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<ol>
	<li>Alberti S. Phase separation in biology. Curr Biol. 2017;27(20):R1097-102.</li>
	<li>Rabouille C, Alberti S. Cell adaptation upon stress: the emerging role of membrane-less compartments. Curr Opin Cell Biol. 2017;47:34-42.</li>
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	<li>Novakovic M, Schmoll J, Emmanouilidis L, Allain FHT. Using solution NMR to characterize biomolecular condensates under biphasic conditions. J Vis Exp. 2026;(230):e70530.</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>1.5 mL tubes</td><td>qualsiasi marca va bene</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>18-well chamber slides</td><td>ibidi</td><td>81816</td><td>per STORM</td></tr><tr><td>agarose, low gelling temperature</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td>grado per biologia molecolare</td></tr><tr><td>agarose, ultra pura&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>channel slides</td><td>ibidi</td><td>80606</td><td>per microscopia</td></tr><tr><td>microscopio confocale</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Cy5-dye, NHS chemistry</td><td>Jena Biosciences</td><td>FP-201-CY5</td><td>per l'etichettatura delle proteine</td></tr><tr><td>D2O (ossido di deuterio)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>151882</td><td></td></tr><tr><td>easyFRAP</td><td>Koulouras et al. 2018</td><td>N/A</td><td>https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29901776/</td></tr><tr><td>Everspark 2.0 dSTORM buffer</td><td>idylle</td><td>KMO|ETE+</td><td></td></tr><tr><td>FUS NTD protein</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>espresso ricombinantemente nel nostro laboratorio, come descritto nel riferimento 13 (Emmanouilidis et al. Nat Chem Biol 2021)</td></tr><tr><td>blocco di riscaldamento o bagno d'acqua</td><td>qualsiasi marca va bene</td><td>N/A</td><td>qualsiasi marca o modello va bene</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>software di analisi delle immagini</td><td>Fiji</td><td>N/A</td><td>https://fiji.sc/</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>spettrometro NMR</td><td>Bruker</td><td>N/A</td><td>750 MHz, sonda a temperatura ambiente PATXI, vedere il riferimento 13 per maggiori dettagli (Emmanouilodis et al. Nat Chem Biol 2021)</td></tr><tr><td>tubo NMR</td><td>Bruker</td><td>N/A</td><td>3 mm, vetro</td></tr><tr><td>pipette P10, P20, P200 e P1000</td><td>qualsiasi marca va bene</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>pCp-Cy3-dye&nbsp;</td><td>Jena Biosciences</td><td>NU-1706-CY3</td><td>per l'etichettatura dell'RNA</td></tr><tr><td>RNA poli(A)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>trascritto in vitro nel nostro laboratorio, lunghezza circa 50 nucleotidi, come descritto in Kathe et al. Mol Biol Cell 2024</td></tr><tr><td>RNA s2m</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>trascritto in vitro nel nostro laboratorio, lunghezza 45 nucleotidi, sequenza: 5'-GGUUCACCGAGGCCACGCGGAGU ACGAUCGAGUGUACAGUGAACC-3', come descritto in Kathe et al. Mol Biol Cell 2024</td></tr><tr><td>proteina nucleocapside SARS-CoV-2</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>espresso ricombinantemente nel nostro laboratorio, come descritto in Kathe et al. Mol Biol Cell 2024</td></tr><tr><td>software per la rappresentazione grafica (es. R)</td><td>R-Project</td><td>Versione 4.2.1</td><td>https://www.r-project.org/</td></tr><tr><td>microscopio STORM</td><td>Nikon N-STORM</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>plugin ThunderSTORM</td><td>Ovesny et al. 2014</td><td>N/A</td><td>https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC4207427/</td></tr><tr><td>punte per le pipette utilizzate</td><td>qualsiasi marca va bene</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>TopSpin</td><td>Bruker</td><td>Versione 3.2 e 4.1</td><td></td></tr><tr><td>urea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5128</td><td></td></tr></tbody></table>

stabilizzazione di proteine e proteine—condensati di rna in idrogel di agarosio a bassa fusione per misurazioni biofisiche quantitative

Stabilizing Protein and Protein&#8212;RNA Condensates in Low-Melting Agarose Hydrogels for Quantitative Biophysical Measurements

Stabilizzazione di proteine e proteine—Condensati di RNA in idrogel di agarosio a bassa fusione per misurazioni biofisiche quantitative

Biomolecular condensates formed by liquid&#8211;liquid phase separation are increasingly recognized as fundamental organizational units of the cell, with ...

