Name: Misurazione della riparazione delle rotture a doppio filamento del DNA mediante il saggio DR-white in Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-08-14T15:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Scopri il saggio DR-white per misurare la riparazione delle rotture a doppio filamento del DNA in Drosophila melanogaster. Questo metodo distingue tra ricombinazione omologa, NHEJ e SSA in organismi multicellulari.

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Questo metodo è stato sviluppato mentre J.R.L. era titolare di una borsa di ricerca AFAR della American Federation for Aging Research.&#160;Questo lavoro è stato inoltre sostenuto dal National Institute of General Medical Sciences (1R15GM110454 e 1R15GM129628) assegnato a J.R.L. Le figure sono state realizzate con l'assistenza di BioRender (https://BioRender.com/b8sbcjp) 2026.

1. Saggio DR-white
<ol>
	<li>Cross genetici (Figura 3A) 
	NOTA: Per protocolli standard di coltura e genetica di Drosophila, consultare &#34;Fly pushing: The theory and practice of Drosophila genetics&#34; di Ralph J. Greenspan17. Le informazioni sul genotipo delle linee sono riportate nella Tabella dei materiali.
	<ol>
		<li>Mantenere le mosche a 25 °C con cicli luce/buio di 12 h su alimento standard per Drosophila, cospargendo lievito attivo.</li>
		<li>Impostare cinque provette per shock termico incrociando 8–10 femmine vergini DR-white con 3–5 maschi portatori di un transgene I-SceI (Incrocio 1, Figura 3A) per provetta. 
		NOTA: Possono essere utilizzati diversi transgeni I-SceI a seconda dell'applicazione. In questo protocollo, è stato utilizzato il transgene hsp70-I-SceI per l'induzione mediante shock termico11. Per evitare un'espressione "perdita" di I-SceI nelle generazioni precedenti, è fondamentale assicurarsi che i transgeni DR-white e I-SceI siano combinati nella stessa mosca solo in questa generazione.</li>
		<li>Nello stesso giorno, impostare bottiglie di espansione di una linea y w. Queste saranno le mosche test. Tre bottiglie di espansione sono sufficienti per circa 60–80 incroci test.</li>
		<li>Coltivare le provette per shock termico e le bottiglie di espansione y w a 25 °C per 3 giorni.</li>
		<li>Il terzo giorno, trasferire le provette per shock termico e le bottiglie di espansione y w su alimento fresco per costituire un set di riserva.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Shock termico/induzione di DSB 
	NOTA: Se non si utilizza un transgene I-SceI inducibile mediante shock termico, passare al passaggio 1.2.5, che di solito viene eseguito 3 giorni dopo il passaggio 1.1.5.
	<ol>
		<li>Lasciare invecchiare le provette per shock termico per 3 h a 25 °C per assicurare che tutte le prole abbiano superato la transizione materno- zigotica.</li>
		<li>Sottoporre le provette originali a shock termico in un bagno d'acqua a 38 °C per 1 h. Assicurarsi che il livello dell'acqua sia almeno all'altezza della base della palla di cotone in modo che le larve non possano arrampicarsi sopra il livello dell'acqua.</li>
		<li>Monitorare la temperatura del bagno d'acqua ogni 15 min e mantenerla entro 38 ± 0,5 °C poiché gli esiti di induzione e riparazione dipendono dalla durata e dalla temperatura dello shock termico.</li>
		<li>Riportare le provette a 25 °C.</li>
		<li>Il giorno successivo, aggiungere 1/3 di un tovagliolo da laboratorio piegato nell'alimento per assorbire l'eccesso di umidità. Se l'alimento è secco, aggiungere circa 100 µL di acqua al tovagliolo da laboratorio. Aggiungere una palla di cotone alle bottiglie di espansione y w.</li>
		<li>Coltivare le provette sottoposte a shock termico per ulteriori 6 giorni a 25 °C, o fino a quando le mosche iniziano a schiudersi.</li>
		<li>Eliminare le provette di riserva e le bottiglie di espansione 3 giorni dopo il trasferimento. Aggiungere una palla di cotone alle bottiglie di espansione y w di riserva circa 4 giorni dopo l'eliminazione. 
