Name: Tecnica di contenimento manuale orientata al benessere per la somministrazione di sostanze e il campionamento ematico nei topi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-08-25T13:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Impara una tecnica di contenimento manuale orientata al benessere per somministrare sostanze e prelevare campioni ematici nei topi. Questo metodo riduce lo stress acuto rispetto alle tecniche tradizionali, migliorando il benessere animale e l'affidabilità dei risultati sperimentali.

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Ringraziamo il personale della struttura per animali e gli operatori per il benessere animale del Charité, in particolare il dottor André Dülsner, per il loro supporto; il Charité 3R per il sostegno finanziario alla diffusione del tunnel applicativo; e tutti i membri del Gruppo di Lavoro sul Perfezionamento del Charité 3R per le utili discussioni.

Tutte le procedure descritte in questo protocollo sono state esaminate e approvate dall'autorità locale competente (Ufficio statale per la salute e gli affari sociali di Berlino (LAGeSo); numero di approvazione 2022-077-G) e sono state condotte in conformità con le linee guida ARRIVE 2.0. Tutti i materiali utilizzati in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali.
1. Amministrazione endovenosa
NOTA: Questo metodo descrive un approccio manuale di contenimento orientato al benessere animale per la somministrazione endovenosa nei topi. Le iniezioni endovenose devono essere eseguite esclusivamente da personale qualificato, nel rispetto delle linee guida istituzionali e delle procedure stabilite per la sicurezza e l'igiene.
<ol>
	<li>Preparazione degli animali 
	ATTENZIONE: Indossare sempre i dispositivi di protezione individuale (DPI) necessari in base ai requisiti di biosicurezza e igiene dell'istituto (ad esempio, camici, guanti, cuffie, mascherine) quando si lavora con animali.
	<ol>
		<li>Posizionare la gabbia di mantenimento sotto una lampada rossa per 10–15 minuti per favorire la vasodilatazione e migliorare la visibilità delle vene della coda.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparazione dell'area di lavoro
	<ol>
		<li>Pulire il tunnel di applicazione con etanolo al 70%. Lasciare evaporare completamente l'etanolo per circa 5 minuti.</li>
		<li>Posizionare all'interno del tunnel un pezzo arrotolato di materiale di fondo lavato e autoclavato (tagliare un Vetbed Isobed alle dimensioni richieste) (Figura 1B).</li>
		<li>Utilizzando le dita, comprimere delicatamente il materiale di fondo all'ingresso del tunnel fino a quando l'apertura residua corrisponde alla larghezza di due dita adiacenti. Non comprimere ulteriormente il materiale.</li>
		<li>Posizionare il tunnel di applicazione sulla superficie di lavoro e collocare un ulteriore pezzo di materiale di fondo piatto davanti all'ingresso del tunnel.</li>
		<li>Preparare la siringa per iniezione dotata di ago da 27G contenente la soluzione da iniettare e posizionarla accanto al tunnel. Assicurarsi che siano disponibili tamponi e spray disinfettante.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Contenimento orientato al benessere animale in un tunnel
	<ol>
		<li>Trasferire il topo dalla gabbia di mantenimento utilizzando un tubo di manipolazione.</li>
		<li>Consentire al topo di entrare volontariamente nel tunnel di applicazione posizionando il tubo di manipolazione direttamente davanti all'apertura del tunnel (Figura 1C). 
		NOTA: Alcuni topi preferiscono appoggiarsi prima sul materiale di fondo posizionato davanti al tunnel di applicazione prima di entrare volontariamente nel tunnel. È possibile impedire che i topi procedano troppo in profondità all'interno del tunnel tenendo delicatamente la base della coda.</li>
		<li>Una volta all'interno, il topo rimane generalmente posizionato all'interno del materiale arrotolato senza girarsi. 
		NOTA: Se i topi non entrano nel tunnel, l'apertura potrebbe essere troppo piccola; comprimere leggermente il materiale all'ingresso del tunnel. Se i topi sono troppo piccoli e tendono a girarsi, stringere ulteriormente il materiale arrotolato o aggiungere uno strato supplementare (Figura 1B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Iniezione endovenosa 
	NOTA: L'iniezione endovenosa viene eseguita seguendo procedure convenzionali ben consolidate per l'iniezione nella vena della coda.
	<ol>
		<li>Raddrizzare delicatamente la coda tenendone l'estremità e disinfettare il sito previsto per l'iniezione. Ruotare la coda di circa 90° per posizionare le vene laterali della coda in posizione dorsale.</li>
		<li>Iniziare l'iniezione all'estremità distale della coda per consentire ulteriori tentativi in siti più prossimali, se necessario. 
		PASSAGGIO CRITICO: Inserire l'ago con un angolo di circa 15–20° rispetto alla coda, mantenendolo quasi parallelo alla stessa. Inserire l'ago appena oltre il bisellino, poiché le vene della coda sono superficiali. Un corretto posizionamento dell'ago è indicato da una resistenza minima durante l'iniezione e dal flusso visibile della soluzione iniettata attraverso la vena. Iniettare il volume desiderato a un ritmo lento e costante (≤5 mL/kg in 13 s). Dopo il ritiro dell'ago, applicare una leggera pressione sul sito di iniezione con un tampone sterile per prevenire emorragie. 
		ATTENZIONE: Smaltire immediatamente aghi e siringhe usati in contenitori per rifiuti taglienti a prova di perforazione e resistenti alle perdite. Non tentare di riposizionare il cappuccio sugli aghi per prevenire lesioni da punta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rilascio e rinforzo positivo
	<ol>
		<li>Riportare il tunnel contenente il topo nella gabbia di mantenimento e consentire all'animale di uscire volontariamente dall'estremità opposta del tunnel (Figura 1C).</li>
		<li>Fornire premi nella gabbia di mantenimento per favorire il rinforzo positivo e l'abituazione alla procedura.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pulizia e manutenzione
	<ol>
		<li>Rimuovere il materiale interno dal tunnel di applicazione. Pulire il tunnel di applicazione con etanolo al 70%.</li>
		<li>Se il materiale di fondo rimane pulito, può essere riutilizzato per esperimenti successivi. Se contaminato o visibilmente sporco, lavarlo e autoclavarlo prima del riutilizzo. 
		NOTA: Utilizzare un materiale di fondo per ogni gruppo sperimentale. Sostituire il materiale tra esperimenti diversi, tra animali maschi e femmine e ogni qualvolta richiesto dalle linee guida istituzionali sull'igiene.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Amministrazione intraperitoneale 
NOTA: Questo metodo descrive un approccio manuale di contenimento rispettoso del benessere animale per la somministrazione intraperitoneale nei topi. Le iniezioni intraperitoneali devono essere eseguite esclusivamente da personale qualificato, nel rispetto delle linee guida istituzionali e secondo procedure igienico-sanitarie consolidate. Per facilitare un migliore accesso alla zona di iniezione, si utilizza un tunnel di applicazione in combinazione con una piattaforma inclinata (cuneo), che solleva la parte posteriore dei topi verso l'alto.
<ol>
	<li>Preparazione dell'area di lavoro
	<ol>
		<li>Pulire il tunnel di applicazione e il cuneo con etanolo al 70%. Lasciare evaporare completamente l'etanolo per circa 5 minuti.</li>
		<li>Posizionare all'interno del tunnel un pezzo arrotolato di rivestimento lavato e autoclavato (tagliare un Vetbed Isobed alle dimensioni richieste) (Figura 1B).</li>
		<li>Utilizzando le dita, comprimere delicatamente il rivestimento all'ingresso del tunnel finché l'apertura rimanente corrisponda approssimativamente alla larghezza di due dita adiacenti. Non comprimere ulteriormente il rivestimento.</li>
		<li>Posizionare il tunnel di applicazione sopra il cuneo (Figura 1D) sulla superficie di lavoro e posizionare un ulteriore rivestimento piatto davanti all'ingresso del tunnel.</li>
