Name: Generazione di neuroni GABAergici da cellule staminali pluripotenti indotte dalluomo utilizzando lespressione di ASCL1/DLX2 indotta dalla doxiciclina ad AAVS1 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-07-31T12:55:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Scopri come generare neuroni GABAergici da cellule staminali pluripotenti indotte con un sistema inducibile dalla doxiciclina. Questo metodo CRISPR/Cas9 offre un modello affidabile per lo studio delle malattie neurologiche.

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	<li>Mertens J, Marchetto MC, Bardy C, Gage FH. Evaluating cell reprogramming, differentiation, and conversion technologies in neuroscience. Nat Rev Neurosci. 2016 Jul;17(7):424-37.</li>
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<table><tbody><tr><td>4D-Nucleofector&trade; Core Unit</td><td>Lonza</td><td>AAF-1002B</td><td>Per l'elettroporazione/nucleofezione di hiPSC.</td></tr><tr><td>6-well culture plates</td><td>Sarstedt</td><td>83.3920300</td><td>Piatti trattati per la cultura tissutale per il mantenimento e la differenziazione di hiPSC.</td></tr><tr><td>BDNF (Brain-Derived Neurotrophic Factor)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>78005</td><td>Proteina umana ricombinante per la maturazione neuronale; preparare secondo le istruzioni del produttore e utilizzare a una concentrazione finale di 10 ng/mL.</td></tr><tr><td>Cell counter (Countess)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10283</td><td>Usato per il conteggio delle cellule.</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>VWR</td><td>76468-134</td><td>Per il pelleting delle cellule.</td></tr><tr><td>CO2 incubator</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Heracell VIOS 160i o equivalente</td><td>Incubatore per colture cellulari che mantiene 37 &deg;C, atmosfera umidificata e 5% CO2.</td></tr><tr><td>Cryotubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5000-0020</td><td>Flaconi criogenici sterili per il congelamento di hiPSC; possono essere utilizzati vial criogenici esterni filettati da 1,8&ndash;2,0 mL equivalenti.</td></tr><tr><td>Cultrex UltiMatrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract</td><td>Bio-Techne</td><td>BME001-05</td><td>Matrice di rivestimento BME standard utilizzata nel protocollo. Verificare la concentrazione di stock specifica del lotto dal certificato di analisi Bio-Techne e diluire in DMEM/F-12 a una concentrazione di lavoro di 80 &micro;g/mL.</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Wisent</td><td>319-090-CL</td><td>Medium basale utilizzato per diluire BME.</td></tr><tr><td>DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>Crioprotettore utilizzato nella preparazione del medium di congelamento.</td></tr><tr><td>Donor plasmid: inducible ASCL1-P2A-DLX2 AAVS1 targeting cassette</td><td>Custom plasmid</td><td>Addgene accession pending</td><td>Plasmid donatore AAVS1 personalizzato contenente cassetta ASCL1-P2A-DLX2 inducibile con doxiciclina ed elementi di selezione/reporter. Fornire la mappa del plasmide e la sequenza completa come file supplementare o su richiesta.</td></tr><tr><td>Doxycycline hyclate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td><td>Usato per indurre l'espressione di ASCL1-P2A-DLX2. Preparare una soluzione di stock sterile, aliquotare, proteggere dalla luce, conservare congelato e utilizzare a una concentrazione finale di 1 &micro;g/mL.</td></tr><tr><td>Ethanol (70%)</td><td>Commercial Alcohols / Greenfield Global</td><td>P016EAAN</td><td>Per la sterilizzazione all'interno del gabinetto di sicurezza biologica; utilizzare etanolo al 70% approvato dall'istituto o equivalente.</td></tr><tr><td>Fluorescence microscope</td><td>ECHO</td><td>Revolve R4</td><td>Microscopio utilizzato per l'imaging a contrasto di fase e a fluorescenza dell'espressione del reporter e della morfologia neuronale.</td></tr><tr><td>GDNF (Glial-Derived Neurotrophic Factor)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>78058</td><td>Proteina umana ricombinante per la maturazione neuronale; preparare secondo le istruzioni del produttore e utilizzare a una concentrazione finale di 10 ng/mL.