Name: Imaging a cellule vive e tracciamento a singola cellula per monitorare la dinamica clonale e le transizioni del destino negli organoidi intestinali umani e murini (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-07-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: Scopri l'imaging a cellule vive e il tracciamento a singola cellula per studiare la dinamica clonale e le transizioni del destino cellulare negli organoidi intestinali umani e murini. Questo metodo consente l'osservazione in tempo reale delle decisioni del destino cellulare.

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</ol>

<table><tbody><tr><td>A83-01</td><td>Tocris&nbsp;</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>Accutase Cell Detachment Solution</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT104-500</td><td></td></tr><tr><td>Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12 (Advanced DMEM/F12)</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp;12634-010</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-bl-05</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer (40um)&nbsp;</td><td>Greiner Bio-one</td><td>542140</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Stemgent</td><td>04-0004-base</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Leica</td><td>SP8</td><td>con controllo del clima per temperatura e CO2</td></tr><tr><td>Cultrex Basement Membrane Extract (BME)</td><td>R&amp;D Systems, Bio-Techne</td><td>3533-001-02</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>open source</td><td></td><td>open source https://imagej.net/software/fiji/</td></tr><tr><td>Glass bottom plates</td><td>CellVis</td><td>P24-1.5H-N</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>N2 supplement&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylcysteine</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>NEPA electroporation system</td><td>NEPAGENE</td><td>NEPA21</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>NucSpot Live</td><td></td><td></td><td>far-red live-cell nuclear dye</td></tr><tr><td>Noggin conditioned medium (U-Protein Express)</td><td>IPA Therapeutics</td><td>N002</td><td></td></tr><tr><td>OrganoidTracker</td><td>open source</td><td></td><td>open source https://organoidtracker.org/</td></tr><tr><td>p2T-CAG-mT2TP</td><td>homemade</td><td></td><td>protocol to generate the plasmid DOI: 10.1126/science.adr8753</td></tr><tr><td>p2T-H2B-iRFP-IRES-PuroR</td><td>homemade</td><td></td><td>protocol to generate the plasmid DOI: 10.1126/science.adr8753</td></tr><tr><td>p2T-H2B-mCherry-IRES-BlastR&nbsp;</td><td>homemade</td><td></td><td>protocol to generate the plasmid DOI: 10.1126/science.adr8753</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>11548876</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-05</td><td></td></tr><tr><td>Prostaglandin E2</td><td>Tocris&nbsp;</td><td>2296</td><td></td></tr><tr><td>puromycin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pr</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human IL-22</td><td>Peprotech</td><td>200-22</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human R-spondin 1</td><td>Thermo Fisher</td><td>120-38-5UG</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant murine EGF</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>315-09-500UG</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant murine Noggin</td><td>Thermo Fisher</td><td>250-38-100UG</td><td></td></tr><tr><td>R-spondin conditioned medium (U-Protein Express)</td><td>IPA Therapeutics</td><td>R001</td><td></td></tr><tr><td>SiR-DNA</td><td></td><td></td><td>far-red live-cell DNA dye</td></tr><tr><td>SB202190 (p38 inhibitor)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>S7076</td><td></td></tr><tr><td>Suspension plate for organoid culture</td><td>Greiner</td><td>665102</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>Wnt surrogate</td><td>U-Protein Express</td><td>&nbsp;custom order</td><td></td></tr><tr><td>Wnt3A conditioned medium</td><td>homemade</td><td></td><td>La produzione di Wnt3A conditioned medium può essere trovata qui:&nbsp; https://doi.org/10.1002/cpim.106</td></tr><tr><td>Y-27632 dihydrochloride</td><td>Abmole Bioscience</td><td>M1817</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging a cellule vive e tracciamento a singola cellula per monitorare la dinamica clonale e le transizioni del destino negli organoidi intestinali umani e murini

Live-Cell Imaging and Single-Cell Tracking to Monitor Clonal Dynamics and Fate Transitions in Human and Murine Intestinal Organoids

Imaging a cellule vive e tracciamento a singola cellula per monitorare la dinamica clonale e le transizioni del destino negli organoidi intestinali umani e murini

The intestinal epithelium undergoes rapid self-renewal through stem cell division, cell differentiation, and migration. Understanding how individual cells ...