		<li>Preparare la siringa per iniezione dotata di ago da 27G contenente la soluzione desiderata e posizionarla accanto al tunnel.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Contenimento orientato al benessere animale in un tunnel 
	ATTENZIONE: Indossare sempre i dispositivi di protezione individuale (DPI) necessari in base ai requisiti di biosicurezza e igienici dell'istituto (ad esempio camici, guanti, cuffie, mascherine) quando si lavora con animali.
	<ol>
		<li>Trasferire il topo dalla gabbia di mantenimento utilizzando un tubo di manipolazione. Consentire al topo di entrare volontariamente nel tunnel di applicazione posizionando il tubo di manipolazione direttamente davanti all'apertura del tunnel (Figura 1C). 
		NOTA: Alcuni topi preferiscono appoggiarsi prima sul rivestimento posizionato davanti al tunnel di applicazione prima di entrare volontariamente nel tunnel. In questo caso, consentire al topo di entrare nel tunnel prima di posizionare il tunnel sul cuneo.</li>
		<li>Una volta all'interno, trattenere delicatamente la base della coda tra pollice e indice per impedire al topo di avanzare troppo all'interno del tunnel. Il topo di solito rimane posizionato all'interno del rivestimento arrotolato senza girarsi. 
		NOTA: Se i topi non entrano nel tunnel, l'apertura potrebbe essere troppo piccola; comprimere leggermente il rivestimento all'ingresso del tunnel. Se i topi sono troppo piccoli e tendono a girarsi, stringere ulteriormente il rivestimento arrotolato o aggiungere uno strato supplementare (Figura 1B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Iniezione intraperitoneale
	<ol>
		<li>Tenere la base della coda tra pollice e indice di una mano (Figura 1C). Applicare una leggera pressione sulla zona sacrale utilizzando il dito medio della stessa mano e sollevare leggermente la coda. Questo stabilizza l'animale e consente un chiaro accesso alla regione addominale caudale.</li>
		<li>PASSO CRITICO: Eseguire l'iniezione tenendo la siringa parallela alla superficie di lavoro e inserendola nella regione addominale caudale chiaramente visibile.</li>
		<li>Dopo l'iniezione, rilasciare delicatamente la pressione e lasciare la coda. 
		ATTENZIONE: Smaltire immediatamente aghi e siringhe usati in contenitori per rifiuti taglienti a prova di puntura e resistenti alle perdite. Non tentare di riposizionare il cappuccio sugli aghi per prevenire lesioni da punta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rilascio e rinforzo positivo
	<ol>
		<li>Riportare il tunnel contenente il topo nella gabbia di mantenimento e consentire all'animale di uscire volontariamente dall'estremità opposta del tunnel (Figura 1C).</li>
		<li>Fornire premi nella gabbia di mantenimento per favorire il rinforzo positivo e l'abituazione alla procedura.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pulizia e manutenzione
	<ol>
		<li>Rimuovere il rivestimento interno dal tunnel di applicazione. Pulire il tunnel di applicazione e il cuneo con etanolo al 70%.</li>
		<li>Se il rivestimento rimane pulito, può essere riutilizzato per esperimenti successivi. Se contaminato o visibilmente sporco, lavarlo e autoclavarlo prima del riutilizzo. 
		NOTA: Utilizzare un rivestimento per ogni gruppo sperimentale. Sostituire il rivestimento tra esperimenti diversi, tra animali maschi e femmine e ogni volta richiesto dalle linee guida igieniche istituzionali.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Prelievo di sangue dalla vena della coda
NOTA: Questo metodo descrive un approccio manuale orientato al benessere animale per il prelievo di sangue dalla vena della coda nei topi. Tutte le procedure devono essere eseguite da personale qualificato nel rispetto delle linee guida istituzionali e dei protocolli consolidati in materia di sicurezza e igiene.
<ol>
	<li>Preparazione dell'area di lavoro
	<ol>
		<li>Pulire il tunnel di applicazione con etanolo al 70%. Lasciare evaporare completamente l'etanolo per circa 5 minuti.</li>
		<li>Posizionare un pezzo arrotolato di rivestimento lavato e autoclavato (tagliare un Vetbed Isobed alla dimensione richiesta) all'interno del tunnel (Figura 1B).</li>
		<li>Utilizzando le dita, comprimere delicatamente il rivestimento all'ingresso del tunnel fino a quando l'apertura rimanente ha una larghezza approssimativamente pari a quella di due dita adiacenti. Non comprimere ulteriormente il rivestimento.</li>
		<li>Posizionare il tunnel di applicazione sulla superficie di lavoro e collocare un ulteriore rivestimento piatto davanti all'ingresso del tunnel.</li>
		<li>Assicurarsi che lancette, microprovette per il prelievo di sangue, tamponi e spray disinfettante siano facilmente accessibili.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Contenimento orientato al benessere in un tunnel 
	ATTENZIONE: Indossare sempre i dispositivi di protezione individuale (DPI) necessari in base ai requisiti di biosicurezza e igienici dell'istituto (ad esempio camici, guanti, cuffie, mascherine) quando si lavora con animali.
	<ol>
		<li>Trasferire il topo dalla gabbia di mantenimento utilizzando un tubo di manipolazione. Consentire al topo di entrare volontariamente nel tunnel di applicazione posizionando il tubo di manipolazione direttamente davanti all'apertura del tunnel (Figura 1C). 
		NOTA: Alcuni topi preferiscono prima salire sul rivestimento posizionato davanti al tunnel di applicazione prima di entrare volontariamente nel tunnel. È possibile impedire ai topi di avanzare troppo all'interno del tunnel tenendo delicatamente la base della coda.</li>
		<li>Una volta all'interno, il topo rimane tipicamente posizionato all'interno del rivestimento arrotolato senza girarsi. 
		NOTA: Se i topi non entrano nel tunnel, l'apertura potrebbe essere troppo piccola; comprimere leggermente il rivestimento all'ingresso del tunnel. Se i topi sono troppo piccoli e tendono a girarsi, stringere ulteriormente il rivestimento arrotolato o aggiungere uno strato supplementare (Figura 1B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Prelievo di sangue
	<ol>
		<li>Raddrizzare delicatamente la coda tenendone la punta e disinfettare il sito di prelievo previsto. Ruotare la coda di circa 90° per posizionare le vene laterali della coda in posizione dorsale.</li>
		<li>FASE CRITICA: Pungere la vena laterale utilizzando una lancetta. Raccogliere le gocce di sangue con una microprovetta o una pipetta capillare. 
		ATTENZIONE: Smaltire immediatamente le lancette usate in contenitori per materiali taglienti resistenti alle perforazioni e impermeabili. Non tentare di riposizionare il cappuccio sulle lancette per prevenire lesioni da punta.</li>
		<li>Dopo il prelievo, applicare una leggera pressione sul sito di puntura con un tampone sterile per controllare l'emorragia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rilascio e rinforzo positivo
	<ol>
		<li>Riportare il tunnel contenente il topo nella gabbia di mantenimento e consentire all'animale di uscire volontariamente dall'estremità opposta del tunnel (Figura 1C).</li>
		<li>Fornire premi nella gabbia di mantenimento per favorire il rinforzo positivo e l'abituazione alla procedura.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pulizia e manutenzione
	<ol>
		<li>Rimuovere il rivestimento interno dal tunnel di applicazione. Pulire il tunnel di applicazione con etanolo al 70%.</li>
		<li>Se il rivestimento rimane pulito, può essere riutilizzato per esperimenti successivi. Se contaminato o visibilmente sporco, lavarlo e autoclavarlo prima del riutilizzo. 
		NOTA: Utilizzare un rivestimento per ogni gruppo sperimentale. Sostituire il rivestimento tra esperimenti diversi, tra animali maschi e femmine e ogniqualvolta richiesto dalle linee guida igieniche dell'istituto.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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A.S., J.K.U. e L.H. detengono un modello di utilità per il tunnel di iniezione in Germania (numero di registrazione 20 2024 100 448). Tutti gli altri autori dichiarano di non avere conflitti di interessi.

