Name: Saggi di co-coltura senza contatto per studi morfometrici durante le interazioni interspecifiche nei funghi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-08-28T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Scopri due saggi di co-coltura senza contatto per analisi morfometriche nei funghi. Questi metodi permettono di studiare le interazioni interspecifiche e le risposte morfologiche microbiche in modo accessibile e standardizzato.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla borsa di studio intermedia DBT-Wellcome Trust India Alliance (IA/I/19/1/504294) assegnata a RNP. KBSS è stato sostenuto dal contributo speciale per la ricerca dell'Università di Ahmedabad (AU/SRG/SAS/20-21/07_KS_03.25) e dal contributo SERB per la ricerca fondamentale (URBSASE23A6/SERB/23-24/KS_02.27). Le icone utilizzate nella Figura 1 sono state adattate da Servier Medical Art (https://smart.servier.com/), con licenza CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), e da BioArt Source, NIAID, NIH.

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Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti o in conflitto.

Un rapporto precedente, che utilizzava una piastra con pozzetti a inserto a membrana e un saggio basato sul CFS, ha mostrato che C. albicans sviluppa ife in risposta a cellule di C. glabrata o al loro CFS. Tuttavia, questa risposta non è stata indotta da altri lieviti, come Saccharomyces cerevisiae e Candida dubliniensis30. Inoltre, questa risposta ifale non si è limitata soltanto al ceppo di riferimento di laboratorio C. albicans SC5314, ma si è verificata anche in altri contesti genomici, inclusa la linea clinica WUM5A30. In questo protocollo, un flusso di lavoro standardizzato è stato sviluppato sulla base di questi risultati per quantificare tre parametri morfologici: lunghezza degli ife, volume degli ife e spessore degli ife. Inoltre, questi parametri morfologici sono stati utilizzati per valutare come le variazioni nel grado di ploidia e nello stato del locus del tipo di accoppiamento influenzino le caratteristiche morfologiche di C. albicans in risposta a una molecola induttrice secreta.
Le metodologie senza contatto descritte qui forniscono un semplice schema sperimentale per visualizzare e analizzare gli esiti morfometrici di segnali solubili interspecifici. Mentre la piastra con pozzetti a inserto membranoso permette una diffusione bidirezionale tra colture attive, il saggio basato sul CFS offre un formato scalabile poiché i componenti induttivi richiesti vengono raccolti indipendentemente dalla coltura bersaglio finale. È necessario mantenere un rapporto di circa 1:50 (C. albicans rispetto a C. glabrata) nell’impostazione della piastra con pozzetti a inserto membranoso per garantire la coerenza del saggio. Questo gradiente di concentrazione assicura un flusso adeguato di molecole induttive solubili attraverso la barriera membranosa, rimanendo al di sotto delle soglie di accumulo degli inibitori endogeni del quorum sensing, come il farnesolo, che possono inibire la cinetica di filamentazione di C. albicans31,32. Analogamente, un passaggio fondamentale nel saggio basato sul CFS è il periodo di incubazione di 18 ore necessario affinché la coltura di C. glabrata raggiunga uniformemente la fase stazionaria tardiva. Se il periodo di incubazione della coltura di C. glabrata è inferiore a 12 ore o superiore a 24 ore, il CFS raccolto avrà meno probabilità di contenere una concentrazione ottimale della molecola induttrice specifica oggetto dello studio, portando a un’induzione subottimale delle ife. Lo stadio di crescita appropriato per raccogliere il CFS o il rapporto tra le colture deve essere standardizzato per ogni nuovo obiettivo sperimentale e/o per nuove combinazioni di specie microbiche.
Per massimizzare la riproducibilità del saggio in diversi contesti di laboratorio, si raccomandano le seguenti affinazioni procedurali chiave. Si raccomanda l'uso del mezzo minimo di glucosio (GMM) per la coltivazione notturna di tutte le linee diploidi di C. albicans. L'uso del GMM sopprime l'autofilamentazione di fondo spesso osservata nel mezzo ricco di nutrienti YPD. Tale autofilamentazione è stata osservata anche in altri studi, sebbene il meccanismo sottostante non sia ancora chiaro33. Si raccomanda inoltre la rimozione fisica completa dell'inserto in membrana di policarbonato prima dell'acquisizione delle immagini, per eliminare la dispersione della luce e le aberrazioni ottiche che potrebbero interferire durante la microscopia in campo chiaro ad alto ingrandimento.
