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Questo lavoro è stato sostenuto dal National Natural Science Foundation of China (82273554), dal Progetto di sviluppo scientifico e tecnologico nel settore medico e sanitario della provincia di Shandong (n. 202304030716), dal Programma nazionale cinese di formazione per l'innovazione e l'imprenditorialità degli studenti universitari (n. 202410439001) e dal Progetto di sviluppo dell'innovazione scientifica e tecnologica di Tai’an (n. 2023NS232).

Lo studio è stato approvato dal comitato etico per la sperimentazione animale dell'Università Medica di Shandong &amp;#38; Accademia delle Scienze Mediche di Shandong (W202112030345). Tutti i metodi sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e le normative pertinenti.
1. Fabbricazione delle matrici 3BDO@MN
<ol>
	<li>Preparazione della formulazione CS/HA
	<ol>
		<li>Pesare 1 g di polvere di CS (grado di deacetilazione ≥ 95%) e aggiungerla a 20 mL di acqua distillata, quindi mescolare a temperatura ambiente (RT) per 10 min.</li>
		<li>Aggiungere ulteriormente 0,4 mL di soluzione di acido acetico al 2% (v/v) (peso molecolare 60,05) e continuare a mescolare per 2 h. 
		CAUTELA: L'acido acetico concentrato è corrosivo. Eseguire la diluizione e la manipolazione in una cappa aspirante, indossando guanti monouso e occhiali protettivi per evitare il contatto con la pelle e le membrane mucose.</li>
		<li>Procedere aggiungendo 2 g di polvere di HA, quindi centrifugare la formulazione mista a 1.207 × g (circa 3.000 giri/min) per 5 min per garantire una completa dissoluzione. 
		&#8203;NOTA: La formulazione CS/HA deve essere preparata fresca e può essere conservata in frigorifero a 4 °C per non più di 24 h.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparazione della formulazione CS/HA caricata con 3BDO
	<ol>
		<li>Aggiungere la soluzione di 3BDO predissolta (2 mg/mL) nel dimetilsulfossido (DMSO) 
		CAUTELA: Il DMSO è permeabile attraverso la pelle. Indossare guanti durante l'operazione per evitare il contatto diretto con la pelle e aggiungere la soluzione alla formulazione CS/HA. Mescolare per garantire una completa dissoluzione.</li>
		<li>Centrifugare la formulazione mista a 1.207 × g per 5 min per rimuovere eventuali bolle d'aria intrappolate. 
		&#8203;NOTA: Se dopo la centrifugazione persistono bolle, lasciare riposare la formulazione per 5 min, quindi centrifugare nuovamente.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Realizzazione delle matrici di microaghi 3BDO@MN
	<ol>
		<li>Utilizzare uno stampo in polidimetilsilossano (PDMS) per microaghi, dotato di un array 20 × 20 di punte coniche alte 600 µm, con diametro alla base di 250 µm e passo di 550 µm.</li>
		<li>Trattare la superficie dello stampo in PDMS mediante un pulitore al plasma per renderla completamente idrofila.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL della formulazione 3BDO@CS/HA nello stampo in PDMS. Posizionare lo stampo in una camera a vuoto ed applicare il vuoto per 10 min per facilitare l'infiltrazione della formulazione viscosa nelle microcavità.</li>
		<li>Centrifugare lo stampo a 134 × g per 5 min a temperatura ambiente (RT) per assicurare che la formulazione riempia tutte le cavità. Utilizzare una spatola metallica sterile per rimuovere con cura l'eccesso di formulazione dalla superficie dello stampo, lasciando un piano perfettamente piatto.</li>
		<li>Dispensare la miscela della matrice CS/HA senza 3BDO sulla superficie dello stampo. Centrifugare a 134 × g per 5 min a temperatura ambiente (RT) per formare uno strato di supporto uniforme.</li>
		<li>Posizionare lo stampo in un forno a 36 °C e 37% di umidità e farlo asciugare tutta la notte (circa 12–16 h).</li>
		<li>Staccare la matrice di microaghi completamente secca dallo stampo dopo che lo stampo si è raffreddato a temperatura ambiente (RT). 