Questa tecnica di contenimento è stata sviluppata per la somministrazione di sostanze e il prelievo di sangue, al fine di sostenere un approccio basato sulle migliori pratiche per il benessere animale. Alcune comunità scientifiche continuano a essere restie ad adottare metodi di manipolazione e contenimento migliorati che si discostano dalle procedure standardizzate a lungo consolidate, specialmente quando potrebbero richiedere tempo ed impegno aggiuntivi. Tuttavia, ridurre lo stress negli animali da laboratorio non è solo auspicabile dal punto di vista del benessere animale, ma contribuisce in modo sostanziale anche al successo sperimentale, riducendo la variabilità dei dati, minimizzando le alterazioni fisiologiche indotte dallo stress e diminuendo i tentativi falliti e l'abbandono degli animali. Questo protocollo presenta un metodo di facile implementazione che migliora significativamente il benessere animale, garantendo al contempo un contenimento sicuro e un accesso libero alle mani per procedure di somministrazione e prelievo sicure.
Un passaggio fondamentale del protocollo consiste nell'assicurare un ingresso corretto e una posizione stabile all'interno del tunnel applicativo. Per quanto riguarda l'ingresso volontario, si raccomandano due possibili approcci: l'ingresso diretto dal tubo di trasferimento nel tunnel oppure il posizionamento preliminare dei topi dal tubo di trasferimento sulla guarnizione morbida pre-posizionata, dalla quale possono quindi entrare nel tunnel. L'approccio ottimale dipende dal comportamento degli animali, e entrambi i metodi devono essere valutati. La variante preferita è quella in cui i topi entrano più rapidamente e con minore riluttanza. Se i topi esitano ad entrare nel tunnel, è necessario considerare diversi fattori: (1) l'apertura di ingresso potrebbe essere troppo stretta; in tal caso, la guarnizione può essere leggermente compressa per allargare l'apertura; (2) gli stimoli olfattivi provenienti dalla guarnizione interna potrebbero influenzare l'accettazione; pertanto, è preferibile che le guarnizioni conservino l'odore familiare della gabbia, garantendo al contempo la separazione tra gruppi sperimentali, gabbie e sessi, e sostituendo il materiale sporco per evitare odori confondenti; (3) è stato dimostrato che i topi si sentono più al sicuro su superfici con colori simili al colore del loro pelo14, quindi abbinare il colore della guarnizione al colore del pelo degli animali potrebbe essere vantaggioso; e (4) posizionare l'apertura del tunnel verso la parete della gabbia potrebbe favorire l'ingresso, poiché i topi possono ancora vedere la gabbia di provenienza e i compagni di gabbia. Un potenziale limite del tunnel applicativo è che esso si basa sull'ingresso volontario dell'animale, il che potrebbe essere percepito come un breve ritardo prima del trattamento o del campionamento. Tuttavia, in questo studio, i topi sono entrati nel tunnel rapidamente e in modo costante, tipicamente entro 2–10 s, consentendo di eseguire le procedure entro una finestra temporale ristretta e riproducibile. Sebbene questo approccio possa richiedere un tempo leggermente maggiore rispetto al bloccaggio tradizionale per la nuca, l'aumento modesto della durata del manipolamento deve essere valutato in relazione al notevole miglioramento del benessere animale ottenuto riducendo lo stress associato al manipolamento. Inoltre, l'inserimento nei dispositivi di contenimento tradizionali è anch'esso associato a un tempo di manipolamento, poiché i topi spesso resistono al posizionamento, determinando così alcuna differenza rilevante. In meno del 5% dei casi, i topi non sono entrati volontariamente nel tunnel. Sebbene le misure descritte sopra siano generalmente sufficienti per incoraggiare l'ingresso, gli animali possono essere delicatamente assistiti nell'ingresso nel tunnel, se necessario. Anche in questi casi, la guarnizione interna morbida offre un vantaggio in termini di benessere rispetto ai dispositivi di contenimento tradizionali.
Una volta all'interno del tunnel, i topi riescono ad aggrapparsi saldamente alla fodera interna. Questo aspetto è molto favorevole dal punto di vista del benessere animale, poiché è stato dimostrato che i topi immobilizzati mostrano livelli di stress inferiori quando possono aggrapparsi a una superficie durante la manipolazione4. Allo stesso tempo, l'operatore può tenere saldamente la base della coda senza che il topo tenti di girarsi. È essenziale che la fodera interna avvolga strettamente l'animale. Se i topi sono troppo piccoli e tendono a ruotare all'interno del tunnel, è possibile effettuare rapidamente delle regolazioni stringendo ulteriormente la fodera arrotolata o aggiungendo uno strato supplementare. Per esperimenti che coinvolgono animali di dimensioni diverse (ad esempio a causa di età, sesso o dieta differenti), possono essere utilizzati tunnel con diametri variabili (vedere i modelli di stampa8).
Le iniezioni e il prelievo di sangue devono essere sempre eseguiti da personale qualificato. Tuttavia, il tunnel per l'applicazione si è rivelato efficace sia per il personale altamente esperto che per gli utenti meno esperti. In particolare, il personale inesperto ha riportato un numero inferiore di tentativi non riusciti, riducendo così le manipolazioni ripetute e le procedure prolungate. Gli utenti hanno inoltre riferito di sentirsi più a proprio agio e sicuri nel trattenere i topi all'interno del tunnel, rispetto all'apprendimento delle tradizionali tecniche di fissazione manuale. Questo rappresenta un vantaggio considerevole per laboratori con un elevato turnover del personale, poiché il metodo è facile da adottare e offre benefici sia agli animali che all'operatore. Queste osservazioni sono in linea con i miglioramenti precedentemente riportati riguardo al comfort durante la manipolazione e alla sicurezza del tecnico, associati a tecniche di manipolazione migliorate come il tunnel handling e il cup handling15.
È importante notare che il metodo qui descritto è efficace anche nei topi non addestrati, e tutti i risultati presentati sono stati ottenuti utilizzando animali privi di un'abituazione precedente. Studi precedenti hanno dimostrato che l'abituazione e l'addestramento medico degli animali possono ridurre le risposte allo stress nei topi, familiarizzandoli con le procedure previste16,17. Un protocollo di addestramento che includa l'utilizzo del tunnel potrebbe quindi ulteriormente ridurre i livelli di stress, specialmente quando sono necessarie interventi frequenti, che altrimenti potrebbero indurre associazioni negative con il tunnel. Tale programma di addestramento è stato applicato con successo in uno studio precedente, permettendoci di utilizzare il tunnel per iniezioni intraperitoneali ripetute per molte settimane8. In particolare negli studi che richiedono iniezioni ripetute, il tunnel può rappresentare un notevole miglioramento. Tecniche di manipolazione migliorate, che utilizzano tubi di trasferimento e una restrizione ridotta, hanno dimostrato di mantenere effetti positivi anche dopo ripetuti episodi di restrizione per il collo o iniezioni intraperitoneali, inclusa una maggiore disponibilità all'interazione con gli sperimentatori e una riduzione dei comportamenti simili all'ansia nei test comportamentali standard18,19. Allo stesso modo, iniezioni ripetute effettuate all'interno del tunnel non hanno aumentato i parametri legati allo stress nei topi8.
È stato dimostrato che le ricompense alimentari facilitano l'abituazione attraverso il rinforzo positivo, un principio ben consolidato nella formazione animale. Pertanto, si raccomanda di offrire una piccola prelibatezza alla fine di ogni sessione di manipolazione come ricompensa. Durante i test con il tunnel, quantità molto ridotte, come un singolo granello d'avena, si sono rivelate sufficienti e difficilmente interferiscono con la dieta normale degli animali. Se l'assunzione di cibo rappresenta un problema, ad esempio in studi metabolici, sono disponibili anche prelibatezze aromatizzate compatibili con diete specializzate (ad esempio, diete chetogeniche). È importante considerare le prelibatezze come una misura aggiuntiva di affinamento che migliora l'abituazione, piuttosto che un prerequisito per l'uso efficace del tunnel applicativo. Una volta familiari con il sistema, i topi entravano volontariamente nel tunnel applicativo più volte anche senza ricevere una ricompensa alimentare.
Il metodo qui descritto presenta alcune limitazioni per quanto riguarda l'accesso a specifiche regioni del corpo. Mentre la coda può essere facilmente e sicuramente utilizzata per iniezioni endovenose e prelievi di sangue, e la regione addominale caudale è adatta per iniezioni intraperitoneali, l'accesso alle regioni laterali del corpo per applicazioni sottocutanee è limitato. L'amministrazione orale deve essere inoltre considerata con attenzione. La gavaggio orale convenzionale non è compatibile con questo sistema, poiché non è possibile ottenere l'estensione del collo richiesta. Tuttavia, metodi di somministrazione orale più raffinati, nei quali i topi ingeriscono volontariamente sostanze da una punta di pipetta (ad esempio, mescolate con latte condensato)20, potrebbero essere fattibili attraverso il lato aperto del tunnel. In tali casi, è necessario garantire che la testa rimanga chiaramente visibile e che il topo non sia posizionato troppo in profondità all'interno del rivestimento o del tunnel, al fine di confermare l'ingestione completa della sostanza.
Rispetto ai tunnel di contenimento esistenti, il tunnel per applicazioni descritto in questo studio offre chiari vantaggi per il benessere animale. Sebbene la restrizione sia spesso necessaria per procedure sicure di applicazione e campionamento, è riconosciuta anche come uno dei maggiori fattori di stress che i roditori sperimentano durante le procedure sperimentali7,21,22. Studi precedenti hanno già dimostrato che sostituire la manipolazione tradizionale per la coda e la restrizione con metodi migliorati, come la manipolazione con tunnel o a coppa, migliora significativamente il benessere animale. I topi manipolati con questi approcci raffinati mostrano livelli inferiori di ansia e una maggiore disponibilità a interagire con gli sperimentatori rispetto ai topi sollevati per la coda23,24. L'utilizzo del tunnel per applicazioni, che i topi entrano volontariamente, rappresenta un'estensione coerente della manipolazione con tunnel. La scala delle smorfie dei topi che escono dal tunnel per applicazioni indica che gli animali non si sentono trattenuti o intrappolati. Sebbene il metodo di iniezione intraperitoneale in cui i topi si aggrappano alla griglia della gabbia assomigli alla presa descritta che solleva la zona pelvica5, il primo si basa sulla lotta dell'animale per fuggire. Su una griglia, i topi si aggrappano con le zampe e tirano in avanti, allontanandosi dalla presa degli sperimentatori, causando restrizione e quindi stress. Inoltre, questo tipo di contenimento aumenta il tono muscolare addominale, favorendo conseguentemente il dolore provocato dalla puntura dell'ago. Al contrario, il tunnel per applicazioni rappresenta un metodo di contenimento raffinato, e i risultati indicano una riduzione dei parametri associati allo stress, inclusi punteggi più bassi nella scala delle smorfie, minori vocalizzazioni udibili e mantenuta disponibilità all'interazione con gli sperimentatori811,12,13. Sebbene le vocalizzazioni ultrasoniche (USVs) siano sempre più riconosciute come segnali comunicativi etologicamente rilevanti, il loro utilizzo come indicatori di stress nei topi adulti è ancora in fase di studio, poiché le USVs sono fortemente dipendenti dal contesto e si verificano anche durante comportamenti fisiologici normali25.
Tuttavia, prove recenti suggeriscono che la registrazione dei vocalizzi ultrasonici (USV) potrebbe rappresentare un approccio promettente, non invasivo e riproducibile per valutare le risposte comportamentali al contenimento26. L'inclusione delle registrazioni USV in futuri studi potrebbe quindi fornire una misura oggettiva aggiuntiva per caratterizzare ulteriormente lo stress e le risposte emotive. Nel complesso, questi risultati indicano che il tunnel per applicazioni consente una procedura di contenimento più sicura e meno stressante per applicazioni e prelievi di routine rispetto ai contenitori tradizionali. In modo importante, a differenza dei contenitori acrilici trasparenti, la fodera interna morbida permette ai topi di aggrapparsi saldamente alla superficie, un aspetto considerato un importante miglioramento del benessere secondo le raccomandazioni del NC3Rs27. Sono stati osservati notevolmente meno tentativi di girarsi all'interno del tunnel, migliorando sia il benessere che la sicurezza durante la manipolazione. Nei contenitori di plastica convenzionali, i tentativi di girarsi sono spesso associati all'urinazione, e il pelo bagnato risultante compromette ulteriormente il comfort. Questo problema è stato in gran parte eliminato con l'uso del tunnel per applicazioni.
Le potenziali applicazioni di questo metodo sono ampie. In particolare, il metodo di contenimento migliorato non è limitato ai topi, ma può essere applicato anche ai ratti utilizzando un tunnel di diametro maggiore (Supplementary Figure 1). I roditori sono le specie animali da laboratorio più utilizzate in tutte le discipline scientifiche e il contenimento per la somministrazione di sostanze e il prelievo di campioni è una procedura di routine in molti laboratori. Tuttavia, è stato dimostrato che lo stress da contenimento non solo compromette il benessere animale, ma influisce anche in modo significativo sui risultati scientifici, inclusi i comportamenti28,29 e i meccanismi fisiologici come la funzione immunitaria30. Pertanto, ridurre la variabilità legata allo stress è essenziale sia per la validità scientifica che per le considerazioni etiche negli esperimenti sugli animali. Riducendo lo stress associato al contenimento pur mantenendo una manipolazione sicura e pratica, il tunnel per l'applicazione potrebbe migliorare in modo sostanziale la qualità e la riproducibilità degli esperimenti, aumentando al contempo il benessere animale.