La nostra ricerca si concentra sullo studio di come le singole cellule prendano decisioni riguardo al loro destino e coordinino i loro comportamenti all'interno dell'epitelio intestinale autorinnovantesi. La microscopia ottica non riesce a risolvere un marcatore ubiquo, ad esempio il compartimento della membrana di una cellula o il citoscheletro, e ad attribuirlo effettivamente a una cellula piuttosto che ai suoi vicini. Tuttavia, gli organoidi a mosaico possono effettivamente aiutare a superare tale limitazione.Per iniziare, procurarsi i reagenti necessari e le linee cellulari di organoidi intestinali fluorescenti murini e umani validate. Passaggiare entrambe le linee di organoidi in un mezzo condizionato con Wnt tre giorni prima della generazione degli organoidi mosaic per favorire l'espansione delle cellule staminali e massimizzare la vitalità cellulare durante la dissociazione. Preparare il BME al 5% in DMEM. Rivestire ogni pozzetto di una piastra a 48 pozzetti con 20 microlitri di BME preparato per fornire uno strato adesivo sottile per l'attacco cellulare, quindi incubare a 37 gradi Celsius per un'ora. Successivamente, sciogliere il BME aggiungendo del mezzo basale freddo. Raccogliere gli organoidi da ciascuna linea separatamente mediante centrifugazione a 300 g per cinque minuti a 4 gradi Celsius. Dissociare gli organoidi in singole cellule incubandoli in una soluzione enzimatica per il distacco cellulare per 5-7 minuti in un bagnomaria a 37 gradi Celsius. Utilizzando una pipetta P1000, pipettare ripetutamente la sospensione per favorire la dissociazione meccanica. Monitorare la dissociazione al microscopio a campo chiaro. Arrestare la reazione aggiungendo un eccesso di mezzo basale freddo quando si osservano prevalentemente singole cellule o piccoli frammenti di organoidi composti da 2 a 10 cellule. Successivamente, pellettare le cellule mediante centrifugazione a 300 g per cinque minuti a 4 gradi Celsius. Valutare la vitalità cellulare e contare le cellule vitali utilizzando l'esclusione del blu di tripano. Combinare le due popolazioni cellulari nel rapporto desiderato per ottenere un totale di 300.000 cellule in 500 microlitri di mezzo condizionato con Wnt, integrato con 10 micromolare di cloridrato di Y-27632 per organoidi mosaic murini o con mezzo di espansione umano per colture di organoidi mosaic umani. Mescolare accuratamente mediante pipettaggio delicato. Quindi, rimuovere il mezzo di rivestimento dalle piastre a 48 pozzetti e seminare la sospensione cellulare nei pozzetti rivestiti. Centrifugare la piastra a 200 g per cinque minuti a temperatura ambiente e incubare a 37 gradi Celsius. Preparare una punta per pipetta P200 piegandola. Dopo 24 ore, staccare meccanicamente lo strato cellulare raschiando con la punta della pipetta piegata, quindi lavare accuratamente con mezzo basale freddo. Raccogliere gli aggregati staccati mediante centrifugazione a 300 g per tre minuti a 4 gradi Celsius, senza ulteriore sollecitazione meccanica. Risospendere gli aggregati in BME e seminare in contenitori campione compatibili con l'analisi microscopica. Coltivare gli aggregati seminati in mezzo ENR per organoidi murini e in mezzo di espansione umano per organoidi mosaic umani.Utilizzare camere di imaging con fondo in vetro per garantire la compatibilità ottica con obiettivi confocali ad alta apertura numerica. Piastrare la sospensione di organoidi in BME come una cupola sottile vicino al centro del fondo in vetro. Incubare la piastra a 4 gradi Celsius per 5-10 minuti per permettere agli organoidi di affondare verso il fondo in vetro per gravità. Trasferire la piastra a 37 gradi Celsius e lasciare solidificare la BME per 20-30 minuti. Aggiungere 500 microlitri di mezzo di crescita preriscaldato in ogni pozzetto. Lasciare che gli organoidi si riprendano e stabiliscano la loro morfologia per almeno 24 ore prima di iniziare l'imaging in tempo reale. Acquisire immagini a lungo termine in time-lapse ed eseguire il tracciamento singola-cellula e la ricostruzione della linea cellulare per l'analisi successiva.La formazione di un mosaico riuscita è stata caratterizzata da una distribuzione tipo "sale e pepe" o da confini definiti tra le due popolazioni, a seconda del grado di dissociazione utilizzato. Una dissociazione completa a singola cellula ha prodotto mosaicismo di tipo "sale e pepe", mentre una frammentazione delicata ha preservato piccoli aggregati clonali. Quando una singola cellula, che coesprime un reporter di interesse, è circondata da cellule non marcate, le dinamiche del suo citoscheletro durante migrazione, divisione o espulsione possono essere attribuite in modo univoco a quella cellula. I reporter nucleari di H2B hanno facilitato l'identificazione di configurazioni cellulari informative all'interno del mosaico e da dati di tracciamento sono state estratte misurazioni per cellula, come il tasso di divisione nel corso della vita e le dinamiche dell'intensità del reporter. Le cellule caliciformi hanno attivato e mantenuto un'espressione elevata di MUC2-mNeonGreen per tutto il periodo di acquisizione delle immagini, mentre le cellule di Paneth hanno mostrato un'iniziale attivazione di MUC2-mNeonGreen seguita da una progressiva riduzione del segnale e successiva attivazione di DEFA5-dsRed. La quantificazione a livello di singola cellula ha confermato questa transizione sequenziale a livello cellulare individuale. Curve medie di intensità ottenute da più cellule tracciate hanno confermato che questo schema era coerente a livello di popolazione, con i precursori delle cellule di Paneth che mostravano una relazione inversa caratteristica tra i segnali di MUC2-mNeonGreen e DEFA5-dsRed.Questo protocollo consente ai ricercatori di studiare come una singola cellula rimodella il proprio citoscheletro, ad esempio durante la divisione, la migrazione o, per esempio, l'estruzione in un tessuto integro. L'aspetto fondamentale è la scelta del rapporto di marcatura, poiché cellule reporter sparse isolano i segnali a livello singolo, mentre cellule non marcate sparse rivelano le risposte del microambiente. Studi futuri potranno combinare reporter del destino cellulare con marcatura mosaicale in un singolo organoide per collegare gli impegni di destino alle dinamiche del citoscheletro a livello di singola cellula.