		NOTA: Conservare le matrici di microaghi 3BDO@MN realizzate in frigorifero a 4 °C fino al momento dell'uso.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Caratterizzazione delle matrici 3BDO@MN
<ol>
	<li>Montare la patch di 3BDO@MN preparata su un stub utilizzando nastro conduttivo in carbonio bifacciale.
	<ol>
		<li>Effettuare la sputterizzazione del campione montato con uno strato sottile di oro (o platino) per migliorarne la conducibilità elettrica.</li>
		<li>Inserire lo stub del campione nella camera a vuoto di un microscopio elettronico a scansione a emissione di campo (FE-SEM).</li>
		<li>Regolare la tensione di accelerazione e la distanza di lavoro per ottenere immagini ad alta risoluzione. Osservare la morfologia complessiva dell'array e la topografia superficiale fine dei singoli MN.</li>
		<li>Acquisire microfotografie SEM rappresentative. Misurare la lunghezza dei MN e il diametro della punta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test della resistenza meccanica
	<ol>
		<li>Posizionare la patch di MN piatta sulla piattaforma del tester dello strumento di analisi della consistenza. Assicurarsi che il substrato sia perfettamente piano e che le punte degli aghi siano rivolte direttamente verso l'alto.</li>
		<li>Fissare saldamente una sonda cilindrica piana (25 mm di diametro) al trasduttore di carico dello strumento.</li>
		<li>Abbassare la sonda verticalmente fino a posizionarla appena sopra le punte dei MN. Evitare qualsiasi contatto fisico tra la sonda e le punte prima dell'inizio del test.</li>
		<li>Impostare i parametri specifici del test nel software: impostare la velocità di test verso il basso a 0,05 mm/s e la distanza di spostamento obiettivo a 0,7 mm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test di dissoluzione
	<ol>
		<li>Stendere la pelle dorsale di ratto sulla tavola da dissezione e asciugare delicatamente la superficie della pelle. Mantenere la pelle piatta e senza pieghe.</li>
		<li>Posizionare le patch di MN secche con le punte degli aghi rivolte verso il basso sulla superficie della pelle ed applicare una pressione verticale uniforme per garantire l'inserimento dei MN nella pelle.</li>
		<li>Rimuovere le patch dalla pelle a intervalli di tempo predeterminati (5, 10, 30 e 60 s) e lasciarle asciugare per 5 min.</li>
		<li>Osservare la morfologia residua mediante SEM nelle stesse condizioni di imaging.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Saggi di rilascio del farmaco in vitro
	<ol>
		<li>Aggiungere 500 µL di soluzione salina tamponata al fosfato (PBS) in ogni pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Posizionare i MN caricati con 3BDO in ciascun pozzetto in modo che entrino in contatto con il PBS.</li>
		<li>Incubare le piastre a temperatura ambiente (RT). A ciascun punto temporale, raccogliere 500 µL di PBS per la quantificazione della concentrazione di 3BDO.</li>
		<li>Ricaricare immediatamente ogni pozzetto con 500 µL di PBS fresco per mantenere condizioni di sink.</li>
		<li>Calcolare la percentuale cumulativa di 3BDO rilasciato in base al carico totale iniziale del farmaco nei MN.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Saggi antibatterici
	<ol>
		<li>Prelevare le colture batteriche (E. coli e Staphylococcus aureus) dal congelatore a -80 °C e aggiungere 10 µL di ciascuna coltura in 5 mL di terreno LB.</li>
		<li>Incubare il terreno inoculato in un agitatore-incubatore a 37 °C e 250 rpm per circa 16 h (durante la notte).</li>
		<li>Regolare la coltura batterica con terreno LB fino a un OD620 iniziale di 0,01.</li>