Sebbene queste configurazioni senza contatto aiutino a separare i ruoli dei componenti solubili del segnale, presentano specifiche difficoltà sperimentali. Ad esempio, i saggi senza contatto sono soggetti a rischi minori, come la rottura della membrana dovuta a un manipolamento improprio e, di conseguenza, al passaggio di microrganismi da un compartimento all'altro. Pertanto, è necessario prestare attenzione durante la posizionatura delle punte della pipetta, accertandosi che tocchino le pareti della camera degli inserti e non la membrana, durante il campionamento. Inoltre, può verificarsi una cross-contaminazione fisica tra i compartimenti a causa di dimensioni dei pori non corrette (troppo grandi), problema facilmente risolvibile utilizzando inserti con una dimensione adeguata dei pori della membrana. La sovracrescita fungina o un'eccessiva deposizione di biofilm può ricoprire la membrana porosa. Questo inconveniente viene affrontato limitando l'inoculo iniziale a un OD600 = 0,1 e non incubando per più di 12 ore. Inoltre, i microrganismi potrebbero non distribuirsi in modo omogeneo all'interno delle pozzette del dispositivo, tendendo spesso ad aggregarsi o ad aderire in prossimità della membrana, il che può portare a bias imprevisti nelle misurazioni della densità ottica. Inoltre, poiché questi sistemi separano fisicamente le due popolazioni, non possono replicare o valutare interazioni che dipendono dal contatto diretto tra cellule. Ad esempio, la maturazione di biofilm misti, la co-aggregazione meccanica o il segnale mediato da adesine della parete cellulare ancorate alla superficie. Sebbene questi saggi su piastre forniscono un'istantanea efficace della cinetica iniziale della filamentazione (a 3 h), non riescono a catturare la dinamica della crescita a lungo termine né il comportamento spaziale. Per ricercatori che necessitano di un monitoraggio continuo in tempo reale per periodi prolungati, canali di perfusione microfluidici specializzati o camere per imaging cellulare vitale automatizzate potrebbero rappresentare un'alternativa più adatta.
La geometria cellulare è fondamentalmente collegata all'efficienza metabolica, con il rapporto tra area superficiale e volume (SA/V) che funge da fattore chiave per l'acquisizione di nutrienti e il trasporto intracellulare. Nei funghi dimorfi e filamentosi, la transizione verso un morfotipo iflico allungato rappresenta un adattamento strutturale per mantenere un rapporto SA/V ottimizzato. Ciò consente un assorbimento distribuito dei nutrienti lungo la parete allungata del filamento, sostenendo al contempo processi metabolici diretti verso l'apice dell'ifite34,35,36,37. Tuttavia, il nostro studio dimostra che la scala morfometrica non è proporzionalmente uniforme tra diversi stati di ploidia e configurazioni del locus del tipo di accoppiamento.
I set di dati morfometrici generati tramite questo protocollo di tracciamento rivelano chiari trend di scala strutturale correlati alla ploidia, con linee aploidi che mostrano costantemente valori assoluti inferiori rispetto ai ceppi corrispondenti diploidi in tutte le metriche geometriche (Figura 5). All'interno dello sfondo diploide, la configurazione omozigote MATα/α ha mostrato un'accelerazione della cinetica di filamentazione (lunghezza e volume) rispetto ai ceppi MATa/a o MATa/α in queste condizioni in vitro. Considerando che una filamentazione potenziata è spesso associata a una maggiore capacità di penetrazione, non è chiaro perché gli isolati clinici di C. albicans vengano prevalentemente ottenuti come diploidi eterozigoti (MATa/α). È possibile che, all'interno di un ospite immunocompetente, lo stato eterozigote conferisca un vantaggio di fitness più ampio per la colonizzazione commensale a lungo termine. In altre parole, le caratteristiche strutturali del morfotipo MATa/α sono ottimizzate per la sopravvivenza contro il sistema immunitario dell'ospite. Pertanto, studi futuri dovrebbero sfruttare questi sistemi standardizzati di co-coltura per valutare sistematicamente il fitness comparativo dei diversi omozigoti per tipo di accoppiamento sotto diverse pressioni selettive.
Studi precedenti hanno dimostrato che la morfologia vacuolare, la dinamica di fissione e fusione e l'espansione strutturale svolgono un ruolo importante nella gestione del volume interno e della pressione di turgore dei filamenti fungini in allungamento. Ad esempio, nel patogeno del brusone del riso Magnaporthe oryzae, le transizioni distinte tra ife vegetative sottili e strutture invasive bulbiformi sono strettamente coordinate con cambiamenti nell'organizzazione vacuolare38,39,40. Tuttavia, il presente protocollo non ha monitorato direttamente la dinamica vacuolare durante la filamentazione di C. albicans; l'analisi di questi cambiamenti negli organelli interni in relazione al volume strutturale totale rappresenta una direzione interessante per futuri studi. Inoltre, sono necessarie ulteriori ricerche per determinare perché specifici componenti del secretoma fungino inducono cinetiche di scala morfologica diverse rispetto agli induttori chimici di origine ospite, come il siero.
I metodi di co-colture senza contatto descritti in questo protocollo possono essere adattati per studiare interazioni interspecifiche e trans-regno, come la dinamica di segnalazione tra popolazioni batteriche opportuniste e funghi dimorfi. Inoltre, poiché questi formati da 96 e da 24 pozzetti sono scalabili, questa piattaforma quantitativa può essere utilizzata per schermate chimiche. Tra questi esempi vi è l'identificazione di inibitori a basso peso molecolare o di nuovi composti antifungini in grado di interrompere selettivamente le vie di filamentazione stimolate dal secretoma, senza influire direttamente sulla vitalità cellulare di base.