		NOTA: Se necessario, le provette di riserva possono essere sottoposte a shock termico come descritto ai passaggi 1.2.1–1.2.6 ed elaborate come indicato di seguito.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Incroci test
	<ol>
		<li>Raccogliere mosche sottoposte a shock termico portatrici dei transgeni DR-white e I-SceI per 4–5 giorni dopo l'inizio della schiusa per ridurre il bias legato allo stadio di sviluppo. 
		NOTA: Le mosche correttamente sottoposte a shock termico portatrici dei transgeni DR-white e I-SceI presentano occhi a mosaico a causa di eventi di riparazione embrionali e larvali che si sono sviluppati nei tessuti adulti. L'estensione del mosaico non è sempre correlata agli eventi di riparazione nella linea germinale e pertanto non deve essere un fattore determinante nella selezione delle mosche sperimentali per gli incroci test (passaggio 1.3.3).</li>
		<li>Raccogliere femmine vergini y w per 5 giorni. Raccogliere 5 femmine vergini per ogni numero previsto di campioni. Raccogliere dalle bottiglie di espansione di riserva non appena iniziano a schiudersi.</li>
		<li>Impostare le provette test incrociando un maschio sottoposto a shock termico con 4–5 femmine vergini y w (Incrocio 2; Figura 3A). Selezionare i maschi casualmente dal campione raccolto al passaggio 1.3.1 per ridurre il bias legato allo stadio di sviluppo. Coltivare gli incroci test a 25 °C. 
		NOTA: Per evitare il crossing over tra DR-white e I-SceI, si analizzano comunemente le linee germinali maschili; tuttavia, possono essere analizzate anche le prole femminili. Se si analizzano le prole femminili, le provette test dell'Incrocio 2 vengono impostate in un rapporto 2 femmine:5 y w maschi e coltivate per 5–6 giorni (passaggio successivo) per assicurare produttività.</li>
		<li>Verificare la produttività 4 giorni dopo l'allestimento delle provette test per valutare quando devono essere eliminate. 
		NOTA: Verificare che siano state deposte abbastanza uova per garantire almeno 20 prole analizzabili, ma evitare che le colture si sovrappongano, altrimenti le mosche potrebbero rimanere impigliate nell'alimento.</li>
		<li>Quando le provette test sono pronte (entro 4–5 giorni dopo l'instaurazione degli incroci test), eliminare le mosche e aggiungere 1/3 di un tovagliolo da laboratorio piegato nell'alimento per assorbire l'eccesso di umidità. 
		NOTA: I maschi possono essere raccolti in questo momento se sono richieste ulteriori analisi (ad esempio, genotipizzazione molecolare).</li>
		<li>Coltivare le provette test per ulteriori 5–6 giorni a 25 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analisi fenotipica 
	NOTA: Per ogni condizione di ciascun esperimento genetico (ad esempio, mutanti omozigoti e controlli eterozigoti) vengono impostate circa 25 provette test. Ogni esperimento genetico viene ripetuto 2–3 volte e i dati delle singole provette vengono raggruppati.
	<ol>
		<li>Analizzare la prole dell'Incrocio 2 (Figura 3A) per circa 9 giorni dopo che le prime mosche iniziano a schiudersi.</li>
		<li>Anestetizzare le mosche utilizzando CO2 oppure trasferendole in una provetta vuota senza alimento e congelandole a -20 °C per almeno 30 min. 
		NOTA: Se le mosche vengono congelate, possono essere analizzate anche alcuni giorni dopo.</li>
		<li>Posizionare le mosche su un tappetino per mosche e analizzarle per i fenotipi appropriati (Figura 3A). Includere solo le provette con almeno 20 mosche analizzate nel set di dati.