		<li>Diluire la soluzione madre di CS con acqua sterile per preparare soluzioni di CS a sei concentrazioni (1, 5, 10, 50, 100 e 500 mg/mL), con tre ripetizioni per ciascuna concentrazione.</li>
		<li>Dividere i campioni in tre gruppi: gruppo bianco, gruppo controllo e gruppo CS. Per il gruppo bianco, aggiungere 200 µL di LB. Per il gruppo controllo, aggiungere 180 µL di soluzione batterica e 20 µL di acqua sterile. Per il gruppo CS, aggiungere 180 µL di soluzione batterica e 20 µL della corrispondente concentrazione di soluzione di CS.</li>
		<li>Incubare a 37 °C per 20 h.</li>
		<li>Misurare e registrare l'OD620 di ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti mediante un lettore di absorbance a 0 h e a 20 h.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Valutazioni di citotossicità
	<ol>
		<li>Sezionare 100 µL di sospensione cellulare epidermica o dermica in una piastra a 96 pozzetti (2 × 103 cellule per pozzetto).</li>
		<li>Aggiungere 10 µL dei rispettivi trattamenti ai pozzetti designati per ottenere quattro gruppi: un gruppo controllo (mezzo di coltura), un gruppo 3BDO (concentrazione finale di 1 µM), un gruppo estratto di MN e un gruppo 3BDO+estratto di MN, con 3 ripetizioni per ciascun gruppo.</li>
		<li>Incubare a 37 °C, 5% CO₂ per 24 h.</li>
		<li>Aggiungere 10 µL di soluzione lavorativa del Cell Counting Kit-8 (CCK-8) in ciascun pozzetto. 
		NOTA: Evitare la formazione di bolle nei pozzetti, poiché potrebbero influenzare le letture di absorbance.</li>
		<li>Incubare a 37 °C, 5% CO₂ per 2 h.</li>
		<li>Leggere l'absorbance a 450 nm di tutti i pozzetti utilizzando un microlettore spettrofotometrico.</li>
		<li>Analizzare i dati e calcolare la percentuale di sopravvivenza cellulare.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Esperimenti sugli animali
<ol>
	<li>Preparazione e trattamento degli animali sperimentali
	<ol>
		<li>Anestetizzare topi maschi C57BL/6 di 7 settimane con isoflurano e mantenere la termoregolazione durante l'anestesia. 
		ATTENZIONE: L'isoflurano è un anestetico volatile. Utilizzare in un ambiente ben ventilato per evitare un'eccessiva inalazione.</li>
		<li>Applicare un lubrificante oftalmico agli occhi dei topi per proteggerli dall'essiccazione.</li>
		<li>Rasare i peli della regione dorsale dei topi utilizzando un rasoio elettrico, con un'area rasata di circa 2 &#215; 2 cm2.</li>
		<li>Applicare la crema depilatoria, attendere 5–10 s, quindi rimuoverla con un passaggio. Passare un tampone salino sulla pelle per eliminare eventuali residui di crema depilatoria e peli.</li>
		<li>Tagliare le patch di MN e metterle da parte.</li>
		<li>Dividere casualmente i topi rasati in cinque gruppi (n = 5 per gruppo) e trattare come segue:
		<ol>
			<li>Gruppo di controllo non trattato: rasare solo i peli senza alcun trattamento.</li>
			<li>Gruppo di patch MN di controllo: trattare la pelle rasata con patch MN senza 3BDO seguendo lo stesso schema del gruppo 3BDO@MN.</li>
			<li>Gruppo con cerotti 3BDO@MN: trattare la pelle rasata con cerotti 3BDO@MN al giorno 1, 3, 5, 7, 9, 11 e 13.</li>
			<li>Gruppo di iniezione sottocutanea di PBS: somministrare un'iniezione sottocutanea di soluzione PBS nell'area dorsale rasata dei topi ogni giorno.</li>
			<li>Gruppo di iniezione sottocutanea di 3BDO: somministrare un'iniezione sottocutanea di soluzione di 3BDO nell'area dorsale rasata dei topi ogni giorno.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Posizionare le matrici di 3BDO@MN sulla pelle rasata ed applicare una pressione verticale uniforme per assicurare l'inserzione dei MN nella pelle. Fissare le matrici di 3BDO@MN con una benda elastica e utilizzare una pinza dritta per mantenere la benda in posizione. 