I test sugli animali continuano a svolgere un ruolo centrale nella ricerca biomedica, contribuendo in modo significativo alla comprensione dei meccanismi delle malattie e alla valutazione dell'efficacia e della sicurezza di farmaci e sostanze chimiche. I roditori rappresentano le specie animali da laboratorio più comunemente utilizzate; nell'Unione Europea, nel 2023 sono stati impiegati circa 3,5 milioni di topi e 0,5 milioni di ratti a fini scientifici1. Una crescente sensibilità sociale riguardo alle sofferenze causate dalle procedure sperimentali ha portato a requisiti legislativi volti a migliorare il benessere animale negli studi di ricerca, in conformità con il principio delle 3R2,3. Poiché la sostituzione completa dei test sugli animali con metodi alternativi non è ancora possibile, l'ottimizzazione delle procedure sperimentali esistenti è particolarmente importante per ridurre la sofferenza animale. Il trattamento degli animali, compresi i blocchi di immobilizzazione durante procedure come le iniezioni, è una delle interazioni più comuni cui gli animali da laboratorio sono sottoposti sia nella cura di routine che durante gli esperimenti.
Il metodo tradizionale di immobilizzazione per iniezioni intraperitoneali prevede l'afferraggio deciso della pelle e del pelo a livello del collo con pollice e indice, il bloccaggio della coda e la rotazione dell'animale per esporre l'addome e consentire le iniezioni. Questa posizione è innaturale e può causare difficoltà respiratorie, inducendo timore negli animali4. Sono già state descritte diverse tecniche di contenimento migliorate, tra cui, ad esempio, il cosiddetto metodo a tre dita, in cui la pressione nell'area del collo è ridotta rispetto alle tecniche classiche di afferraggio del collo4. Un altro metodo evita in larga misura l'immobilizzazione completa: in questo caso, gli animali possono aggrapparsi a una griglia metallica mentre coda e arti posteriori vengono immobilizzati, consentendo l'accesso al basso addome per le iniezioni5. Tuttavia, entrambe le procedure presentano limitazioni. Con il metodo a tre dita, gli animali devono comunque essere sollevati e posizionati in una postura innaturale, il che può potenzialmente innescare risposte di stress. La tecnica alternativa, d'altro canto, non offre una protezione sufficiente contro i morsi di animali stressati o difensivi e può limitare il tempo disponibile per eseguire le iniezioni. Oltre al rischio di lesioni da morso, vi è anche un aumento del rischio di immobilizzazione inadeguata o di incidenti da puntura accidentale con l'ago. L'immobilizzazione per iniezioni endovenose o per il prelievo di sangue dalla vena della coda richiede l'uso di dispositivi di contenimento che immobilizzano gli animali senza necessità di tenerli manualmente, lasciando le mani libere per le procedure. Tali dispositivi sono generalmente tubi in acrilico trasparente, dotati di un'estremità chiusa con fessure o fori per l'accesso alla coda e un'estremità aperta per l'inserimento dei topi, che può essere chiusa con tappi regolabili. Questo metodo richiede che gli animali vengano afferrati per la coda e inseriti nel contenitore partendo dal posteriore, in modo che la coda possa essere fatta passare attraverso le fessure di accesso. Si tratta di una procedura stressante, aggravata dal diametro piuttosto ridotto dei contenitori, necessario per impedire ai topi di girarsi durante le procedure, il che potrebbe causare lesioni6,7.
Questo protocollo descrive l'uso di un tunnel per applicazioni appena sviluppato per iniezioni e prelievi di sangue nei topi, che permette una fissazione meno invasiva ma comunque sicura. Il tunnel è composto da una struttura esterna rigida e da un rivestimento interno rimovibile in morbido tessuto, che crea uno spazio scuro e soffice simile a una tana. Rispetto ai contenitori tradizionali, il tunnel è stato progettato deliberatamente con dimensioni maggiori per ospitare un inserto in Vetbed Isobed tagliato su misura, fornendo un rivestimento interno morbido e confortevole che aumenta la sensazione di sicurezza degli animali mantenendo un adeguato contenimento (Figura 1A–B). Entrambe le estremità del tunnel sono aperte, quindi i topi possono entrare semplicemente camminando dalla parte anteriore ed uscire da quella posteriore. Una volta all'interno del tunnel, gli animali non possono girarsi, mentre la coda rimane accessibile per iniezioni endovenose o prelievi ematici (Figura 1C). Per le iniezioni intraperitoneali, la regione addominale caudale può essere raggiunta posizionando il tunnel in posizione obliqua (Figura 1D) e tenendo la coda dell'animale alla base, applicando al contempo una leggera pressione sulla zona sacrale, flettendo la parte posteriore del topo verso l'alto (Figura 1C). Questo metodo risulta meno stressante sia per i topi che per gli sperimentatori, poiché non richiede la fissazione manuale.
Uno studio precedente ha dimostrato che l'uso del tunnel per iniezioni intraperitoneali riduce in modo duraturo i livelli di stress e migliora il benessere dei topi, anche in modelli sperimentali con iniezioni intraperitoneali frequenti8. In questo studio, il tunnel è stato testato con successo anche per iniezioni endovenose e prelievi ematici dalla vena della coda sia in topi maschi che femmine.