		<ol>
			<li>Per l'analisi, innanzitutto selezionare le mosche portatrici del cassetto DR-white (utilizzando la fluorescenza positiva per la proteina fluorescente rossa [RFP+] come marcatore), quindi valutare il colore degli occhi e del corpo.</li>
			<li>Il transgene y+ legato al cassetto DR-white determina un colore del corpo marrone intermedio che non è completamente selvatico. Per distinguere tra No DSB/NHEJ (corpo marrone;&#160;y+&#160;w-) e SSA (corpo giallo;&#160;y-&#160;w-), confrontare le mosche con la prole y w che non possiede il cromosoma DR-white (RFP-). Gli eventi SSA avranno lo stesso colore giallo di queste mosche. Classificare come No DSB/NHEJ le mosche più scure (più marroni) rispetto a queste. 
			NOTA: Deviazioni dai fenotipi descritti nella Figura 3A&#160; potrebbero indicare contaminazione, e la provetta non deve essere analizzata. Sebbene si possano analizzare mosche morte intere, quelle danneggiate devono essere scartate se i fenotipi non possono essere determinati.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Analisi TIDE (Figura 4)
<ol>
	<li>Estrazione del DNA genomico (gDNA)18
	<ol>
		<li>Raccogliere moscerini (o larve) sottoposti a shock termico che portano entrambi i transgeni DR-white e I-SceI, come progenie dell'Incrocio 1 (Figura 3A).</li>
		<li>Posizionare un singolo moscerino in una provetta microcentrifuga da 1,5 mL e congelare rapidamente (ad esempio, in un bagno di ghiaccio secco/etanolo o azoto liquido). 
		ATTENZIONE: Manipolare il ghiaccio secco, l'azoto liquido, l'etanolo, l'isopropanolo e altri prodotti chimici utilizzando dispositivi di protezione individuale adeguati e seguendo le procedure di sicurezza istituzionali. 
		PUNTO DI PAUSA:&#160; I campioni possono essere conservati a -80 °C e processati in un secondo momento se necessario. Se si analizzano moscerini o larve, utilizzare un singolo moscerino o una singola larva per campione. Se si analizzano tessuti più piccoli (ad esempio, cervelli, dischi immaginali), raggruppare i campioni per aumentare il rendimento di DNA.</li>
		<li>Omogeneizzare ciascun campione in 50 µL di Buffer A (100 mM Tris-Cl, pH 7,5; 100 mM etilendiamminotetraacetico [EDTA]; 100 mM cloruro di sodio; 0,5% sodio dodecilsolfato [SDS]) utilizzando un omogeneizzatore elettrico.</li>
		<li>Incubare i campioni in bagno termico a 65 °C per 30 minuti.</li>
		<li>Aggiungere 100 µL di Buffer B (1,4 M acetato di potassio, 4,3 M cloruro di litio) a ciascun campione e mescolare brevemente capovolgendo le provette. 
		NOTA: Se si utilizzano moscerini interi, potrebbero essere necessari volumi maggiori per omogeneizzare completamente i campioni. In tal caso, mantenere un rapporto volumetrico di 1:2 tra Buffer A e Buffer B.</li>
		<li>Incubare i campioni sul ghiaccio per almeno 30 minuti.</li>
		<li>Centrifugare i campioni a circa 16.000 x g per 15 minuti a 4 °C.</li>
		<li>Trasferire 125 µL del sopranatante chiarificato in nuove provette microcentrifuga da 1,5 mL. Evitare qualsiasi precipitato.</li>
		<li>Aggiungere 100 µL di isopropanolo al 100% a temperatura ambiente per ogni 125 µL di sopranatante e mescolare brevemente capovolgendo le provette.</li>
		<li>Centrifugare i campioni a circa 16.000 x g per 10 minuti a temperatura ambiente.</li>
		<li>Aspirare il sopranatante, avendo cura di non disturbare il pellet di DNA. 