		&#8203;NOTA: I diversi schemi di somministrazione sono stati scelti in base alle differenti caratteristiche di rilascio di ciascuna strategia: la matrice 3BDO@MN consente un rilascio localizzato e prolungato, mentre l'iniezione sottocutanea somministra il 3BDO come dose in bolo.</li>
		<li>Osservare i topi per tutta la durata dell'esperimento per assicurarsi che si riprendano completamente dall'anestesia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Raccolta dei campioni e valutazione della crescita del pelo
	<ol>
		<li>Fotografare quotidianamente la cute dorsale dei topi per documentare la crescita del pelo.</li>
		<li>Valutare la ricrescita dei capelli misurando il diametro del fusto pilifero, la copertura dei capelli e la densità dei capelli al giorno 15. Quantificare la percentuale di copertura dei capelli nell'area trattata utilizzando il software ImageJ.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interessi.

Attualmente, i trattamenti clinici per l'alopecia androgenetica (AGA) sono principalmente suddivisi in interventi farmacologici e trapianto chirurgico. In questo studio, i microneedle caricati con 3BDO hanno favorito la ricrescita dei capelli in un modello murino C57BL/6. Tuttavia, i metodi convenzionali di somministrazione dei farmaci presentano limitazioni, come una distribuzione non uniforme del farmaco. Il protocollo chiave di questo studio è un metodo in due fasi per la fabbricazione di microneedle caricati con 3BDO. L'acido ialuronico (HA) e la chitosana (CS) sono i componenti principali dei microneedle. Diversi passaggi critici richiedono attenzione per garantire la qualità dei microneedle.
Innanzitutto, per evitare l'intrappolamento di bolle d'aria nella soluzione polimerica, è stato utilizzato un stampo pre-raffreddato per rallentare l'evaporazione del solvente durante la centrifugazione. In secondo luogo, le condizioni di essiccazione influiscono direttamente sulla fragilità della punta e sull'integrità dello strato di supporto. L'essiccazione per 16 h a 36 &#176;C con umidità controllata ha contribuito a garantire punte con resistenza meccanica sufficiente mantenendo la flessibilità dello strato di supporto, evitando un'eccessiva essiccazione. Terzo, una velocità di 134 &#215; g per 5 min concentra efficacemente il 3BDO nella regione della punta, ma velocità più elevate o tempi più lunghi possono causare la precipitazione del farmaco alla base dello stampo, riducendo l'efficienza di somministrazione. Per il in vivo saggio, i topi C57BL/6 sono stati utilizzati come modello di ricrescita del pelo. I follicoli piliferi dei topi C57BL/6 mostrano un ciclo di crescita del pelo visibile e altamente sincronizzato, il che offre comodità sperimentale e li rende uno dei modelli più comuni per lo studio delle malattie della pelle16. All'età di circa 7 settimane, i follicoli piliferi dei topi C57BL/6 entrano naturalmente nella fase telogen. Dopo la depilazione artificiale dei topi, i follicoli piliferi rientrano immediatamente nella fase anagen17. Il in vivo Il saggio ha mostrato che il sistema MN ha promosso una ricrescita dei capelli più uniforme rispetto all'iniezione sottocutanea in questo modello.
Il sistema 3BDO@MN potrebbe rappresentare una strategia preclinica promettente per il trattamento della perdita dei capelli, integrando una piccola molecola rigenerativa per i capelli con una piattaforma di somministrazione transdermica minimamente invasiva. Formulazioni a base di microneedle a rilascio prolungato sono state descritte come in grado di consentire un rilascio controllato o sostenuto del farmaco, ridurre la frequenza di somministrazione e migliorare l'aderenza del paziente, affrontando alcune limitazioni associate ai trattamenti topici o sistemici convenzionali18,19. Inoltre, recenti strategie basate su microneedle per la rigenerazione dei capelli, tra cui il rilascio di cellule staminali, supportano ulteriormente l'applicabilità più ampia delle piattaforme a microneedle in questo campo20. Tuttavia, prima della traduzione clinica, sono ancora necessari ulteriori studi per valutare la biosicurezza a lungo termine, i profili farmacocinetici/farmacodinamici, l'ottimizzazione del dosaggio, la stabilità durante lo stoccaggio e la produzione su larga scala.