<table><tbody><tr><td>Lancette sterili per allergia</td><td>Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH, Amburgo, Germania</td><td>1110106</td><td></td></tr><tr><td>Tunnel applicatore con cuneo opzionale</td><td>Tunnel stampato in 3D in laboratorio</td><td></td><td>i modelli di stampa sono disponibili all'indirizzo https://osf.io/vsjnb.</td></tr><tr><td>Provette per il prelievo di sangue: Microvette 100 EDTA K3E, 100 &amp;micro;L&amp;nbsp;</td><td>SARSTEDT AG &amp;amp; Co. KG, N&amp;uuml;mbrecht, Germania</td><td>20.1278.100</td><td></td></tr><tr><td>Provetta trasparente per manipolazione</td><td>Datesand Group, Stockport, Regno Unito</td><td>GZCHTUBE-100</td><td>dimensioni: 50 x 3 x 100 mm</td></tr><tr><td>Etilene, &amp;ge;70%</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germania</td><td>T913.1</td><td></td></tr><tr><td>Siringa monouso per dosaggio preciso Inject-F da 1 mL&amp;nbsp;</td><td>B.Braun Deutschland GmbH &amp;amp; Co. KG, Melsungen, Germania</td><td>9166017V</td><td></td></tr><tr><td>Avena</td><td>Schapfen M&amp;uuml;hle GmbH Co.KG, Ulma, Germania</td><td>W100197</td><td>autoclavata</td></tr><tr><td>Lampada a infrarossi Sanitas SIL 06</td><td>Beurer Europe GmbH, Ulma, Germania</td><td>61424</td><td></td></tr><tr><td>Fodera interna morbida: Original Vetbed Isobed SL</td><td>Vetbed Deutschland, Mudersbach, Germania</td><td>1999981</td><td>ritagliata alle dimensioni richieste</td></tr><tr><td>Disinfettante spray Softasept ISO 70%</td><td>B.Braun Deutschland GmbH &amp;amp; Co. KG, Melsungen, Germania</td><td>19905</td><td></td></tr><tr><td>Aghi ipodermici sterili monouso Sterican 27 G x &amp;frac34;</td><td>B.Braun Deutschland GmbH &amp;amp; Co. KG, Melsungen, Germania</td><td>4657705B</td><td>dimensioni: 0,40 mm x 20 mm</td></tr><tr><td>Tamponi: applicatori medici FIWA app</td><td>Fink &amp;amp; Walter GmbH, Merchweiler, Germania</td><td>329012</td><td></td></tr></tbody></table>