</td></tr><tr><td>hiPSC line PGP1</td><td>EditCo Bio</td><td>PGP1 human iPSC line</td><td>Linea hiPSC umana a consenso aperto disponibile in commercio utilizzata in questo protocollo; registrare il numero di passaggio e lo stato di QC prima della modifica e della differenziazione.</td></tr><tr><td>Image-analysis software</td><td>ImageJ/Fiji</td><td>Open-source; la versione utilizzata dovrebbe essere riportata</td><td>Per la quantificazione della fluorescenza e l'elaborazione di immagini rappresentative.</td></tr><tr><td>KnockOut&trade; Serum Replacement (KOSR)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10828028</td><td>Usato nella preparazione del medium di congelamento.</td></tr><tr><td>Laminin-521</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>200-0117</td><td>Reagente di risoluzione dei problemi opzionale. Non fa parte del protocollo di rivestimento standard; può essere utilizzato come alternativa o matrice di rivestimento doppio se persiste il distacco neuronale.</td></tr><tr><td>Liquid nitrogen dewar</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Locator 6 Plus o equivalente</td><td>Conservazione a lungo termine di hiPSC congelate in fase vapore o azoto liquido secondo le procedure di sicurezza criogenica istituzionali.</td></tr><tr><td>Mr. Frosty&trade; Freezing Container</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5100-0001</td><td>Per il congelamento a velocità controllata delle cellule a -80 &deg;C.</td></tr><tr><td>mTeSR&trade; Plus</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>100-0276</td><td>Medium di mantenimento privo di feeder per hiPSC.</td></tr><tr><td>Neuro-induction medium</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>08582</td><td>Medium di induzione neuronale commerciale utilizzato per l'induzione neuronale precoce.</td></tr><tr><td>Neuro-maturation base medium (BrainPhys&trade; Neuronal Medium)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>05790</td><td>Medium di base per la maturazione neuronale; supplementare con BDNF, GDNF, NT-3, doxiciclina e PluriSln-1 come descritto nel protocollo.</td></tr><tr><td>NT-3 (Neurotrophic Factor 3)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>78074</td><td>Proteina umana ricombinante per la maturazione neuronale; preparare secondo le istruzioni del produttore e utilizzare a una concentrazione finale di 10 ng/mL.</td></tr><tr><td>P3 Primary Cell 4D-Nucleofector&trade; X Kit</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3024</td><td>Kit contenente la soluzione P3 e le cuvette per la nucleofezione di hiPSC.</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>Antibiotico opzionale per ridurre il rischio di contaminazione batterica.</td></tr><tr><td>Plasmocin&trade; prophylactic</td><td>InvivoGen</td><td>ant-mpp</td><td>Antibiotico opzionale per prevenire la contaminazione da micoplasmi.</td></tr><tr><td>PluriSIn-1</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72822</td><td>Inibitore della sopravvivenza delle cellule pluripotenti per eliminare le hiPSC indifferenziate; preparare il stock secondo le istruzioni del produttore e utilizzare a una concentrazione finale di 20 &micro;M.</td></tr><tr><td>Puromycin Dihydrochloride</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1113803</td><td>Antibiotico utilizzato per la selezione; preparare una soluzione di stock sterile, aliquotare, conservare congelato e determinare la concentrazione finale di lavoro mediante curva di morte, tipicamente 0,4&ndash;0,6 &micro;g/mL.</td></tr><tr><td>pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 AAVS1 gRNA plasmid</td><td>Addgene</td><td>85802</td><td>Plasmid CRISPR/Cas9 utilizzato per il targeting di AAVS1; includere la sequenza gRNA di AAVS1 nella mappa del plasmide o nelle informazioni supplementari.</td></tr><tr><td>qPCR analysis software</td><td>Applied Biosystems / Thermo Fisher Scientific</td><td>QuantStudio Design &amp; Analysis Software o equivalente</td><td>Per l'estrazione di Ct e l'analisi RT-qPCR; riportare la versione del software utilizzata.</td></tr><tr><td>qPCR master mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PowerUp SYBR Green Master Mix, A25742</td><td>Per la quantificazione RT-qPCR dei marcatori neuronali e GABA

generazione di neuroni gabaergici da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo utilizzando l'espressione di ascl1/dlx2 indotta dalla doxiciclina ad aavs1