L'alopecia androgenetica (AGA) è uno dei disturbi alopecici clinici più comuni, caratterizzata principalmente da un assottigliamento progressivo e dalla perdita dei capelli del cuoio capelluto. La sua prevalenza nel corso della vita rimane costantemente elevata negli uomini, rendendola un problema sanitario critico che richiede una soluzione urgente1,2. Attualmente, i trattamenti clinici per l'AGA sono principalmente suddivisi in interventi farmacologici e trapianto chirurgico, entrambi caratterizzati da notevoli svantaggi. I farmaci terapeutici di prima linea, come la finasteride e la minoxidil, mostrano alcuni effetti terapeutici, ma sono associati a reazioni avverse definite, quali disfunzione sessuale, prurito del cuoio capelluto e secchezza del cuoio capelluto1,3. Sebbene il trapianto di capelli possa consentire la rigenerazione localizzata dei capelli, esso è limitato da costi elevati del trattamento, quantità insufficiente di capelli nelle aree donatrici e tassi di sopravvivenza innesto variabili, rendendo difficile la sua ampia diffusione nella pratica clinica1. Alla luce di questi limiti, si rende necessaria l'adozione di nuove strategie terapeutiche che uniscano efficacia, sicurezza e aderenza da parte del paziente.
3BDO è un attivatore della mTOR di piccole molecole che compete con la rapamicina4. È stato ampiamente utilizzato come inibitore dell'autofagia in diversi sistemi5,6,7. Ad esempio, un trattamento a lungo termine con 3BDO potrebbe migliorare la funzione mnemonica riducendo il numero di autofagosomi8. Inoltre, crescenti evidenze suggeriscono che il 3BDO possa agire indipendentemente come attivatore della mTOR. Ad esempio, il 3BDO ha ostacolato la morte delle cellule endoteliali e lo sviluppo dell'aterosclerosi nei topi, in modo indipendente dall'attività della mTOR9. Tuttavia, il suo potenziale ruolo nella crescita del follicolo pilifero non è stato ancora riportato. In particolare, nei nostri studi preliminari, si è osservato che il 3BDO promuove la ricrescita dei capelli. Tuttavia, i tradizionali metodi di somministrazione topica dei farmaci presentano evidenti limitazioni. Lo strato corneo della pelle limita l'efficienza transdermica, rendendo difficile il rilascio dei farmaci al sito bersaglio del follicolo pilifero nel derma. Sebbene i gel transdermici possano prolungare il tempo di permanenza del farmaco, potrebbero lasciare residui indesiderati. L'efficacia clinica di entrambe le strategie terapeutiche sopra menzionate rimane subottimale10,11.
Le micropunture (MNs) sono una tecnologia innovativa e indolore per la somministrazione di farmaci, il cui vantaggio principale risiede nella capacità di penetrare facilmente lo strato corneo e consegnare con precisione i farmaci al microambiente perifollicolare situato alla giunzione tra epidermide e derma. Inoltre, le MN presentano un utilizzo pratico, una minima invasività e un costo ragionevole12,13,14. Per superare l'ostacolo della somministrazione transdermica del 3BDO topico, è stata sviluppata una matrice di micropunture utilizzando acido ialuronico (HA) come matrice e chitosano (CS) come componente funzionale. L'inclusione del CS ha lo scopo di fornire un componente funzionale con potenziale attività antibatterica. Inoltre, l'applicazione di HA su pelle di topo alopecica potrebbe stimolare significativamente lo sviluppo dei follicoli piliferi15. Pertanto, questo protocollo descrive la fabbricazione e la caratterizzazione di un sistema di micropunture solubili caricate con 3BDO e la sua applicazione in un modello di rivascolarizzazione del pelo su topi C57BL/6 sottoposti a depilazione. Questo modello è utile per valutare le risposte di rivascolarizzazione del pelo dopo la depilazione, ma di per sé non stabilisce l'efficacia clinica per l'AGA.

