitori ferroptotici alterino la morfologia microgliale a seguito di diverse malattie del sistema nervoso come l'ictus.