Principi di Site-Specific ricombinasi (SSR) Tecnologia

Ciao, mi chiamo Frank Buchholz. Sono un responsabile di gruppo presso l'istituto Max PL di biologia cellulare e genetica molecolare. E il nostro lavoro viene mantenuto.

Il nostro lavoro comprende due aspetti. Uno riguarda lo screening dell'RNA I. L'altro riguarda lo sviluppo di ricombinasi specifiche per siti per l'ingegneria genomica avanzata.

Il mio background è quello di un biologo, un biologo molecolare, e ho studiato specializzandomi in biologia. Successivamente ho conseguito un dottorato di ricerca presso i Laboratori Europei di Biologia Molecolare di Heidelberg, e poi ho svolto un postdottorato a San Francisco presso l'UCSF con Mike Bishop, lavorando su modelli animali per la leucemia. L'Istituto Max Puncture qui a Dresda cerca di combinare, per così dire, almeno due aspetti diversi, ovvero biologi dello sviluppo e biologi cellulari, nell'ambito di un tentativo fondamentale che, secondo me, potrebbe essere descritto come il tema principale di base: cercare di comprendere come le cellule formano i tessuti.

Questo è sostanzialmente l'obiettivo generale dell'istituto qui a Ston. Lavoriamo quindi su due campi principali. Un campo riguarda lo svolgimento di schermate con RNAi, cercando di identificare nuove funzioni di geni precedentemente non caratterizzati nei processi biologici.

L'altro riguarda l'ingegneria genomica, con l'obiettivo di sviluppare tecnologie che consentano un'ingegnerizzazione sofisticata dei genomi mediante ricombinasi specifiche per sito. Sebbene le ricombinasi specifiche per sito siano state scoperte, direi, negli anni ottanta – ad esempio, la ricombinasi cre con cui lavoriamo è stata identificata all'inizio degli anni ottanta – si tratta in realtà di una proteina di fago batterico. Originariamente proviene quindi da un fago batterico, ossia da un virus che infetta i batteri.

Quindi è molto lontano da ciò che viene attualmente utilizzato, ma si è riconosciuto molto rapidamente che questi enzimi possono svolgere funzioni molto interessanti che possono essere impiegate anche in altri organismi. Le ricombinasi specifiche del sito sono proteine che si legano al DNA, legandosi specificamente a una certa sequenza di DNA, e quando si legano a queste sequenze bersaglio, sono in grado di tagliare il DNA e successivamente riorganizzare i siti, eseguendo fondamentalmente anche il processo di ligazione. In questo modo, è possibile riordinare le sequenze di DNA mediante ricombinazione specifica del sito, in modo analogo a delle forbici e della colla con cui si possono assemblare sequenze di DNA in un modo che prima non era possibile.

Questi ricombinasi specifiche del sito, come ho detto, sono state inizialmente scoperte nei batteri o nei fagi. Successivamente sono stati testati per verificare se funzionassero anche in altri organismi. E, cosa interessante, hanno svolto la loro funzione anche in altri organismi.

Pertanto, se si dispone di un sito bersaglio di ricombinasi specifico per sito in un organismo che è stato ingegnerizzato, ad esempio, queste enzimi svolgeranno la loro funzione. L'uso particolarmente diffuso di queste ricombinasi specifiche per sito, in particolare quelle che non richiedono cofattori, come la ricombinasi flip o la ricombinasi cre che abbiamo utilizzato come punto di partenza per il lavoro di cui stiamo parlando oggi, è dovuto al fatto che esse agiscono senza cofattori.

E se li esprimi, in un animale, ad esempio, o in cellule di un animale, allora possono individuare le sequenze che riconoscono in questo organismo e, fondamentalmente, tagliare e incollare proprio in quel punto, rimuovendo alcune sequenze. Quindi ciò che è stato fatto, o il contesto in cui questo enzima è stato utilizzato con grande successo, è la cosiddetta mutagenesi condizionale nei topi, ad esempio. Supponiamo quindi di avere un gene, che sappiamo essere un gene interessante, e di voler conoscere la funzione di questo gene.

Un esperimento molto importante consiste nel creare un cosiddetto topo knock-out. Per quanto riguarda quelli che hai recentemente visto, questa tecnologia ha effettivamente ottenuto il Premio Nobel proprio quest'anno, consentendo di eseguire essenzialmente una delezione genica in un topo. A volte, tuttavia, si scopre che quando si inattiva un gene in un animale, questo gene risulta essenziale e il topo muore molto precocemente durante l'embriogenesi.

Ora questo indica che il vostro gene è molto importante, ma non rivela effettivamente quale sia la sua funzione. Un approccio oggi molto diffuso per scoprirlo è effettuare un cosiddetto knockout condizionale. Ciò che si fa è delimitare il gene di interesse con siti bersaglio per queste ricombinasi specifiche di sito.

E ciò significa che in questi topi il gene verrà espresso come nei topi di tipo selvatico. Tuttavia, se si incrociano questi topi con un topo che esprime la ricombinasi CRE, ad esempio sotto un promotore specifico per tessuto, allora è possibile eliminare il gene di interesse soltanto in cellule specifiche, predefinibili in base al sito di espressione della ricombinasi. Da questi esperimenti sappiamo anche che queste ricombinazioni possono essere molto efficienti nell'eliminare sequenze da organismi interi.

E questo era un prerequisito per la nostra idea di cercare di sviluppare una ricombinasi che tagli in un sito da noi predefinito, il quale finora era stato uno dei principali limiti per lo sviluppo ulteriore del sito. Per le ricombinasi specifiche, era necessario ingegnerizzare il sito bersaglio di riconoscimento nel genoma di una cellula di un organismo che si desiderava utilizzare. Perciò ci siamo chiesti: possiamo superare questa barriera?

Fondamentalmente, si utilizza l'evoluzione molecolare. Attualmente, per quanto ne so, le ricombinasi sito-specifiche non vengono utilizzate per scopi terapeutici. Come ho detto, ciò è principalmente dovuto al fatto che nell'essere umano non esiste un sito bersaglio che possa essere riconosciuto da una qualsiasi delle ricombinasi disponibili in natura.

Pertanto, devono essere modificati in primo luogo, per poterli utilizzare in un contesto terapeutico. Al momento siamo soltanto all'inizio, e non è ancora certo che ciò possa effettivamente accadere. Il tempo dirà se saremo davvero in grado di sviluppare questi enzimi per un uso terapeutico, e il tempo dirà se ciò sarà possibile oppure no.