<table><tbody><tr><td>3BDO</td><td>Yuanye Bio-Technology Co., Shanghai, Cina</td><td>890405-51-3</td><td>Preparazione della formulazione CS/HA caricata con 3BDO</td></tr><tr><td>Piastra a 6 pozzetti</td><td>Corning Incorporated, USA</td><td>REF 3516</td><td>Saggio antibatterico e saggio di rilascio del farmaco in vitro</td></tr><tr><td>Etilene al 75%</td><td>Shandong Lircon Medical Technology Co., Ltd.</td><td>1202050004</td><td>Disinfezione</td></tr><tr><td>Piastra a 96 pozzetti</td><td>Corning Incorporated, USA</td><td>REF3599</td><td>Valutazioni della citotossicità cellulare e saggio antibatterico</td></tr><tr><td>Topi C57BL/6</td><td>Charles River Laboratories</td><td>7 settimane</td><td>Esperimenti sugli animali</td></tr><tr><td>Cell Counting Kit-8 (CCK-8)</td><td>Dojindo, Giappone</td><td>CK04</td><td>Valutazioni della citotossicità</td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75007204</td><td>Centrifuga per formulazioni</td></tr><tr><td>Chitosano (CS)&amp;nbsp;</td><td>Shanghai Macklin Biochemical Co.,Ltd</td><td>9012-76-4</td><td>Preparazione della formulazione CS/HA</td></tr><tr><td>Crema depilatoria</td><td>Veet</td><td>3059944023307</td><td>Depilazione</td></tr><tr><td>Dietilsolfossido (DMSO)</td><td>Shanghai Macklin Biochemical Co.,Ltd</td><td>67-68-5</td><td>Preparazione della formulazione CS/HA caricata con 3BDO</td></tr><tr><td>Bilancia elettronica</td><td>Radwag</td><td>AS 220.R2</td><td>Pesatura delle polveri</td></tr><tr><td>Escherichia coli (E. coli)</td><td>ATCC</td><td>/</td><td>Saggio antibatterico</td></tr><tr><td>Acido ialuronico (HA) in polvere</td><td>Bloomage Biotechnology Co. Cina</td><td>9067-32-7</td><td>Preparazione della formulazione CS/HA</td></tr><tr><td>Software ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td>/</td><td>Analisi statistica</td></tr><tr><td>Agitatore-incubatore</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>50163013</td><td>Incubazione batterica</td></tr><tr><td>Vaporizzatore di isoflurano</td><td>Gene&amp;amp;I</td><td>AMS</td><td>Anestesia animale</td></tr><tr><td>Mezzo LB</td><td>Sigma Life Science</td><td>L3022</td><td>Saggio antibatterico</td></tr><tr><td>Agitatore magnetico</td><td>Hangzhou MiuLab Instrument Co., Ltd.</td><td>SP-16</td><td>Agitazione della formulazione</td></tr><tr><td>Spettrofotometro microplacca Multiskan SkyHigh</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>/</td><td>Misurazione dell'OD</td></tr><tr><td>Forno</td><td>Shanghai Huitai Instrument Manufacturing Co.,Ltd</td><td>DHG-9260A</td><td>Essiccazione dei microneedle</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Amcor&amp;nbsp;</td><td>PM-996</td><td>Sigillatura dei microneedle</td></tr><tr><td>Soluzione tampone fosfato (PBS)</td><td>Biosharp</td><td>BL302A</td><td>Saggio di rilascio del farmaco in vitro</td></tr><tr><td>Staphylococcus aureus (S. aureus)</td><td>ATCC</td><td>/</td><td>Saggio antibatterico</td></tr><tr><td>Analizzatore universale di texture TA</td><td>Shanghai Tengba Instrument Technology Co., Ltd</td><td>/</td><td>Test di resistenza meccanica</td></tr><tr><td>Camera a vuoto</td><td>Shanghai Huitai Instrument Manufacturing Co.,Ltd</td><td>DZF-6050</td><td>Essiccazione sotto vuoto</td></tr></tbody></table>

fabbricazione e caratterizzazione di cerotti a microaghi dissolvibili caricati con 3bdo per la ricrescita dei capelli in topi c57bl/6

Fabrication and Characterization of 3BDO-Loaded Dissolvable Microneedle Patches for Hair Regrowth in C57BL/6 Mice