tecnica di contenimento manuale orientata al benessere per la somministrazione di sostanze e il campionamento ematico nei topi

Welfare-Oriented Manual Restraint Technique for Substance Administration and Blood Sampling in Mice

I test sugli animali rimangono essenziali nella ricerca biomedica, contribuendo in modo significativo alla comprensione dei meccanismi delle malattie e alla valutazione dell'efficacia e della sicurezza di farmaci e sostanze chimiche, con i roditori tra gli animali da laboratorio più utilizzati. Tra gli interventi più comuni nella pratica di laboratorio vi sono la manipolazione e l'immobilizzazione durante procedure come iniezioni e prelievi di sangue, che vengono regolarmente eseguiti su topi coscienti senza sedazione o anestesia. Una corretta immobilizzazione è necessaria per garantire la sicurezza sia dell'animale che dell'operatore. Tuttavia, i metodi tradizionali di immobilizzazione, come la fissazione manuale o l'uso di tubi contenitori, sono noti per indurre risposte acute da stress nei topi, compromettendo così il benessere animale e potenzialmente influenzando i risultati sperimentali. Per promuovere il principio di affinamento nel quadro del principio delle 3R e migliorare il benessere animale, questo protocollo descrive l'uso di un tunnel appositamente sviluppato per iniezioni e prelievi di sangue nei topi. Il tunnel fornisce un metodo di contenimento meno invasivo ma comunque sicuro rispetto alle tecniche convenzionali. Questo metodo di immobilizzazione orientato al benessere animale può essere facilmente implementato per procedure standard, come iniezioni intraperitoneali e intravenose e prelievi di sangue, riducendo al minimo lo stress e migliorando le condizioni di manipolazione dei topi da laboratorio.