		NOTA: Il pellet di DNA potrebbe non essere visibile a questo stadio. Annotare l'orientamento delle provette durante il caricamento nella microcentrifuga e aspirare dalla faccia opposta rispetto a dove ci si aspetta che si formi il pellet.</li>
		<li>Lavare i pellet con 250 µL di etanolo al 70% freddo, quindi mescolare brevemente capovolgendo delicatamente le provette.</li>
		<li>Centrifugare i campioni a circa 16.000 x g per 5 minuti a 4 °C.</li>
		<li>Aspirare il sopranatante, avendo cura di non disturbare il pellet. 
		NOTA: Il pellet potrebbe risultare più visibile dopo il lavaggio con etanolo. In caso contrario, consultare la Nota del Passaggio 2.1.11.</li>
		<li>Lasciare le provette scoperte a temperatura ambiente per far evaporare l'eventuale etanolo residuo. Evitare un'essiccazione eccessiva del pellet, altrimenti potrebbe non ricostituirsi completamente.</li>
		<li>Aggiungere 20 µL di acqua priva di nucleasi e lasciare i pellet in ricostituzione per tutta la notte a 4 °C. 
		PUNTO DI PAUSA: Se il pellet di DNA non si è completamente disciolto, è possibile aggiungere ulteriore acqua.</li>
		<li>Il giorno successivo, capovolgere delicatamente le provette e misurare la concentrazione di DNA. Conservare i campioni a -20 °C se non si procede immediatamente all'analisi. 
		NOTA: Per l'estrazione da un singolo moscerino, i rendimenti sono tipicamente di circa 100 ng/µL. È fondamentale ottenere campioni di alta qualità. Il rapporto di assorbanza A260/A280 dovrebbe essere compreso tra 1,7 e 2,0. Valori al di fuori di questo intervallo indicano la presenza di contaminanti come proteine. Il rapporto A260/A230 dovrebbe essere compreso tra 2,0 e 2,2. Valori al di fuori di questo intervallo indicano contaminanti come etanolo e sali del buffer. Campioni con rendimenti bassi o scarsa qualità possono portare a un'ampia cattiva amplificazione PCR.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Reazione a catena della polimerasi (PCR)
	<ol>
		<li>Amplificare la regione Sce.white mediante PCR utilizzando 100 ng di gDNA e i primer DR-white_8f (5’-GTGGATCAGGTGATCCAGG) e DR-white_8a (5’-CTTAAGCCATCGTCAGTTGC), seguendo le istruzioni del produttore. Includere un campione di controllo di moscerino DR-white (ovvero, ceppo parentale DR-white, senza presenza del transgene I-SceI). Utilizzare le seguenti condizioni di termociclaggio: 94 °C per 3 min; {94 °C per 30 s; touchdown a 66 °C (-0,5 °C/ciclo) per 30 s; 72 °C per 30 s} x 16 cicli; {94 °C per 30 s; 58 °C per 30 s; 72 °C per 30 s} x 20 cicli; 72 °C per 5 min; mantenere a 12 °C. 
		NOTA: Se si utilizza un reagente diverso, potrebbe essere necessario adattare le condizioni di termociclaggio.</li>
		<li>Caricare circa 2 µL del prodotto PCR su un gel diagnostico in agarosio al 1% in tampone tris-acetato-EDTA (TAE) per confermare l'amplificazione di Sce.white. La dimensione attesa dell'amplicone è di circa 1,7 kb.</li>
		<li>Purificare gli ampliconi Sce.white mediante PCR e misurare la concentrazione di DNA.</li>
		<li>Sequenziare il prodotto PCR purificato utilizzando il primer DR-white_9f (5’-GAGCCCACCTCCGGACTGGAC). 
		NOTA: Di norma sequenziamo 40 ng di prodotto PCR purificato, ma questa quantità potrebbe variare in base alle istruzioni del servizio di sequenziamento.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analisi TIDE 
	NOTA: La maggior parte degli errori derivanti dall'uso dello script R TIDE è dovuta a un formato del codice non corretto.