Pertanto, la nostra ricerca si è concentrata sullo sviluppo di un protocollo standardizzato di inclusione in agarosio per immobilizzare i condensati biomolecolari in tre dimensioni, preservandone al contempo le proprietà dinamiche. I condensati tendono infatti a muoversi, fondersi tra loro o aderire alle superfici, rendendo difficili determinate misurazioni. Questo protocollo di inclusione in agarosio risolve tali limitazioni.Per iniziare, pesare la quantità appropriata di agarosio a bassa fusione o normale e aggiungerla a un tubo da 1,5 millilitri contenente il buffer per gocce. Riscaldare la soluzione di agarosio a 80-90 gradi Celsius in un blocco riscaldante o in un bagno d'acqua, e sciogliere completamente l'agarosio vortexando per circa 10 minuti. Portare la soluzione di agarosio a 37 gradi Celsius per l'agarosio a bassa fusione, oppure a 55 gradi Celsius per l'agarosio normale, utilizzando il blocco riscaldante o il bagno d'acqua.Verificare che la soluzione rimanga chiara e liquida a questa temperatura. Controllare la temperatura della soluzione madre di agarosio con un termometro. Riscaldare preventivamente tutti i materiali che verranno a contatto diretto con l'agarosio a circa 37 gradi Celsius, ponendoli su un blocco riscaldante o in un incubatore per due o tre minuti.Raccogliere i reagenti necessari per preparare il buffer delle goccioline, i componenti di separazione di fase e gli additivi aggiuntivi per i campioni. Portare tutte le soluzioni preparate alla temperatura ambiente. Calcolare i volumi richiesti di buffer delle goccioline, soluzione madre di agarosio, componenti di separazione di fase e additivi supplementari per il campione.Come valori iniziali, utilizzare una concentrazione finale di agarosio pari a 0,3-0,5% peso/volume per saggi biofisici standard e 0,8-1,0% peso/volume per esperimenti di stabilizzazione a lungo termine. Aggiungere prima i volumi calcolati di tampone e agarosio, seguiti da additivi e componenti che inducono la separazione di fase, in una provetta da 1,5 millilitro preriscaldata.Mantenere il tubo nel blocco riscaldante o nel bagnomaria ed eseguire alcune aspirazioni e dispersioni della miscela con una pipetta, evitando la formazione di bolle d'aria. Utilizzando una pipetta, trasferire rapidamente il campione sul vetrino da microscopia. Lasciare solidificare il campione a temperatura ambiente per cinque-dieci minuti, quindi misurare il campione seguendo il protocollo standard di microscopia.Le goccioline formate con la proteina N e poli-A in presenza di agarosio a basso punto di fusione allo 0,5% peso/volume avevano dimensioni approssimativamente uguali a quelle formate senza agarosio a basso punto di fusione dopo cinque minuti a temperatura ambiente. A 60 minuti dalla preparazione del campione, le goccioline incorporate nell'agarosio non modificarono le proprie dimensioni, mentre i condensati senza agarosio a basso punto di fusione mostrarono un aumento drastico delle dimensioni a causa della fusione e dell'adesione alla superficie. Il recupero della fluorescenza dopo fotodissolvenza e la diffusione apparente delle goccioline risultarono molto simili in presenza e in assenza di agarosio a basso punto di fusione.Questo protocollo consente ai ricercatori di acquisire immagini e quantificare le goccioline su scale temporali estese, preservandone al contempo il comportamento dinamico. La sfida maggiore nell'esecuzione di questo protocollo consiste nell'impostare correttamente sia la temperatura dell'agarosio sia i tempi dell'inclusione. Una volta inclusi, i condensati possono essere studiati mediante una vasta gamma di tecniche microscopiche o altri metodi biofisici, come la risonanza magnetica nucleare (NMR).

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In questo video, dimostriamo le tecniche sperimentali utilizzate per fabbricare compatibile, della matrice extracellulare (ECM) substrati rivestiti adatto per colture cellulari e che sono suscettibili di microscopia a forza di trazione e di osservare gli effetti di rigidità ECM sul comportamento delle cellule.

Preparazione di matrici di reclamo per Quantificare Contrazione Cellular

Questo video mostra una tecnica di separazione denaturante basata su poliacrilammide per proteine. Questa tecnica aiuta nell'identificazione preliminare delle proteine in base al loro peso molecolare.

Elettroforesi su gel di poliacrilammide di sodio dodecil solfato per l'analisi delle proteine: una tecnica per separare e visualizzare le proteine in base al peso molecolare

Questo video mostra la separazione bidimensionale semi-denaturante su gel di agarosio basata sull'elettroforesi delle fibre amiloidi. La tecnica separa gli aggregati polimorfici di amiloide in base alle loro dimensioni eterogenee.