Negli ecosistemi naturali e clinici, i microrganismi risiedono tipicamente all'interno di comunità polimicrobiche strutturate, governate da complesse reti di comunicazione intra- e&#160;inter-specie&#160;1. Questi consorzi utilizzano diversi segnali chimici, tra cui molecole di quorum sensing, composti organici volatili e peptidi e proteine secretori, per coordinare comportamenti a livello di popolazione2. La mappatura di queste dinamiche comunicative è fondamentale, poiché interazioni di nicchia cooperative, competitive o predatrici alterano in modo significativo il metabolismo microbico, l'architettura spaziale e l'adattamento allo stress3. Dal punto di vista clinico, queste reti polimicrobiche (come consorzi batteri-funghi a due specie o consorzi fungo-fungo inter-specie) mostrano frequentemente una virulenza sinergica, un'accelerata colonizzazione dei tessuti e una maggiore resistenza agli antimicrobici, rispetto alle colture pure4,5. La decifrazione dei determinanti molecolari delle comunicazioni microbiche è quindi essenziale per superare i modelli tradizionali e sviluppare nuove strategie anti-infettive in grado di interrompere la stabilità della comunità6.
Per analizzare i diversi modi di interazione microbica, i ricercatori utilizzano svariate configurazioni sperimentali, principalmente impiegate nella biologia delle cellule mammifere, nell'immunologia e nell'oncologia7,8,9. Ad esempio, i modelli di co-coltura con contatto diretto costituiscono lo standard per lo studio della segnalazione&#160;juxtacrina&#160; e degli interazioni fisiche tra cellula e cellula10. Configurazioni simili, con opportune modifiche, vengono utilizzate anche per studiare le interazioni fisiche tra microrganismi, al fine di comprendere l'inibizione crociata tra microrganismi o la risposta ai farmaci9,11,12. Tuttavia, risulta difficile distinguere i meccanismi sottostanti, poiché sia i segnali dipendenti dal contatto sia quelli diffusibili contribuiscono alla risposta osservata. Sebbene i tradizionali saggi basati sul contatto possano fornire informazioni spaziali, sono laboriosi e/o richiedono l'etichettatura di ceppi distinti, il che può risultare difficoltoso per organismi non modello. Al contrario, i saggi con dispositivi Transwell (piastre con inserti a membrana) vengono utilizzati, principalmente negli studi su cellule mammifere, per distinguere il contributo dei segnali dipendenti dal contatto e di quelli diffusibili13,14,15,16. Questo metodo risulta particolarmente utile quando la comunicazione cellulare è mediata da molecole secrete, consentendo l'analisi in tempo reale della dinamica di segnalazione tra popolazioni cellulari17. Inoltre, i saggi senza contatto offrono il vantaggio della separazione tramite membrana, che può essere integrata con modelli computazionali per tracciare dinamicamente i microrganismi che i metodi tradizionali non riescono a rilevare18. Questo approccio viene talvolta impiegato per studiare simultaneamente la cinetica dello sviluppo di diverse specie batteriche19.
Un'alternativa più economica e ad alto rendimento al saggio con piastre a pozzetti con inserti a membrana è il saggio basato sul supernatante cellulare libero (CFS) o su mezzo condizionato. È noto che questo metodo viene utilizzato in medicina rigenerativa e biologia vascolare per isolare i secretomi necessari per comprendere la riparazione tissutale mediata dalle cellule staminali e/o l'angiogenesi indotta da tumori20. Analogamente, negli studi microbiologici, i modelli basati sul CFS si sono rivelati utili per decifrare la competizione polimicrobica. Ad esempio, filtrati batterici (come gli acil-omoserina lattoni di&#160;Pseudomonas aeruginosa&#160;o i metaboliti di&#160;Lactobacillus&#160;) sono stati utilizzati per modulare la maturazione del biofilm fungino21,22.&#160;Di recente, le piattaforme microfluidiche hanno permesso una biomimesi fisiologica ad alta fedeltà grazie alle tecnologie organo-su-un-chip23,24. Sebbene i sistemi microfluidici siano stati impiegati per il rilevamento simultaneo della risposta della comunità microbica ai propri secretomi, richiedono strumentazione specializzata e competenze specifiche, e potrebbero non essere facilmente implementabili in tutti i contesti25,26,27. Pertanto, i saggi con piastre a pozzetti con inserti a membrana e quelli basati sul CFS rappresentano in molti casi i metodi preferibili. La scelta tra questi due saggi dipenderà dalla natura della molecola secretoria. Se la molecola secretoria è instabile, ovvero ha un'emivita breve, e richiede la misurazione dell'attività in tempo reale, il saggio con piastre a pozzetti con inserti a membrana è più adatto. D'altro canto, se la molecola secretoria è stabile e l'esperimento è su larga scala, un saggio basato sul CFS risulterà più economico.