	<ol>
		<li>Scaricare i pacchetti R richiesti (ovvero, sangerseqR e Biostrings) da Bioconductor.org. Utilizzare la barra di ricerca per individuare l'ultima versione di ciascun pacchetto.</li>
		<li>Analizzare i cromatogrammi di sequenza per assicurarsi che siano di buona qualità. Analizzare solo cromatogrammi con poco o nessun rumore di fondo prima del sito di rottura.</li>
		<li>Scaricare i file di traccia di sequenza (con estensione .ab1) e inserire tutti i file di traccia in una singola cartella del computer. Semplificare il più possibile i nomi dei file di sequenza (ad esempio, F1, Het2, Hom3) per facilitare le modifiche allo script nei passaggi successivi.</li>
		<li>Aprire lo script R TIDE (File Supplementare 1) nell'ambiente di sviluppo integrato RStudio (IDE; vedere la Tabella dei Materiali). Nel riquadro Source, individuare la riga che inizia con Control &#60;- (File Supplementare 2A) e inserire esattamente il nome del file della sequenza di controllo così come salvato, compresa l'estensione .ab1, tra virgolette. 
		NOTA: La “sequenza di controllo” è la sequenza ottenuta dalla PCR del ceppo parentale DR-white senza transgene I-SceI o induzione.</li>
		<li>Trovare la riga che inizia con samplename &#60;- c( e inserire ciascun nome di file della sequenza tra parentesi (File Supplementare 2A). Includere l'estensione .ab1, inserire ciascun nome di file tra virgolette separate e separare i nomi con virgole.</li>
		<li>Salvare il file dello script R TIDE modificato nella stessa cartella dei file di sequenza da analizzare. Mantenere il nome del file semplice per evitare errori nei passaggi successivi.</li>
		<li>Nell'IDE, navigare fino alla cartella TIDE utilizzando la scheda File nel riquadro Output (File Supplementare 2B).</li>
		<li>Fare clic sul menu a discesa Altro e selezionare Apri Nuovo Terminale Qui (File Supplementare 2C). Un nuovo terminale si aprirà nel riquadro Console (in basso a sinistra).</li>
		<li>Nel terminale appena aperto, digitare “R” e premere Invio (File Supplementare 2D).</li>
		<li>Una volta avviato R nel terminale, eseguire lo script R TIDE digitando source(&#34;TIDE_analysis.R&#34;) e premere Invio (File Supplementare 2E). Il terminale eseguirà lo script e produrrà una rappresentazione grafica (File Supplementare 2F) e un file .csv contenente i dati grezzi per ciascun campione (File Supplementare 2G e File Supplementare 3). I file di output vengono salvati nella stessa cartella dello script R e dei file di sequenza. 
		NOTA: Se lo stesso script R viene eseguito nuovamente, eventuali nuovi file .csv generati sovrascriveranno quelli precedenti. Se si eseguono più analisi sugli stessi file, creare una copia della cartella.</li>
		<li>Analizzare i dati aprendo ciascun file .csv.
		<ol>
			<li>Interpretare i dati grezzi come proporzioni di indel nella sequenza del campione. La conversione genica per ricombinazione omologa dalla sequenza di riconoscimento I-SceI alla sequenza wild-type SacI produce la delezione canonica di 23 pb; lo script riporta questo valore HR su una riga separata in fondo all'output (File Supplementare 2G). Il valore 0-indel rappresenta l'assenza di DSB o NHEJ senza indel. Sommare tutti gli altri valori di indel per ottenere NHEJ con elaborazione. La somma di NHEJ con elaborazione e HR rappresenta il numero totale di eventi di riparazione di DSB rilevabili.</li>
			<li>Calcolare le proporzioni delle vie di riparazione tra gli eventi di riparazione di DSB rilevabili utilizzando le seguenti equazioni: 
			Proporzione di NHEJ con elaborazione = (NHEJ con elaborazione) / (NHEJ con elaborazione + HR) 
			Proporzione di HR = (HR) / (NHEJ con elaborazione + HR) 
			NOTA: Per ogni condizione di ciascun esperimento genetico (ad esempio, mutanti omozigoti e controlli eterozigoti) vengono utilizzati circa 10–15 campioni. Ogni esperimento genetico viene ripetuto 2–3 volte e i dati individuali vengono raggruppati.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interessi finanziari o non finanziari da dichiarare.