Per valutare l'influenza della nuova tecnica di contenimento sul benessere del topo, il prelievo ematico dalla vena della coda e le iniezioni endovenose sono stati eseguiti secondo il protocollo descritto. Topi C57BL/6 wildtype maschi e femmine sono stati sottoposti alle procedure all'interno del tunnel applicativo o di un contenitore convenzionale e valutati per segni di dolore e stress. La scala del dolore facciale nei topi (MGS) è stata utilizzata per determinare il livello di stress dei topi dopo il prelievo ematico dalla vena della coda. L'MGS è un sistema di punteggio ampiamente utilizzato, che analizza l'espressione dei muscoli facciali come reazione a procedure dolorose o stressanti9,10. Per determinare i punteggi, sono state scattate immagini immediatamente dopo aver rilasciato i topi dal contenitore o dal tunnel (immagini rappresentative sono mostrate in Figura 2). Due osservatori esperti nella valutazione del comportamento dei topi hanno analizzato tre parametri dell'espressione facciale (illustrati negli schizzi schematici in Figura 2C): restringimento orbitale (chiusura della palpebra e restringimento dell'area orbitale; può essere visibile una ruga intorno all'occhio), rigonfiamento del naso (rigonfiamento sul dorso del naso e comparsa di rughe verticali ai lati del naso) e posizione delle orecchie (le orecchie ruotano all'esterno e/o all'indietro rispetto al viso e possono piegarsi assumendo una forma "appuntita"; lo spazio tra le orecchie aumenta). La posizione dei baffi e il rigonfiamento delle guance non sono stati valutati poiché il colore scuro del pelo dei topi rendeva difficile una valutazione affidabile. Ogni parametro è stato valutato utilizzando una scala a tre punti compresa tra 0 e 2 (0 = assente, 1 = moderatamente presente, 2 = chiaramente presente), e i tre parametri facciali sono stati mediati per ottenere un punteggio MGS medio per ogni animale. Per garantire l'affidabilità, ogni animale è stato valutato indipendentemente e in cieco da entrambi gli osservatori, e i due punteggi MGS sono stati successivamente mediati per generare un punteggio MGS finale per ciascun animale. Sia i topi femmine che i maschi hanno mostrato una riduzione significativa del punteggio MGS quando il prelievo ematico è stato effettuato nel tunnel applicativo rispetto al contenitore convenzionale (Figura 2A–B).
Un gruppo separato di topi è stato sottoposto a iniezione endovenosa di 100 µL di cloruro di sodio (NaCl) allo 0,9%, registrando la comparsa di vocalizzazioni udibili e i tentativi di girarsi nel dispositivo di contenimento. I topi emettono squittii udibili come segno di grave disagio, specialmente in presenza di dolore o paura e durante comportamenti difensivi11,12,13. Inoltre, i topi reagiscono naturalmente al contenimento fisico con panico, manifestando una risposta di fuga per uscire dallo spazio ristretto. Pertanto, i tentativi di girarsi di 180 gradi all'interno del dispositivo di contenimento sono stati considerati segni di paura. Sia nei topi femmina che maschio, si è osservata una maggiore frequenza di vocalizzazioni udibili e di tentativi di girarsi quando le iniezioni endovenose sono state effettuate all'interno del contenitore rispetto al tunnel di somministrazione (Figura 3).
<img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/72535/72535fig1v1.jpg" /> 
Figura 1: Tunnel per applicazioni innovativo. (A) Immagini rappresentative che illustrano la differenza di dimensioni tra un contenitore tradizionale e il tunnel per applicazioni innovativo. (B) L'interno del tunnel è foderato con un pezzo di Vetbed arrotolato su misura, che fornisce un ambiente morbido, di sostegno e scuro. Se i topi sono troppo piccoli e tendono a girarsi, la fodera arrotolata può essere stretta per ridurre lo spazio disponibile. (C) Diverse fasi di manipolazione all'interno del tunnel, inclusi l'ingresso e l'uscita, il fissaggio sicuro e confortevole, e l'accesso all'addome e alla coda. (D) Un cuneo aggiuntivo per eseguire iniezioni intraperitoneali all'interno del tunnel. Il cuneo aumenta l'angolo del tunnel rispetto all'operatore, facilitando un accesso più agevole alla regione addominale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72535/72535fig1largev1.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/72535/72535fig2v1.jpg" /> 
Figura 2: Scala del cipiglio del topo dopo il prelievo ematico dalla vena della coda. Topi maschi o femmine sono stati sottoposti a prelievo ematico all'interno di un tunnel di somministrazione oppure di un contenitore convenzionale. Le immagini per valutare la scala del cipiglio del topo sono state acquisite immediatamente dopo che gli animali sono usciti dal contenitore o dal tunnel e successivamente valutate in modo indipendente da due sperimentatori esperti, in cecità rispetto al gruppo di appartenenza dei topi, i quali hanno analizzato il restringimento orbitale, il rigonfiamento del naso e la posizione delle orecchie. Per ciascun animale è stato calcolato un punteggio medio basato sulle due valutazioni. (A) Topi femmine (tunnel n = 5; contenitore n = 8). (B) Topi maschi (tunnel n = 11; contenitore n = 11). Questo grafico è stato adattato da Schlutt et al., 2026, PLOS ONE. I dati originali, pubblicati come grafico a barre sotto licenza CC BY 4.0, sono stati modificati e riprodotti qui come grafico a scatola con baffi. (C) Illustrazione schematica delle unità di movimento facciale generate a partire da un prompt testuale sviluppato dagli autori utilizzando ChatGPT Image 2 (OpenAI; disponibile su <a href="https://chatgpt.com/" target="_blank">https://chatgpt.com/</a>); l'immagine finale è stata revisionata e approvata dagli autori per l'accuratezza scientifica. I dati sono rappresentati come grafici a scatola con baffi (minimo a massimo); la linea indica la media. Test di Mann-Whitney, valori di p &#60; 0,05 sono stati considerati significativi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72535/72535fig2largev1.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/72535/72535fig3v1.jpg" /> 
Figura 3: Vocalizzazioni udibili e tentativi di girarsi dopo iniezione endovenosa. Topi maschi o femmine sono stati sottoposti a iniezione endovenosa di 100 µL di NaCl 0,9% all'interno del tunnel di applicazione o di un contenitore convenzionale. Sono stati registrati durante la procedura gli episodi di vocalizzazione udibile e i tentativi di girarsi all'interno del dispositivo di contenimento (sì/no). Tutti i gruppi n = 10. I dati sono presentati come grafici a barre sovrapposte di contingenza. Il test esatto di Fisher, valori di p &#60; 0,05 sono stati considerati significativi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72535/72535fig3largev1.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
Figura supplementare 1: Iniezione intraperitoneale in ratti mediante una versione più grande del tunnel applicativo. Un tunnel applicativo con un diametro di 15 cm è stato utilizzato per l'iniezione intraperitoneale in ratti. La procedura è stata eseguita secondo lo stesso protocollo descritto per i topi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72535/Supplementary Figure 1.pdf" target="_blank">Cliccare qui per scaricare questo file.</a>

Questo protocollo descrive un nuovo metodo manuale di contenimento per immobilizzare i topi durante iniezioni o prelievi di sangue, riducendo così lo stress e migliorando il benessere durante le procedure.