L'obiettivo principale di questo protocollo è presentare una metodologia qualitativa e quantitativa passo dopo passo per il tracciamento delle caratteristiche morfologiche, utilizzando le piastre a pozzetti con inserti di membrana e le piattaforme CFS (Figura 1). Qui, tale metodologia è stata dimostrata utilizzando come esempio la comunicazione mediata da fattori secreti tra Candida albicans e Candida glabrata. Inoltre, questi strumenti possono anche quantificare gli effetti di variabili genetiche intrinseche (ploidia e stato del locus di accoppiamento) sulla modifica dello sviluppo geometrico assoluto (lunghezza, volume e diametro) dei filamenti di&#160;C. albicans&#160;quando esposti a molecole segnale secretorie. Questo protocollo consolidato fornisce una piattaforma semplice, economica e senza contatto, adatta allo studio della dinamica di segnalazione interspecie.

<table><tbody><tr><td>Filtro per siringa PES da 0,22 &amp;mu;m</td><td>Millipore (Merck)</td><td>SLGPR33RS</td><td></td></tr><tr><td>Agar agar</td><td>HiMedia</td><td>GRM666</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>HiMedia</td><td>GRM016</td><td></td></tr><tr><td>Piastra portante Nunc da 24 pozzetti con inserti per coltura cellulare (0,4 &amp;mu;m)</td><td>Thermo Scientific</td><td>141002</td><td></td></tr><tr><td>Nunc BioLite Multidish da 96 pozzetti, trattata per coltura cellulare, fondo piatto</td><td>Thermo Scientific</td><td>130188</td><td></td></tr><tr><td>Peptone proteoso</td><td>HiMedia</td><td>RM005</td><td></td></tr><tr><td>Uridina</td><td>Sigma</td><td>U6381</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>HiMedia</td><td>RM027</td><td></td></tr><tr><td>Base di azoto per lieviti, con solfato di ammonio, senza aminoacidi</td><td>HiMedia</td><td>M878</td><td></td></tr></tbody></table>

saggi di co-coltura senza contatto per studi morfometrici durante le interazioni interspecifiche nei funghi

Contactless Co-Culture Assays for Morphometric Studies During Inter-Species Interactions in Fungi

Il comportamento cellulare e la morfologia sono solitamente influenzati da vari fattori intra- ed extracellulari all'interno di una comunità microbica. Gli approcci disponibili per lo studio della comunicazione microbica possono risultare laboriosi e/o richiedere strutture specializzate e competenze specifiche.&#160;Di seguito vengono descritti due approcci complementari di co-coltura senza contatto: il saggio di co-coltura in piastre con inserti a membrana e il saggio basato sul sopranatante privo di cellule (CFS), entrambi basati sulla transizione morfologica come risposta misurabile per indagare il ruolo di diversi fattori in una data interazione interspecifica. Il sistema di piastre con inserti a membrana, pur consentendo la diffusione di molecole extracellulari, permette un'interazione in tempo reale tra specie fisicamente separate. Al contrario, il saggio basato sul CFS fornisce un approccio semplificato e scalabile per valutare le risposte a mezzi condizionati. Il protocollo qui presentato include procedure standardizzate per la preparazione delle colture, la generazione di sopranatanti condizionati, l'allestimento del saggio, la microscopia, l'acquisizione delle immagini, l'analisi morfometrica quantitativa mediante Fiji e la valutazione statistica. Tale procedura è stata illustrata con un esempio di risposta morfologica fungina a fattori intrinseci ed estrinseci. I metodi qui descritti offrono strumenti alternativi accessibili e adattabili per lo studio di nuove interazioni microbiche all'interno di una comunità e potrebbero essere facilmente estesi per indagare i meccanismi alla base della coesistenza multispecifica in un ambiente comunitario.

Saggi di co-coltura senza contatto per esplorare le interazioni interspecifiche
Le molecole segnale extracellulari solubili e a bassa abbondanza spesso mediano eventi chiave di comunicazione durante la convivenza mista di microrganismi. Tali dinamiche sono state valutate utilizzando due configurazioni cellulari senza contatto, progettate per analizzare i modelli di interazione tra C. albicans e C. glabrata, impedendo al contempo il contatto fisico diretto tra cellula e cellula. La prima configurazione ha utilizzato un sistema di coltura a piastre con inserti a membrana integrati, in cui le due popolazioni erano fisicamente separate da una membrana in policarbonato inerte porosa da 0,4 µm, che permetteva una diffusione bidirezionale libera delle molecole secrete attraverso la barriera. La seconda configurazione ha monitorato la crescita delle cellule lievitarie di C. albicans coltivate direttamente in piastre microtitolabili contenenti il surnatante privo di cellule raccolto da colture di C. glabrata in fase stazionaria (CgCFS).