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Monitoraggio Dinamica di attecchimento muscolare nei piccoli animali da In Vivo Fluorescente Imaging

Un metodo è descritto photoactivate singole cellule contenenti una proteina fluorescente in gabbia con assorbimento a due fotoni da un Ti: zaffiro oscillatore laser a femtosecondi. Per mappare il destino della cellula fotoattivati, immunoistochimica è usato. Questa tecnica può essere applicata a qualsiasi tipo di cellula.

Singolo Destino Mapping di celle in Zebrafish

In questo protocollo video diamo una spiegazione passo dopo passo della trasduzione lentivirale negli organoidi dell'epitelio intestinale primario e del processamento e dell'analisi a valle di queste colture mediante RT-PCR quantitativo, RNA-microarray e immunoistochimica.

Un protocollo per lentivirali trasduzione e analisi valle di intestinale organoidi

Protocolli per la coltura di cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC), la trasfezione transitoria di marcatori marcati in fluorescenza della crescita dei microtubuli, l'imaging di cellule vive e l'analisi automatizzata delle dinamiche di crescita dei microtubuli interfasici.

Ad alta risoluzione Time-lapse imaging e analisi automatizzata dei microtubuli Dynamics in Living ombelicale umano cellule endoteliali Vena

Qui, presentiamo l'imaging a cellule vive che è un metodo di microscopia non tossico che consente ai ricercatori di studiare il comportamento delle proteine e la dinamica nucleare nelle cellule di lievito di fissione viventi durante la mitosi e la meiosi.

Esame della dinamica nucleare del lievito di fissione mitotico e meiotico da fluorescenza microscopia a celle vive

Qui presentiamo un protocollo per valutare la dinamica della formazione del mandrino e della progressione mitotica. La nostra applicazione di imaging time-lapse consente all'utente di identificare le cellule in varie fasi della mitosi, monitorare e identificare i difetti mitotici e analizzare la dinamica del mandrino e il destino delle cellule mitotiche dopo l'esposizione a farmaci anti-mitotici.

Live Cell Imaging per valutare la dinamica della temporizzazione metafase e del destino delle cellule a seguito di perturbazioni mitotiche del mandrino

L'intera struttura 3D e il contenuto cellulare degli organoidi, così come la loro somiglianza fenotipica con il tessuto originale possono essere catturati utilizzando il protocollo di imaging 3D a risoluzione singola descritto qui. Questo protocollo può essere applicato a una vasta gamma di organoidi che variano in origine, dimensione e forma.

Risoluzione a una cellula di immagini tridimensionali di organoidi intatti

Presentato qui un protocollo per un approccio di imaging a fluorescenza, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA, and protein (MICDDRP), un metodo in grado di visualizzare simultaneamente fluorescenza singola cellula di proteine virali e acidi nucleici di diverso tipo e filamento. Questo approccio può essere applicato a una vasta gamma di sistemi.

Imaging a fluorescenza multiplexata a singola cellula per visualizzare acidi nucleici e proteine virali e monitorare HIV, HTLV, HBV, HCV, virus Zika e infezione influenzale

Presentiamo un metodo per l'acquisizione di corsi di tempo reporter a fluorescenza da singole cellule utilizzando array micropatterned. Il protocollo descrive la preparazione di array a cella singola, la configurazione e il funzionamento della microscopia time-lapse di scansione a celle vive e uno strumento di analisi delle immagini open source per la preselezione automatizzata, il controllo visivo e il tracciamento dei corsi di tempo di fluorescenza integrati nelle celle per sito di adesione.

Imaging a cellule vive di array a cella singola (LISCA) - una tecnica versatile per quantificare la cinetica cellulare

Il presente protocollo descrive un metodo per rilevare le specie reattive dell'ossigeno (ROS) negli organoidi murini intestinali utilizzando l'imaging qualitativo e i saggi quantitativi di citometria. Questo lavoro può essere potenzialmente esteso ad altre sonde fluorescenti per testare l'effetto di composti selezionati sui ROS.

Analisi dello stress ossidativo negli organoidi intestinali murini utilizzando la sonda fluorogenica sensibile alle specie reattive dell'ossigeno

Scopri l'imaging a cellule vive e il tracciamento a singola cellula per studiare la dinamica clonale e le transizioni del destino cellulare negli organoidi intestinali umani e murini. Questo metodo consente l'osservazione in tempo reale delle decisioni del destino cellulare.

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