Un metodo ChIRP a base di UV per l'identificazione verificabile di proteine che interagiscono direttamente con lncRNA: dalle cellule coltivate al testicolo del topo

La nostra ricerca ha sviluppato cPDiRT, un metodo di cross-linking UV per mappare direttamente le interazioni tra RNA e proteine sia in cellule coltivate che in tessuti nativi, come i testicoli, delineando i meccanismi molecolari di TUG1 nella spermatogenesi. Questo protocollo consente la mappatura diretta delle interazioni tra RNA e proteine in un'ampia gamma di sistemi, dalle cellule in coltura ai tessuti nativi integri. Per iniziare, lavare le cellule GC2 tre volte con PBS per rimuovere il mezzo di coltura residuo.

Quindi, aggiungere tre millilitri di PBS nella piastra e distribuirli uniformemente prima della cross-linking. Irradiare le cellule in un cross-linker a ultravioletti a 254 nanometri con una dose di 4.000 millijoule per centimetro quadrato. Raccogliere le cellule in PBS e centrifugare la sospensione cellulare a 3000G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.

Dopo aver eliminato il soprannatante, pesare il pellet e verificare una massa minima del pellet di 500 milligrammi per campione. Raccogliere i testicoli da topi maschi C57BL6 di quattro settimane. Lavare il tessuto testicolare decapsulato due volte con 5-10 millilitri di DMEM.

Quindi, incubare 100 milligrammi di tessuto con 10 millilitri di DMEM contenente 1 milligrammo per millilitro di collagenasi IV a 37 gradi Celsius. Proseguire la digestione per 5-15 minuti fino al rilascio dei tubuli seminiferi. Successivamente, centrifugare la sospensione a 1000G per un minuto a quattro gradi Celsius ed eliminare il soprannatante.

Lavare il pellet con 5-10 millilitri di DMEM. Centrifugare nuovamente la sospensione a 1000×g per un minuto a 4 °C. Quindi risospendere il pellet in tripsina 0,25% contenente un milligrammo per millilitro di deossiribonucleasi I. Incubare la sospensione a 37 °C per 5-15 minuti.

Quindi, aggiungere un volume uguale di DMEM integrato con FBS al 10% per arrestare la digestione enzimatica. Filtrare la sospensione attraverso un filtro cellulare da 70 micrometri. Centrifugare le cellule a 2000G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.

Eliminare il soprannatante e lavare il pellet con 5-10 millilitri di PBS. Centrifugare nuovamente la sospensione a 2000G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Ri-sospendere la sospensione di singole cellule in PBS e distribuirla uniformemente in una piastra da coltura da 15 centimetri.

Incrociare le cellule testicolari come dimostrato in precedenza per le cellule GC2. Omettere l'irradiazione per le cellule di controllo. Raccogliere le cellule incrociate.

Centrifugare la sospensione a 3000G per cinque minuti a quattro gradi Celsius e scartare il soprannatante. Assicurarsi di ottenere una massa minima del pellet di 500 milligrammi raggruppando cellule testicolari isolate da almeno 10-12 topi. Dopo aver pesato il pellet, risospenderlo in buffer di lisi cellulare in un rapporto di 100 milligrammi di pellet per un millilitro di buffer.

Dopo aver agitato con vortex, sottoporre il campione a sonica utilizzando un ultrasonicatore focalizzato o un bagno a ultrasuoni fino a quando il lisato diventa visivamente chiaro. Successivamente, aliquotare circa 10 microlitri del lisato in provette per microcentrifuga per l'analisi di RNA e proteine. Aggiungere 30 microlitri di microsfere magnetiche prerisciacquate al lisato.

Incubare i campioni a 37 gradi Celsius per 30 minuti con un leggero mescolamento in un forno di ibridazione. Posizionare i campioni su un supporto magnetico per circa un minuto o fino a quando la soluzione diventa limpida. Trasferire il lisato chiarificato in una provetta pulita.

Posizionare il nuovo tubo sul supporto magnetico. Quindi, trasferire il lisato in un altro tubo per rimuovere eventuali perle residue. Aggiungere due volumi di buffer di ibridazione temperato a 37 gradi Celsius a ciascun campione.

Aggiungere sonde di DNA biotinilate in un rapporto di un microlitro di soluzione madre di sonda 100 micromolare per ogni millilitro di lisato. Incubare i campioni a 37 gradi Celsius con rotazione end-over-end per 12-16 ore in un forno di ibridazione. Immediatamente prima dell'uso, lavare 100 microlitri di microsferette magnetiche di streptavidina tre volte con tampone di lisi cellulare.

E rimuovere il tampone residuo dopo l'ultimo lavaggio. Centrifugare brevemente i tubi della reazione di ibridazione. Quindi, aggiungere il campione ibridato alle perle lavate e mescolare delicatamente.

Riportare la sospensione delle perle nel tubo originale e incubare a 37 gradi Celsius con mescolamento per 30-40 minuti. Dopo l'incubazione, centrifugare brevemente i campioni. Posizionare i tubi su un supporto magnetico per uno o due minuti, oppure fino a quando la soluzione diventa limpida.

Quindi, eliminare il soprannatante. Per lavare le perle, aggiungere un millilitro del buffer di lavaggio e incubare i tubi nel fornetto di ibridazione a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Dopo cinque lavaggi, trasferire dall'1 al 10% delle perle in un tubo nuovo per l'analisi dell'RNA.

Infine, aggiungere 40 microlitri di buffer campione 1X SDS alle perle rimanenti. Far bollire i campioni a 95 gradi Celsius per 30 minuti per eluire le proteine e invertire i legami incrociati. Recuperare le proteine per l'analisi successiva mediante spettrometria di massa.

L'analisi mediante spettrometria di massa ChIRP ha identificato oltre 190 proteine arricchite rispetto al controllo negativo nelle cellule GC2. Con una dose di UV di 4.000 millijoule per centimetro quadrato, la cPDiRT-MS ha identificato un insieme di proteine più selettivo. Oltre due terzi di queste proteine si sovrapponevano a quelle identificate mediante la ChIRP-MS convenzionale.

La maggior parte delle proteine identificate con almeno due peptidi unici è stata rilevata in modo riproducibile tra i replicati biologici sia nelle cellule GC2 che nei testicoli di topo. L'analisi della ontologia genica delle proteine identificate in modo riproducibile ha rivelato processi biologici ampiamente coerenti con le funzioni note di TUG1. Il confronto tra i set di dati delle cellule GC2 e dei testicoli di topo ha identificato 15 proteine comunemente arricchite.

La sequenza di immunoprecipitazione con cross-linking migliorato ha rivelato picchi di legame chiari e specifici sul trascritto TUG1 per PABPC1 e CCT3. cPDiRT consente ai ricercatori di identificare e misurare le proteine che interagiscono direttamente con un RNA specifico legato sia nelle cellule in coltura che nei tessuti nativi. La sfida più importante consiste nel raggiungere un efficiente cross-linking mediante UV garantendo al contempo un'elevata specificità per le interazioni dirette tra RNA e proteine.

Il nostro protocollo supporterà studi futuri volti ad applicare questo approccio ad altri RNA e ai tessuti, ripristinando l'azione diretta delle proteine legate all'RNA nello sviluppo e nella riproduzione.