I trattamenti convenzionali per l'alopecia androgenetica (AGA) presentano limitazioni, che spingono alla ricerca di approcci alternativi di somministrazione. Questo protocollo descrive la fabbricazione, la caratterizzazione e l'applicazione di patch di microlancette solubili cariche di 3BDO, a base di acido ialuronico/citosano (HA/CS), in un modello murino C57BL/6 di rivascolarizzazione del pelo. Il metodo utilizza un processo di stampaggio in due fasi in uno stampo di polidimetilsilossano (PDMS) per concentrare il 3BDO nelle punte delle microlancette, formando contemporaneamente uno strato di supporto di HA/CS privo di farmaco. La patch viene caratterizzata mediante imaging al microscopio elettronico a scansione (SEM), test meccanici, test di inserzione e dissoluzione cutanea, test di rilascio in vitro, saggi antibatterici, test di citotossicità e valutazione in vivo della rivascolarizzazione del pelo. Dopo l'inserzione, le punte delle microlancette si dissolvono, rilasciando localmente il 3BDO. La valutazione in vivo ha mostrato che il gruppo trattato con microlancette cariche di 3BDO ha presentato una rivascolarizzazione del pelo più uniforme rispetto ai gruppi trattati con iniezione sottocutanea e al gruppo di controllo. Questo protocollo consente anche la valutazione della morfologia della patch, delle prestazioni di inserzione e della biocompatibilità locale. Questo metodo fornisce un flusso di lavoro preclinico per valutare la somministrazione mediata da microlancette del 3BDO per applicazioni di rivascolarizzazione del pelo.

Questo protocollo descrive la fabbricazione e la caratterizzazione della patch 3BDO@MN. Figura 1 mostra lo schema del processo di fabbricazione della patch 3BDO@MN. Il 3BDO è stato mescolato nella formulazione CS/HA e la miscela della matrice è stata quindi aggiunta nello stampo in PDMS per microneedle e centrifugata per riempire le punte degli aghi. La miscela della matrice CS/HA senza 3BDO è stata aggiunta sulla superficie dello stampo e centrifugata per riempire lo strato di supporto. Dopo un'essiccazione completa, le patch sono state staccate per ottenere le patch 3BDO@MN. La morfologia dei microneedle è stata analizzata mediante microscopia elettronica a scansione (SEM), come mostrato in Figura 2A.
Le MN coniche sono state formate uniformemente in un array 20 × 20 su una toppa di 15 × 15 mm, ciascuna con una larghezza alla base di 250 µm e un'altezza di 600 µm. Le punte delle MN hanno resistito a una forza di 1,2 N, sufficiente per la penetrazione cutanea, come dimostrato da chiari fori di inserzione osservati mediante colorazione con ematossilina ed eosina (H&amp;E) (Figura 2B,C). La pelle dorsale di topo è stata quindi utilizzata per testare l'applicazione delle toppe 3BDO@MN. Le toppe sono state premute sulla pelle del topo per misurare il tempo di dissoluzione, e le punte delle MN si sono completamente disciolte entro 60 s (Figura 2D). Nel saggio in vitro, il profilo di rilascio del 3BDO dalle MN ha mostrato che circa il 90% del farmaco è stato rilasciato (Figura 2E). L'estratto delle MN non ha mostrato citotossicità su cellule epidermiche e dermiche, mentre 1 µM di 3BDO ha significativamente promosso la crescita cellulare (Figura 2F). La formulazione contenente chitosano ha mostrato un'attività antibatterica dipendente dalla concentrazione contro entrambi E. coli e S. aureus, con un effetto più pronunciato a concentrazioni superiori a 10 mg/mL (Figura 2G,H). Questi risultati supportano l'utilizzo del chitosano come componente funzionale della formulazione delle MN, sebbene ulteriori test sulle toppe fabbricate sarebbero necessari per confermare le prestazioni antibatteriche nelle condizioni di applicazione.