In linea con gli schermi precedenti30, le cellule diploidi eterozigote di tipo selvatico di C. albicans (SC5314) hanno sviluppato facilmente vere ife in risposta sia a cellule di C. glabrata separate dal diaframma del dispositivo a inserto, sia al CgCFS filtrato. Al contrario, le cellule mantenute in un mezzo di controllo negativo puro (GMM o YPD) sono rimaste prevalentemente in forma di lievito gemmante e pseudomifale (Figura 2A). Le analisi comparative hanno dimostrato coerenza tra le due configurazioni del saggio. Entrambi i saggi hanno prodotto valori comparabili in tutti i parametri strutturali, inclusi la lunghezza, il volume e lo spessore delle ife (Figura 2). La differenza nei parametri morfologici è stata considerata significativa se il valore di p ottenuto dai test statistici appropriati, seguiti dai test post-hoc per confronti multipli, soddisfaceva il criterio di 0,05. Queste osservazioni hanno mostrato che le cellule di C. albicans non presentavano differenze significative nella lunghezza delle vere ife indotte da cellule di C. glabrata nel sistema a piastre con inserto a membrana (39,66 µm ± 6,81 µm) o quando esposte al CgCFS filtrato (37,13 µm ± 6,50 µm; Figura 2B). Analogamente, i volumi di queste ife indotte nel sistema a piastre con inserto a membrana (112,10 µm3 ± 22,59 µm3) non differivano significativamente da quelli osservati nel mezzo condizionato con CgCFS (109,78 µm3 ± 34,69 µm3; Figura 2C). Inoltre, le misurazioni del diametro delle ife hanno confermato che lo spessore medio delle ife rimaneva costante tra le due configurazioni, con valori di 1,89 ± 0,10 µm per la configurazione con inserto a membrana e di 1,92 µm ± 0,23 µm per il trattamento con CgCFS (Figura 2D).
Gli stati di ploidia e le configurazioni del tipo di accoppiamento alterano le dimensioni morfologiche in vitro
I ruoli dei livelli di ploidia e delle architetture del locus di accoppiamento nel dirigere le transizioni dimorfiche sono stati stabiliti in diversi sistemi modello fungini. Qui, la pipeline analitica di tracciamento è stata applicata per quantificare le metriche di filamentazione, in particolare la lunghezza ifale, il volume strutturale, lo spessore e il corrispondente volume della cellula madre in forma lievito, in un insieme di ceppi di C. albicans aploidi (MATa o MATα) e diploidi (MATa/a, MATα/α o MATa/α).
L'analisi strutturale ha rivelato che, a seguito dell'esposizione al secretoma induttivo di CgCFS o al siero positivo di controllo, il ceppo diploide omozigote alfa (MATα/α) ha formato filamenti con assi significativamente più lunghi (45,56 µm ± 9,24 µm e 46,62 µm ± 9,07 µm) e volume maggiore (125,24 µm3 ± 39,94 µm3 e 119,45 µm3 ± 37,32 µm3), rispetto al ceppo diploide omozigote MATa/a (Figura 3A,C). Mentre gli isolati clinici standard di C. albicans esistono prevalentemente come diploidi eterozigoti, il ceppo di riferimento MATa/α ha mostrato filamenti più lunghi e volumi maggiori rispetto al ceppo MATa/a dopo l'induzione (in particolare con siero). Tuttavia, questi valori sono risultati significativamente inferiori rispetto al ceppo omozigote MATα/α (Figura 3B,D).
Contemporaneamente, i ceppi aploidi hanno mostrato un andamento inverso: il ceppo aploide MATa ha presentato un aumento significativo della lunghezza delle ife rispetto al ceppo aploide MATα in entrambe le condizioni di induzione (CgCFS: 22,06 µm ± 5,41 µm contro 17,58 µm ± 4,12 µm; Siero: 23,71 µm ± 6,59 µm contro 21,00 µm ± 5,29 µm; Figura 4A). Curiosamente, questo aumento della lunghezza nel contesto aploide si è tradotto in un incremento del volume ifale (38,84 µm3 ± 19,58 µm3 contro 34,25 µm3 ± 19,62 µm3) solo in risposta a CgCFS (Figura 4B). Queste misurazioni iniziali in vitro suggeriscono un'interazione complessa tra gli stati di ploidia e le configurazioni del locus del tipo di accoppiamento, indicando che i loci MATa e MATα contribuiscono probabilmente in modo diverso alla dinamica della filamentazione.
Per studiare le relazioni statistiche tra queste metriche strutturali nei dataset combinati, sono state eseguite analisi di correlazione dei ranghi di Spearman (ρ) e di regressione lineare di Pearson (R2), che comprendevano tutte le varianti di ploidia e di tipo di accoppiamento testate. Sono state osservate correlazioni positive per tutte le coppie analizzate: lunghezza ifale rispetto al volume ifale, lunghezza ifale rispetto allo spessore ifale, lunghezza ifale rispetto al volume della cellula madre e volume totale ifale rispetto al volume della cellula madre in forma di lievito (Figura 5, Tabella Supplementare 1 e Tabella Supplementare 2).
La relazione più forte è stata osservata tra la lunghezza delle ife e il volume ifale calcolato (ρ = 0,91; Figura 5A). Al contrario, la correlazione più debole è stata tra il volume iniziale della cellula madre lievitica e il volume ifale emergente (ρ = 0,63; Figura 5C). Inoltre, lo spessore ifale non ha mostrato una correlazione altrettanto forte con la lunghezza ifale quanto il volume ifale (Figura 5A,D). Il volume della cellula madre, la lunghezza ifale e lo spessore ifale non hanno mostrato differenze statisticamente significative nelle loro correlazioni (Figura 5B,D). Queste distribuzioni geometriche suggeriscono che un volume iniziale maggiore della cellula madre lievitica non deve necessariamente portare a ife più lunghe o a un volume maggiore.