La versatilità del sistema DR-white è un fattore fondamentale che contribuisce al suo impatto passato e futuro nel campo della riparazione del DNA. In primo luogo, la sequenza di integrazione attB all'interno del costrutto reporter DR-white consente ai ricercatori di indirizzare il reporter in numerose posizioni all'interno del genoma di Drosophila21, con diverse linee già disponibili22. In secondo luogo, la disponibilità di diversi transgeni I-SceI, come l'espressione indotta dallo shock termico tramite il promotore hsp70 (questo studio), l'espressione costitutiva tramite il promotore ubiquitin23 e l'espressione germinale premiotica tramite il promotore Bam24, offre numerosi contesti sviluppati e specifici per tessuto per esplorare la riparazione delle DSB. Indipendentemente dal transgene I-SceI&#160;utilizzato, gli incroci genetici devono essere pianificati attentamente per assicurare che il transgene I-SceI venga introdotto soltanto nell'incrocio finale, al fine di garantire un'induzione corretta delle DSB. È importante notare che le frequenze di riparazione possono variare notevolmente a seconda della posizione genomica del DR-white e/o del transgene I-SceI&#160;utilizzato. Esperimenti futuri potrebbero ulteriormente confrontare le posizioni genomiche e i transgeni I-SceI per determinare se sia il contesto genico o la specificità tissutale a guidare la riparazione delle DSB.
Un vantaggio particolare del saggio DR-white e dei suoi derivati è che possono identificare la riparazione delle DSB tramite ricombinazione omologa, NHEJ con elaborazione e, nella maggior parte dei casi, SSA. Sebbene progettato per rilevare fenotipicamente eventi di riparazione nella linea germinale, il sistema consente anche l'analisi di tessuti somatici mediante l'analisi algoritmica TIDE. Nonostante questi vantaggi, esistono alcune limitazioni di questo saggio che devono essere considerate. In particolare, il saggio DR-white potrebbe sottostimare le frequenze di HR. Come in altri saggi con reporter genetici che utilizzano DSB indotte da nucleasi, la riparazione tramite HR da un cromatidio sorella (HR intersorella) è indistinguibile da un evento senza DSB o da NHEJ senza elaborazione. Pertanto, almeno alcuni eventi della classe Nessuna DSB/NHEJ potrebbero in realtà essere eventi di HR. Considerando questa limitazione, i risultati che confrontano fattori genetici (come linee mutanti) devono essere interpretati con cautela. Altre limitazioni del saggio includono l'impossibilità di quantificare eventi premiotici che non hanno prodotto prole vitale. Ad esempio, eventi di DSB che potrebbero non essere stati riparati e che hanno portato alla morte cellulare non verranno rilevati nella prole. Sebbene la fertilità complessiva possa rappresentare una misura qualitativa della morte cellulare nella linea germinale, potrebbero essere necessari saggi cellulari (come il TUNEL). Inoltre, l'analisi con lo script R TIDE fornisce soltanto la proporzione di eventi rilevabili in una popolazione cellulare. Per determinare gli esiti specifici delle sequenze di indel, è necessario il sequenziamento di singoli eventi di riparazione mediante sequenziamento multiplex del DNA.
Il saggio DR-white ha già avuto un impatto profondo nello studio della riparazione delle rotture a doppio filamento (DSB). La sua applicazione ha identificato fattori che contribuiscono alla riparazione delle DSB in organismi multicellulari, tra cui l'età25, il sesso26, la posizione della DSB22,26, la posizione della sequenza donatrice15, il ciclo cellulare e il tipo di tessuto26. Inoltre, abbiamo utilizzato questo saggio per identificare diverse proteine che influenzano la scelta della via di riparazione e/o la riparazione di sequenze divergenti in Drosophila, tra cui Msh627, Blm28, Rif116 e CtIP16,29. In effetti, l'ampio utilizzo di Drosophila come organismo modello genetico, dotato di proteine di riparazione del DNA conservate, fornisce un sistema semplice e multicellulare per indagare i fattori genetici, cellulari e organizzativi che contribuiscono alla riparazione delle DSB in contesti biologici complessi.