I risultati sperimentali sugli animali hanno dimostrato che il gruppo 3BDO@MN ha mostrato una pigmentazione cutanea significativa al giorno 5. Al giorno 15, il gruppo che ha ricevuto iniezioni di 3BDO presentava una ricrescita dei capelli pari a circa il 45%, rispetto a circa il 39% nel gruppo controllo, mentre il gruppo 3BDO@MN ha raggiunto circa il 90% di copertura (Figura 3). La ricrescita dei capelli nel gruppo 3BDO@MN è risultata più uniforme e densa, indicando una migliore penetrazione e ritenzione del farmaco rispetto all'iniezione diretta.
Nel complesso, questi risultati indicano che la somministrazione mediata da MN di 3BDO ha favorito la ricrescita dei capelli nel modello di topo C57BL/6 depilato utilizzato in questo studio. Sono necessari ulteriori studi per determinare se questo approccio sia efficace in modelli specifici di alopecia androgenetica e in condizioni di dosaggio clinicamente rilevanti.
<img alt="Diagramma del processo di biostampa 3D: rivestimento 3BDOQCS/HA, centrifuga, essiccazione a vuoto, matrice CS/HA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71814/71814fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figura 1"> 
Figura 1. Illustrazione schematica del processo di fabbricazione delle 3BDO@MNs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71814/71814fig1large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Diagrammi di array di microneedle e grafici di vitalità cellulare; studio sulle proprietà antibatteriche del lattato di chitosano." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71814/71814fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2. Sintesi e caratterizzazione del sistema 3BDO@MN. (A) Immagine al microscopio elettronico a scansione (SEM) che mostra la morfologia dei 3BDO@MN. Barra della scala = 500 µm. (B) Curva forza-spostamento dei 3BDO@MN. (C) Sezione trasversale di pelle di topo colorata con ematossilina-eosina (H&amp;E) dopo l'inserimento dei 3BDO@MN e la rimozione della base, che conferma la penetrazione riuscita nel tessuto. Barra della scala = 100 µm. (D) Immagini SEM che mostrano la dissoluzione dei MN a 5 s, 10 s, 30 s e 60 s dall'inserimento nella pelle. (E) Profilo cumulativo di rilascio in vitro del 3BDO dai MN. (F) Vitalità cellulare di cellule epidermiche e cellule dermiche trattate con 3BDO, estratto di MN ed estratto di MN contenente 3BDO a 24 h. (G,H) Assorbanza a 620 nm di sospensioni di (G) Staphylococcus aureus e (H) Escherichia coli coltivate in mezzo contenente chitosano a diverse concentrazioni. I dati sono espressi come media ± DS (n = 3); la significatività statistica è stata analizzata mediante ANOVA a un fattore (**p &lt; 0,01). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71814/71814fig2large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Esperimento sulla crescita dei capelli con patch di microlancette (MN); risultati relativi alla pigmentazione e alla copertura dei capelli nei topi." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71814/71814fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3. Effetti di ripresa della crescita dei capelli indotti da 3BDO@MNs in vivo. (A) Rappresentazione schematica degli esperimenti sugli animali. (B) Immagini rappresentative della pelle dorsale del topo al giorno 0 (rasatura), giorno 5, giorno 10 e giorno 15 dopo il trattamento. (C) Analisi quantitativa dei punteggi di pigmentazione (unità arbitrarie) mostrati in (B). (D) Analisi quantitativa dell'area di copertura dei capelli (%) nella regione trattata mostrata in (B). (E) Variazione relativa in termini di fold change dell'area di copertura dei capelli nella regione trattata rispetto al gruppo di controllo. I dati sono espressi come media ± DS (n = 5) e la significatività statistica è stata analizzata mediante ANOVA a un fattore (**p &lt; 0,01). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71814/71814fig3large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>

Questo protocollo descrive la fabbricazione, la caratterizzazione e l'applicazione di cerotti a microneedle caricati con 3BDO e solubili per la somministrazione transdermica di farmaci in un modello murino di ricrescita del pelo.

Fabbricazione e caratterizzazione di cerotti a microaghi dissolvibili caricati con 3BDO per la ricrescita dei capelli in topi C57BL/6

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