Generation of GABAergic Neurons from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Doxycycline-Inducible ASCL1/DLX2 Expression at AAVS1

Generazione di neuroni GABAergici da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo utilizzando l'espressione di ASCL1/DLX2 indotta dalla doxiciclina ad AAVS1

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) offer an unprecedented opportunity to model human neurological diseases in vitro. Reliable generation of ...

La nostra ricerca si concentra sulla generazione di una popolazione pura di neuroni GABAergici da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSCs) per modellare la diversità neuronale umana e le malattie. I protocolli esistenti richiedono trasduzioni virali ripetute per ogni differenziamento. Questo protocollo affronta tale limitazione utilizzando una linea cellulare AAVS1.Per iniziare, preparare il mezzo di congelamento mescolando 40 millilitri di sostituto del siero per knock-out o KOSR e 10 millilitri di DMSO in un tubo conico da 50 millilitri. Omogeneizzare il mezzo di congelamento aspirando e dispensando su e giù per 10 volte e conservare la soluzione a 4 gradi Celsius. Successivamente, diluire l'estratto della membrana basale o BME nel mezzo DMEM e F12 fino a una concentrazione finale di 80 microgrammi per millilitro. Aggiungere 1 millilitro del BME diluito in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti. Inclinare la piastra per distribuire la soluzione uniformemente su tutta la superficie dei pozzetti, assicurandosi che non vi siano aree non rivestite, e incubare la piastra per un minimo di 30 minuti a 37 gradi Celsius.Utilizzando una pipetta aspirante, aspirare il m

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Neuroscience

Neuroscienze

Il Stemgent inducibile Dox Mouse Set TF Lentivirus possibile riprogrammare i fibroblasti embrionali di topo (MEF) per pluripotenti indotte staminali (iPS), cellule. Qui mostriamo il protocollo per DOX-inducibile espressione di fattori di trascrizione del mouse riprogrammazione Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc di generare colonie iPS che esprimono i marcatori comune MES pluripotenza.

Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte da Riprogrammazione fibroblasti embrionali di topo con un fattore quattro trascrizione, Doxiciclina inducibile lentivirali sistema di trasduzione

Abbiamo stabilito un protocollo per l'induzione di neuroblasti pluripotenti direttamente da cellule staminali embrionali umane conservati in condizioni definite con piccole molecole, che permette la derivazione di una grande quantità di progenitori neuronali umane e tipi di cellule neuronali nel sistema nervoso centrale per lo sviluppo neurale riparazione.

Derivazione efficiente di progenitori neuronali umane e Neuroni pluripotenti da cellule staminali embrionali umane con induzione piccole molecole

Questo video dimostra il processo di differenziazione dei corpi embrioidi (EB) in aggregati neuroepiteliali e la loro successiva divisione in cellule neuronali e gliali. Questo metodo consente la generazione efficiente di cellule neuronali e gliali in vitro, che fungono da sistemi di test per i test di tossicità e per la valutazione delle diverse vie coinvolte nella neurotossicità.

Generazione di neuroni e cellule gliali da corpi embrioidi derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane

Questo video dimostra il processo di induzione delle cellule staminali pluripotenti umane a differenziarsi in neuroni trasfettandoli con lentivirus ingegnerizzati che trasportano un gene del fattore di trascrizione neurogenico sotto il controllo dell'elemento responsivo alla tetraciclina, seguito da un trattamento con un derivato della tetraciclina e un mezzo di maturazione.