L'integrità genomica è frequentemente messa a rischio da lesioni del DNA, tra cui le rotture a doppio filamento (DSB) sono particolarmente tossiche. Se non riparate, queste rotture possono portare a perdita genetica, riarrangiamenti cromosomici e morte cellulare1. Le cellule hanno quindi sviluppato diversi percorsi per riparare le DSB. La ricongiunzione non omologa dei capi (NHEJ) lega direttamente i due estremi della DSB, potenzialmente introducendo indel nel sito di rottura; l'appaiamento a singolo filamento&#160;(SSA) sfrutta sequenze complementari adiacenti al sito di rottura per la riparazione, causando delezioni nel sito di rottura; mentre la ricombinazione omologa (HR) utilizza una sequenza omologa come stampo per la riparazione2,3.
Storicamente, gli studi sulla riparazione delle rotture a doppio filamento (DSB) si sono limitati a saggi biochimici4 o a sistemi monocellulari, come batteri5,6, lieviti7,8 e colture cellulari di mammiferi9,10. Sebbene questi modelli siano stati fondamentali per identificare le proteine chiave della riparazione e i loro meccanismi, mancano della complessità biologica di un organismo multicellulare. Drosophila melanogaster si è affermata come un modello multicellulare popolare per lo studio della riparazione del DNA. Tuttavia, molti saggi attuali sono specifici per determinate vie di riparazione11; si basano su ampie aberrazioni cromosomiche, come l’eccisione dell’elemento P12; oppure richiedono analisi molecolari lunghe e laboriose13. Il saggio DR-white affronta queste difficoltà fornendo un semplice reporter genetico della riparazione del DNA in Drosophila14. Questo studio presenta un flusso di lavoro completo, pratico e dettagliato, passo dopo passo, per eseguire saggi genetici e molecolari volti a misurare la riparazione delle DSB del DNA utilizzando il ben consolidato saggio DR-white.
Il saggio utilizza due ripetizioni dirette del gene Drosophila white (w), che conferisce il colore rosso selvatico degli occhi (Figura 1). Entrambe le copie sono non funzionali: la prima, Sce.white, contiene un'inserzione che porta la sequenza di riconoscimento della meganucleasi I-SceI in un sito SacI di tipo selvatico e introduce un codone di stop prematuro; la seconda, iwhite, è troncata sia all'estremità 5’ che a quella 3’ e funge da stampo per la riparazione mediante ricombinazione omologa (HR). Un transgene Drosophila yellow (y+), che conferisce il colore bruno selvatico del corpo, è presente tra le due ripetizioni di white. Poiché la cassetta DR-white è integrata in un ceppo mutante y w, le mosche DR-white presentano fenotipicamente corpo di colore bruno selvatico e occhi bianchi mutanti.
I DSB possono essere indotti in Sce.white incrociando moscerini DR-white con moscerini portatori di un transgene I-SceI. La riparazione dei DSB nella linea germinale premeiotica può essere misurata analizzando la progenie di un incrocio test. La riparazione mediante NHEJ produce il fenotipo parentale con corpo marrone e occhi bianchi (Figura 1A), mentre la riparazione mediante HR ripristina la sequenza selvatica di white, generando progenie con corpo marrone e occhi rossi (Figura 1B). La riparazione del DSB mediante SSA o un ricombinazione mitotica determina la perdita del transgene yellow interposto, producendo moscerini con corpo giallo e occhi bianchi (Figura 1C). Per analizzare gli esiti di riparazione nelle cellule somatiche, abbiamo adattato l'algoritmo Tracking Indels by DEcomposition (TIDE) per rilevare specificamente la riparazione mediante NHEJ con elaborazione e mediante HR nel saggio DR-white15,16.