In sintesi, questi risultati dimostrano l'utilità sia della piastra con pozzetti a inserto membranoso sia dei saggi basati sul CFS per visualizzare e quantificare le variazioni morfogenetiche in C. albicans senza alcun contatto fisico. I dati generati da questo protocollo rivelano diverse caratteristiche morfologiche in diversi contesti di ploidia e configurazioni del tipo di accoppiamento. Queste configurazioni sperimentali senza contatto offrono una metodologia flessibile e scalabile che può essere adattata per studiare la dinamica del segnale interspecifico in diverse combinazioni microbiche.
<img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71709/71709fig1.jpg" /> 
Figura 1: Rappresentazione schematica del saggio di co-colture in pozzetti con inserti a membrana e del saggio di induzione delle ife basato sul CFS con specie di Candida. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/71709fig1large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71709/71709fig2.jpg" /> 
Figura 2: Confronto delle morfologie ifali osservate tra il saggio con piastra a pozzetti con inserto a membrana e i saggi senza contatto basati su CFS. (A) Micrografie rappresentative in campo chiaro che mostrano la risposta morfologica di C. albicans a YPD (controllo), C. glabrata in un sistema con piastra a pozzetti con inserto a membrana, oppure al mezzo condizionato con il sopranatante acellulare (CFS) di C. glabrata. Le frecce rosa, nere e bianche indicano rispettivamente lievito, pseudofe, e ife vere. Barra della scala, 10 µm. Lunghezze ifali (B), volumi ifali (C) e spessore ifale (D) di un ceppo diploide eterozigote di C. albicans (SC5314) osservati in risposta a cellule di C. glabrata in un sistema con piastra a pozzetti con inserto a membrana o al CFS di C. glabrata. I dati rappresentano la mediana ± intervalli di confidenza al 95%, ottenuti da tre esperimenti biologici indipendenti, con n = 50 cellule. ns, non significativo: p &#62; 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/71709fig2large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71709/71709fig3.jpg" /> 
Figura 3: Il tipo di accoppiamento e la zigosità hanno effetti significativi sulla morfologia delle ife nei diploidi di C. albicans. Diagrammi che mostrano il confronto tra le lunghezze delle ife in risposta alla molecola induttrice indicata, tra diploidi omozigoti (A) e tra diploidi etero- e omozigoti (B) di C. albicans. Analogamente, sono mostrati i volumi ifali comparativi, in risposta alle molecole induttrici menzionate, tra diploidi omozigoti (C) e tra diploidi etero- e omozigoti (D). Controllo: YPD, mezzo di controllo non induttore di ife. I dati rappresentano la mediana ± intervalli di confidenza al 95%, ottenuti da tre esperimenti biologici indipendenti, con n = 50 cellule. I numeri indicati in alto nei grafici corrispondono ai valori p, determinati mediante test del rango sommato di Wilcoxon. **: p &#60; 0,01, ***: p &#60; 0,001, ****: p &#60; 0,0001, statisticamente significativo; ns, non significativo: p &#62; 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/71709fig3large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71709/71709fig4.jpg" /> 
Figura 4: Caratteristiche delle ife in ceppi aploidi di C. albicans in risposta a diversi induttori molecolari. I grafici mostrano le lunghezze (A) e i volumi delle ife (B) in ceppi aploidi di C. albicans in risposta all'induttore indicato. Controllo: YPD, mezzo di controllo non induttivo per la formazione di ife. I dati rappresentano la mediana ± intervallo di confidenza al 95%, ottenuti da tre esperimenti biologici indipendenti, con n = 50 cellule. I numeri indicati riportano i valori di p, calcolati mediante il test di Wilcoxon per la somma dei ranghi. **: p &#60; 0,01, ***: p &#60; 0,001, ****: p &#60; 0,0001, statisticamente significativo; ns, non significativo: p &#62; 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/71709fig4large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figura 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71709/71709fig5.jpg" /> 
Figura 5: Correlazione tra i parametri morfologici corrispondenti alla ploidia di C. albicans. I grafici mostrano la correlazione di Spearman e la regressione lineare tra i parametri morfologici utilizzati in questo studio, ovvero volume dell'ifa e lunghezza dell'ifa (A), volume cellulare e lunghezza dell'ifa (B), volume cellulare e volume dell'ifa (C), e spessore dell'ifa e lunghezza dell'ifa (D). ρ: coefficiente di correlazione di Spearman; R2: coefficiente di determinazione ottenuto dall'analisi di regressione lineare; p: valore p. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/71709fig5large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stirpe</td>
			<td>Specie</td>
			<td>Ploidia</td>
			<td>Genotipo</td>
			<td>Fonte</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBS138</td>
			<td>Candida glabrata</td>
			<td>Aploide (1n)</td>
			<td>MATα</td>
			<td>ATCC 2001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC5314</td>
			<td>Candida albicans</td>
			<td>Diploide (2n)</td>
			<td>Emizigote (MATa/α)</td>