Differenziazione delle cellule staminali pluripotenti umane nei neuroni utilizzando lentivirus ingegnerizzati

Questa procedura produce neuroni telencefalici passando attraverso i punti di controllo che sono simili a quelli osservati durante lo sviluppo umano. Le cellule possono differenziarsi spontaneamente, sono esposti a fattori che li spingono verso il lineage neurale, sono isolati, e vengono piastrate su vetrini per consentire la differenziazione terminale e maturazione.

La specifica di telencefalici neuroni glutamatergici di cellule staminali umane pluripotenti

Questa procedura mostra come indirizzare gli interneuroni nel prosencefalo del topo in via di sviluppo per mezzo dell'elettroporazione in utero. Questa tecnica è stata particolarmente efficace per ottenere l'espressione genica selettiva nei sottotipi di interneuroni destinati agli strati superficiali della corteccia.

Sottotipo-selettivo elettroporazione della corticale interneuroni

Noi, sulla base delle conoscenze della biologia dello sviluppo e della ricerca pubblicata, abbiamo sviluppato un protocollo ottimizzato per generare in modo efficiente neuroni dopaminergici del mesencefalo A9 sia da cellule staminali embrionali umane che da cellule staminali pluripotenti indotte umane, che sarebbero utili per la modellazione della malattia e la terapia di sostituzione cellulare per il morbo di Parkinson.

Regia neuroni dopaminergici differenziazione da cellule staminali pluripotenti umane

La modellazione dello sviluppo del cervello umano è stata ostacolata a causa della complessità senza precedenti del tessuto epiteliale neurale. Qui viene descritto un metodo per la generazione robusta di organoidi cerebrali per delineare gli eventi precoci dello sviluppo del cervello umano e per modellare la microcefalia in vitro.

Generazione di IPSC-derivati ​​cervello umano organoidi per creare un modello disturbi dello sviluppo neurologico precoce

Questo protocollo descrive un metodo per la generazione di corticale Interneurone progenitori e precursori post-mitotici Interneurone da cellule staminali embrionali di topo usando un metodo modificato embryoid corpo-a-monostrato. Questi progenitori/precursori possono essere usati in vitro o fluorescente ordinati e trapiantate nel neocortex neonatale per lo studio della determinazione di destino o usati in applicazioni terapeutiche.

Differenziazione delle cellule staminali embrionali di topo in precursori Interneurone corticale

Le interazioni neurone-glia nella neurodegenerazione non sono ben comprese a causa di strumenti e metodi inadeguati. Qui, descriviamo protocolli ottimizzati per ottenere neuroni indotti, cellule precursori degli oligodendrociti e oligodendrociti da cellule staminali pluripotenti umane e forniamo esempi dei valori di questi metodi nella comprensione dei contributi specifici del tipo di cellula nella malattia di Alzheimer.

Generazione di neuroni umani e oligodendrociti da cellule staminali pluripotenti per la modellazione delle interazioni neurone-oligodendrociti

Il trapianto di neuroni GABAergici derivati da cellule staminali pluripotenti umane generati dalla programmazione neuronale potrebbe essere un potenziale approccio terapeutico per i disturbi dello sviluppo neurologico. Questo protocollo descrive la generazione e il trapianto di precursori neuronali GABAergici derivati da cellule staminali umane nel cervello di topi neonatali, consentendo l'indagine a lungo termine dei neuroni innestati e la valutazione del loro potenziale terapeutico.

Trapianto di neuroni GABAergici derivati da cellule staminali umane nell'ippocampo di topo postnatale precoce per mitigare i disturbi dello sviluppo neurologico

Scopri come generare neuroni GABAergici da cellule staminali pluripotenti indotte con un sistema inducibile dalla doxiciclina. Questo metodo CRISPR/Cas9 offre un modello affidabile per lo studio delle malattie neurologiche.

Generazione di neuroni GABAergici da cellule staminali pluripotenti indotte dalluomo utilizzando lespressione di ASCL1/DLX2 indotta dalla doxiciclina ad AAVS1 (Video) | JoVE Journal

Generazione di neuroni GABAergici da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo utilizzando l'espressione di ASCL1/DLX2 indotta dalla doxiciclina ad AAVS1

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