Tecnica di contenimento manuale orientata al benessere per la somministrazione di sostanze e il campionamento ematico nei topi

La sperimentazione animale rimane essenziale nella ricerca biomedica, contribuendo significativamente alla comprensione dei meccanismi delle malattie e alla valutazione dell'efficacia e...

La nostra ricerca si concentra su metodi efficaci di immobilizzazione dei roditori per migliorare la sicurezza dell'animale e dell'operatore, riducendo al minimo lo stress durante le procedure biomediche. L'immobilizzazione tradizionale del topo può indurre stress e influenzare i risultati sperimentali. Questo protocollo offre un'immobilizzazione più sicura e meno stressante, mantenendo al contempo l'efficacia della procedura.Per iniziare, pulire il tunnel di applicazione con etanolo al 70% e lasciarlo evaporare completamente per circa cinque minuti. Posizionare un pezzo arrotolato di rivestimento lavato e autoclavato all'interno del tunnel di applicazione. Utilizzando le dita, comprimere delicatamente il rivestimento all'ingresso del tunnel fino a quando l'apertura rimanente ha una larghezza approssimativamente pari a quella di due dita adiacenti. Successivamente, posizionare il tunnel di applicazione sulla superficie di lavoro e collocare un ulteriore pezzo di rivestimento piatto davanti all'ingresso del tunnel. Preparare la siringa per iniezione munita di un ago da 27 gauge contenente la soluzione desiderata per l'iniezione e posizionarla accanto al tunnel di applicazione. Assicurarsi che siano prontamente disponibili garze e spray disinfettante.Per trasferire il topo dalla gabbia di mantenimento, posizionare il tubo di manipolazione davanti al tunnel di applicazione, consentendo al topo di entrare nel tunnel volontariamente. Una volta all'interno, lasciare che il topo rimanga posizionato all'interno della fodera arrotolata senza girarsi.Raddrizzare delicatamente la coda del topo tenendo la punta e disinfettare il sito previsto per l'iniezione. Ruotare la coda di circa 90 gradi per posizionare le vene laterali della coda in posizione dorsale. Iniziare l'iniezione all'estremità distale della coda, inserendo l'ago con un angolo compreso tra 15 e 20 gradi, quasi parallelo alla coda, per preservare i siti prossimali per eventuali tentativi successivi. Inserire l'ago solo leggermente al di là del bisellino. Iniettare il volume desiderato a un ritmo lento e costante non superiore a 5 millilitri per chilogrammo in 13 secondi. Quindi estrarre l'ago ed esercitare una leggera pressione sul sito di iniezione con un batuffolo sterile per prevenire il sanguinamento.Riportare il tunnel di applicazione contenente il topo nella gabbia di casa e permettere al topo di uscire volontariamente dall'estremità opposta del tunnel. Offrire premi nella gabbia di casa per favorire il rinforzo positivo e l'abituazione alla procedura.Rimuovere il rivestimento interno dal tunnel di applicazione e pulire il tunnel con etanolo al 70%. Riutilizzare il rivestimento se è pulito, altrimenti lavarlo e autoclavarlo prima del riutilizzo.Dopo aver preparato il tunnel di applicazione, posizionarlo sulla cima del cuneo sulla superficie di lavoro e inserire un rivestimento piatto aggiuntivo davanti all'ingresso del tunnel. Consentire al topo di entrare nel tunnel di applicazione come dimostrato in precedenza. Tenere la base della coda del topo tra il pollice e l'indice di una mano. Applicare una leggera pressione sulla zona sacrale utilizzando il dito medio della stessa mano e sollevare leggermente la coda verso l'alto. Stabilizzare il topo per garantire un accesso chiaro alla regione addominale caudale. Eseguire l'iniezione tenendo la siringa parallela alla superficie di lavoro e inserendo l'ago nella regione addominale caudale ben visibile. Dopo l'iniezione, rilasciare delicatamente la pressione e la coda, quindi permettere al topo di uscire dal tunnel e pulire il tunnel di applicazione come dimostrato in precedenza.Dopo la preparazione del tunnel e l'ingresso volontario del topo nel tunnel applicativo, stendere delicatamente la coda del topo tenendo la punta e disinfettare il sito di campionamento previsto. Ruotare la coda di circa 90 gradi per posizionare le vene laterali della coda in posizione dorsale. Pungere la vena laterale della coda utilizzando una lancetta e raccogliere le gocce di sangue con una microprovetta o un capillare. Successivamente, applicare una leggera pressione sul sito di puntura con un tampone sterile per controllare l'emorragia, seguita da rinforzo positivo e pulizia del tunnel, come precedentemente dimostrato.Sia i topi femmina che quelli maschi hanno mostrato una riduzione significativa del punteggio della scala grimatica murina quando il prelievo di sangue è stato eseguito nel tunnel di applicazione rispetto al contenitore convenzionale. In entrambi i topi femmina e maschi, si è osservata una minore frequenza di vocalizzazioni udibili e di tentativi di girarsi quando le iniezioni endovenose sono state effettuate all'interno del tunnel di applicazione, rispetto a un contenitore convenzionale.Il nostro innovativo tunnel per applicazioni consente un contenimento del topo a basso stress e sicuro durante iniezioni di routine e prelievi ematici, migliorando al contempo la manipolazione e il benessere animale. Un aspetto fondamentale è che questo metodo è limitato agli animali coscienti e permette l'accesso soltanto alla coda e alla parte inferiore dell'addome. Studi futuri potranno adattare questa tecnica ai ratti ed esplorarne l'efficacia in diverse procedure biomediche, modelli animali e applicazioni di ricerca.

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L'articolo descrive un protocollo rapido per gonadectomizzare e campionare il sangue dal piccolo pesce teleosteo, usando il medaka giapponese (Oryzias latipes) come modello, per studiare il ruolo degli steroidi sessuali nella fisiologia animale.

Gonadectomia e procedure di prelievo del sangue nel modello teleosteo di piccole dimensioni Giapponese Medaka (Oryzias latipes)

Il presente protocollo descrive una tecnica modificata e semplificata con una procedura di costrizione aortica trasversale mini-invasiva (TAC) utilizzando un divaricatore autocostruito. Questa procedura può essere condotta senza un ventilatore o un microscopio e introduce un sovraccarico di pressione, portando infine a ipertrofia cardiaca o insufficienza cardiaca.

Una tecnica modificata per la costrizione aortica trasversale nei topi

Impara una tecnica di contenimento manuale orientata al benessere per somministrare sostanze e prelevare campioni ematici nei topi. Questo metodo riduce lo stress acuto rispetto alle tecniche tradizionali, migliorando il benessere animale e l'affidabilità dei risultati sperimentali.

Tecnica di contenimento manuale orientata al benessere per la somministrazione di sostanze e il campionamento ematico nei topi

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