Elettroforesi su gel di agarosio semi-denaturante bidimensionale: una tecnica per separare le fibre di amiloide polimorfiche in base all'eterogeneità dimensionale

In questo video, dimostriamo un metodo di elettroforesi su gel bidimensionale che separa singole proteine da una complessa miscela proteica ottenuta da tessuti tumorali di adenoma ipofisario umano non funzionale (NFPA). Le proteine vengono separate in base alla loro carica elettrica nella prima dimensione e ulteriormente separate in base ai pesi molecolari nella seconda dimensione.

Elettroforesi su gel di poliacrilammide bidimensionale: una tecnica di separazione per l'analisi delle proteine in una miscela proteica complessa basata sulla carica e sul peso molecolare

Le tecniche tradizionali per la realizzazione di poliacrilammide (PA) gel contenenti sonde fluorescenti comportano un gel a sandwich tra una superficie aderente e un vetrino. Qui, dimostriamo che il rivestimento questa diapositiva con poli-D-lisina (PDL) e sonde fluorescenti localizza le sonde entro 1,6 micron dalla superficie del gel.

Un nuovo metodo per la localizzazione Reporter perline fluorescenti vicino alla superficie coltura cellulare per la trazione microscopia a forza

Viene presentato un protocollo per la produzione di tRNA (UUU) e l'analisi di tRNA (UUU) in complesso con l'enzima TcdA mediante saggi di retardazione del gel agarosio.

Analisi del rallentamento del gel agarosio proteina-tRNA per l&#39;analisi del<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -reonilcarbamoyladenosine TcdA Funzione

Una nuova tecnica di reometria forza-morsetto è utilizzata per studiare le proprietà meccaniche di campioni di idrogel a base di proteine a basso volume legati tra un motore bobina di voce e un sensore di forza. Un sistema (PID) di proporzionale-integrale-derivato analogico consente il bloccaggio della forza con esperienza per il protocollo desiderato.

Reometria forza-morsetto per la caratterizzazione di idrogel a base di proteine

Un protocollo è presentato per testare rapidamente la stabilità termica delle proteine in una varietà di condizioni attraverso analisi termica spostamento e nano differenziale a scansione fluorimetria. Sistemi di polmonatura, sali e additivi, insieme che comprende tre schermate di stabilità unica, sono analizzati con le proteine per identificare buffer adatto per studi strutturali e funzionali.

Come stabilizzare proteina: stabilità schermi per Thermal Shift saggi e Nano differenziale a scansione fluorimetria nel progetto Virus-X

È stato dimostrato che molte proteine intrinsecamente disordinate partecipano alla formazione di condensati biomolecolari altamente dinamici, un comportamento importante per numerosi processi cellulari. Qui, presentiamo un metodo basato sull'imaging a singola molecola per quantificare le dinamiche con cui le proteine interagiscono tra loro nei condensati biomolecolari nelle cellule vive.

Misura a singola molecola delle dinamiche di interazione proteica all'interno di condensati biomolecolari

Qui presentiamo protocolli per metodologie NMR, REstricted DIFfusion of INvisible speciEs (REDIFINE) e CONdensate DEtectioN by SEmi-solid Magnetization Transfer (CONDENSE-MT) che consentono la caratterizzazione quantitativa e senza etichettatura dei condensati biomolecolari in condizioni bifasiche, rivelando la partizione molecolare, la dinamica dello scambio, l'idratazione del condensato e la struttura delle gocce senza sedimentazione o marcatura.

Utilizzo della RMN in soluzione per caratterizzare condensati biomolecolari in condizioni bifasiche

Sebbene la rigidità della matrice extracellulare (ECM) sia un regolatore chiave del comportamento cellulare, i meccanismi di rilevamento e trasduzione sottostanti restano poco chiari. Per affrontare questo problema, forniamo protocolli per creare substrati a base di poliacrilammide e silicone con rigidità regolabile, per approfondire la nostra comprensione della diafonia cellula-ECM.

Generazione di substrati extracellulari in poliacrilammide e silicone con rigidità definita per applicazioni in biologia cellulare

ETH Zürich.  Qui presentiamo un metodo robusto per immobilizzare fisicamente i condensati separati in fase liquido-liquido all'interno di una matrice porosa di idrogel di agarosio a bassa fusione senza disturbare la loro dinamica interna dei liquidi. L'approccio minimizza la sedimentazione delle gocce, la coalescenza e gli artefatti di bagnamento superficiale, consentendo immagini riproducibili e analisi biofisiche quantitative per periodi di ore.

Stabilizzazione di proteine e proteine—Condensati di RNA in idrogel di agarosio a bassa fusione per misurazioni biofisiche quantitative

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