			<td>ATCC MYA-2876</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBY1132</td>
			<td>Candida albicans</td>
			<td>Diploide (2n)</td>
			<td>Omozigote (MATa/a); arg4Δ/arg4Δ, leu2Δ/leu2Δ, his1Δ/his1Δ, URA3/ura3Δ</td>
			<td rowspan="2">Schaefer, D., Côte, P., Whiteway, M., Bennett, R.J. Barrier Activity in Candida albicans Mediates Pheromone Degradation and Promotes Mating. Eukaryotic Cell. 6 (6), 907–918, doi: 10.1128/ec.00090-07 (2007).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBY1133</td>
			<td>Candida albicans</td>
			<td>Diploide (2n)</td>
			<td>Omozigote (MATα/α); arg4Δ/arg4Δ, leu2Δ/leu2Δ, his1Δ/his1Δ, URA3/ura3Δ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GZY896</td>
			<td>Candida albicans</td>
			<td>Aploide (1n)</td>
			<td>Omozigote (MATa); ura3∆::imm434 his4 gal1∆::ura3∆::HIS4</td>
			<td rowspan="2">Hickman, M.A. et al. Il Candida albicans ‘diploide obbligato’ forma aploidi competenti per l’accoppiamento. Nature. 494 (7435), 55–59, doi: 10.1038/nature11865 (2013).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GZY803</td>
			<td>Candida albicans</td>
			<td>Aploide (1n)</td>
			<td>Omozigote (MATα); his4 ura3Δ::HIS4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 1: Ceppi di Candida albicans e Candida glabrata utilizzati in questo studio. La tabella riporta le denominazioni, i genotipi espliciti, gli stati di ploidia e la zigosità del tipo di accoppiamento per i ceppi fungini valutati nei saggi di co-coltura in piastre con inserti a membrana senza contatto e nei saggi basati su supernatante privo di cellule (CFS).
Tabella supplementare 1: Dati delle analisi statistiche effettuate su vari parametri morfologici di C. albicans. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/Supplemental Table S1.xlsx" target="_blank">Cliccare qui per scaricare il file.</a>
Tabella supplementare 2: Valori grezzi di tutti i replicati biologici dei vari parametri morfologici di C. albicans valutati in questo studio.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/Supplemental Table S2.xlsx" target="_blank">Cliccare qui per scaricare il file.</a>
File supplementare 1: Elenco dei mezzi utilizzati in questo studio con le relative composizioni.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/Supplemental File 1.xlsx" target="_blank">Fare clic qui per scaricare il file.</a>

Vengono descritti due approcci di co-coltura senza contatto per la valutazione qualitativa e quantitativa delle risposte morfologiche fungine durante interazioni interspecifiche. Il protocollo illustra come fattori intrinseci influenzino la crescita ifale, utilizzando un saggio interspecifico su Candida come esempio. Questi metodi possono essere facilmente adattati per studiare la comunicazione interspecifica tra microrganismi in organismi diversi.

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Studiamo la comunicazione molecolare nelle interazioni tra ospite e patogeno e tra specie fungine, chiedendoci come i segnali secreti modifichino la morfologia e il comportamento microbico. I metodi esistenti possono essere laboriosi, costosi o poco chiari. Questo protocollo propone un saggio semplice, adattabile e senza contatto per studiare nuove interazioni interspecie tra microrganismi. Questo protocollo supporta la ricerca fondamentale e traslazionale sulle interazioni interspecie e interregno in diversi sistemi biologici e clinici.Iniziare posizionando una piastra di agar con mezzo minimo di glucosio contenente colonie di Candida glabrata CBS 138, un’ansa sterile e un tubo contenente brodo sterile di estratto di lievito peptone destrosio, o brodo YPD, all’interno della cappa a sicurezza biologica. Prelevare una singola colonia isolata dalla piastra e usarla per inoculare 10 millilitri di brodo YPD. Incubare a 37 gradi Celsius con agitazione continua a 200 rpm per 18 ore. Prelevare la coltura ottenuta dopo la notte. Verificare la morfologia del lievito e l’assenza di contaminazioni mediante microscopia ottica. Trasferire la coltura in un tubo conico da 15 millilitri. Centrifugare a 5.000 x g per cinque minuti a 25 gradi Celsius. Scartare delicatamente il soprannatante e conservare il pellet cellulare per il saggio con inserto di membrana. Per il ceppo bersaglio Candida albicans, inoculare una singola colonia in 5 millilitri di brodo GMM per un ceppo diploide, oppure in brodo YPD per un ceppo aploide. Incubare la coltura inoculata a 37 gradi Celsius con agitazione a 200 rpm per 12 ore. Verificare la densità ottica della coltura dopo la notte a 600 nanometri. Successivamente, diluire la coltura con brodo GMM preriscaldato fino a un volume finale di 1 millilitro e una densità ottica finale a 600 nanometri di 0,1.Prendere una piastra sterile per colture cellulari a 24 pozzetti. Aggiungere 1 millilitro di sospensione di Candida albicans con un OD a 600 nanometri di 0,1 in ciascun pozzetto inferiore selezionato, ovvero nella camera addominale di una piastra per colture cellulari a doppio comparto. Successivamente, recuperare il pellet di Candida glabrata e risospendere in 1 millilitro di brodo GMM. Centrifugare a 5.000 x g per 3 minuti e scartare il soprannatante. Ripetere il lavaggio due volte. Risospendere il pellet finale in brodo GMM fresco e regolare l'OD a 600 nanometri della sospensione cellulare a cinque. Successivamente, utilizzando pinze sterili, posizionare un inserto sterile con membrana in policarbonato da 0,4 micrometri in ciascun pozzetto operativo. Fissare saldamente l'inserto nei pozzetti ed aggiungere 750 microlitri della sospensione preparata di Candida glabrata in ciascuna camera superiore o luminale. Coprire la piastra assemblata e incubare a 37 gradi Celsius, in condizioni statiche, per tre ore. Al termine dell'incubazione, utilizzare pinze sterili per rimuovere ciascun inserto superiore e smaltirlo in sicurezza. Posizionare la piastra a 24 pozzetti su un microscopio invertito dotato di ottica DIC e obiettivi con lunga distanza lavorativa da 10x, 20x e 40x per la valutazione morfologica.Trascorso il periodo di incubazione richiesto, esaminare il fondo delle pozzette con l'obiettivo 10x per verificare una distribuzione uniforme delle cellule e identificare errori di tracciamento o aggregazioni anomale. Acquisire almeno 10 campi di vista distinti utilizzando l'obiettivo calibrato 20x per ottenere il set di dati principale relativo al conteggio dei filamenti e alla distribuzione della popolazione. Per un'analisi fenotipica dettagliata e le misurazioni dei contorni cellulari, acquisire microfotografie con l'obiettivo 40x a lunga distanza lavorativa. Successivamente, salvare tutti i file immagine grezzi. Avviare l'ultima versione del software Fiji. Aprire la microfotografia di interesse selezionando File seguito da Apri. Per misurare la lunghezza dell'ifa, fare clic sull'icona di selezione Linea e scegliere lo strumento Linea segmentata. Posizionare il cursore al punto di giunzione in cui il filamento emerge dalla parete cellulare della cellula madre lievitica. Tracciare l'asse longitudinale centrale dell'ifa, aggiungendo punti di ancoraggio per seguire curve e pieghe, fino a raggiungere l'estremità apicale. Eseguire il comando di misura utilizzando Controllo + M su Windows o comando + M su Mac OS per registrare la lunghezza totale, L, in micrometri nella finestra Risultati. Utilizzare lo strumento Pennello per contrassegnare la cellula misurata ed evitare analisi duplicate. Individuare la cellula lievitica madre a cui è collegata. Con lo strumento Linea segmentata, disegnare e misurare una linea retta lungo l'asse maggiore massimo della cellula per registrare l'asse maggiore, A. Quindi disegnare e misurare una linea perpendicolare all'asse maggiore, attraverso l'intervallo trasversale più ampio, per registrare l'asse minore, B. Calcolare il volume della cellula lievitica madre, CV, in micrometri cubi utilizzando il modello di sferoide prolato incluso nel software. Per misurare lo spessore dell'ifa, utilizzare lo strumento Linea segmentata per tracciare una linea da esterno a esterno della parete, perpendicolare all'asse della lunghezza dell'ifa. Registrare il diametro in tre posizioni equidistanti lungo il filamento. Calcolare la media aritmetica dei tre diametri per ottenere lo spessore medio, d, e dividerlo per 2 per ottenere il raggio, r. Calcolare il volume totale dell'ifa, HV, in micrometri cubi trattando il filamento non ramificato come un cilindro.Calcolare il valore medio o mediano della misurazione cellulare per ciascun replicato biologico e utilizzare questi valori a livello di replicato per i confronti statistici successivi. Prima di applicare metodi parametrici, valutare la normalità del set di dati dei replicati biologici mediante il test di Shapiro-Wilk o di D'Agostino-Pearson. Per un confronto tra due gruppi, utilizzare un test t di Student a due code non appaiato quando il set di dati segue una distribuzione normale. Dopo aver eseguito le analisi statistiche e preparato le rappresentazioni grafiche, applicare notazioni statistiche coerenti in tutte le figure.Le cellule di Candida albicans hanno sviluppato ife vere in due sistemi sperimentali senza contatto, sia quando esposte a cellule di Candida glabrata separate da membrana sia a supernatante acellulare filtrato di Candida glabrata. Le cellule di controllo, d'altro canto, hanno mantenuto prevalentemente morfologie lievitarie e pseudofillamentose. Non sono state osservate differenze significative tra il co-coltura con separazione mediante membrana e il saggio con CFS filtrato, entrambi i quali hanno prodotto lunghezze, volumi e spessori delle ife comparabili.Il protocollo consente ai ricercatori di studiare la coesistenza di più specie misurando le risposte morfologiche alla segnalazione interspecifica all'interno delle comunità microbiche. La sfida principale consiste nel garantire lo scambio molecolare attraverso la membrana, che potrebbe essere affrontata mediante agitazione della piastra e mantenendo una pressione idrostatica sufficiente. L'analisi in tempo reale della dinamica degli organelli potrebbe rivelare come la comunicazione molecolare modelli meccanicamente le interazioni interspecifiche.

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