Il saggio DR-white offre diversi vantaggi rispetto ai saggi di riparazione del DNA precedentemente stabiliti in Drosophila. Poiché le rotture vengono generate e riparate nella linea germinale, gli esiti della riparazione possono essere facilmente rilevati mediante analisi fenotipica. Allo stesso tempo, il saggio è estremamente versatile. Sebbene sia progettato principalmente per misurare la riparazione mediante ricombinazione omologa (HR), può rilevare tutte e tre le vie di riparazione. Abbiamo inoltre sviluppato due ulteriori modelli di riparazione funzionali (Figura 2). Il modello iwhite.mu contiene 28 polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) silenziosi e produce anche prole con occhi rossi (Figura 2A), facilitando lo studio della lunghezza dei tratti di conversione genica (GCT) e della riparazione HR tra sequenze divergenti14.&#160; Il modello iwhiteΔ9 presenta una delezione di nove paia di basi nel sito SacI di tipo selvaggio e dà origine a prole con occhi arancioni (Figura 2B). Questa caratteristica consente ai ricercatori di tracciare la riparazione HR a partire da modelli distinti, una peculiarità unica del saggio DR-white15.

<table><tbody><tr><td>Pestelli da 0,5 mL privi di RNAse/DNAse</td><td>Fisher Scientific</td><td>12141363</td><td>Per l'omogeneizzazione dei campioni per l'estrazione di DNA genomico</td></tr><tr><td>Palline di cotone</td><td>Genesee Scientific</td><td>51-101</td><td>Per la coltura standard di Drosophila</td></tr><tr><td>Incubatore refrigerato con Peltier per Drosophila</td><td>Shel Lab</td><td>SRI6PF</td><td>Per la coltura standard di Drosophila</td></tr><tr><td>Stirpe di Drosophila: y[1] w[1]</td><td>Bloomington Drosophila&amp;nbsp; Stock Center</td><td>RRID:BDSC 1495</td><td></td></tr><tr><td>Stirpe di Drosophila: y[2] w[&amp;Delta;] cho[2] v[1] ; P{70I-SceI}2B Sco / CyO, P{GFP, w+}&amp;nbsp;</td><td>LaRocque Lab</td><td>N/A</td><td>Creata dal LaRocque lab mediante ricombinazione standard della stirpe RRID:BDSC_6934 (y[1] w[*]; P{ry[+t7.2]=70FLP}11 P{v[+t1.8]=70I-SceI}2B sna[Sco]/CyO, S[2]) del Bloomington Drosophila Stock Center; disponibile su richiesta all'autore corrispondente</td></tr><tr><td>Stirpe di Drosophila: y[2] w[&amp;Delta;] cho[2] v[1] ; DR-white (y+).3 51C,RFP+ / [CyO-GFP]</td><td>LaRocque Lab</td><td>N/A</td><td>Saggio DR-white integrato nella stirpe RRID:BDSC_24482 (y[1] M{RFP[3xP3.PB] GFP[E.3xP3]=vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP&amp;rsquo;}ZH-51C); disponibile su richiesta all'autore corrispondente</td></tr><tr><td>Stirpe di Drosophila: y[2] w[&amp;Delta;] cho[2] v[1] ; DR-white.mu (y+).3 51C,RFP+ / [CyO-GFP]</td><td>LaRocque Lab</td><td>N/A</td><td>Saggio DR-white.mu integrato nella stirpe RRID:BDSC_24482 (y[1] M{RFP[3xP3.PB] GFP[E.3xP3]=vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP&amp;rsquo;}ZH-51C); disponibile su richiesta all'autore corrispondente</td></tr><tr><td>Stirpe di Drosophila: y[1] w[*]; iwhite2 (y+).1 51C,RFP+ / [CyO]</td><td>LaRocque Lab</td><td>N/A</td><td>Donatore iwhite&amp;Delta;9 integrato nella stirpe RRID:BDSC_24482 (y[1] M{RFP[3xP3.PB] GFP[E.3xP3]=vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP&amp;rsquo;}ZH-51C); disponibile su richiesta all'autore corrispondente</td></tr><tr><td>Chiusure per bottiglie per Drosophila Flugs</td><td>Genesee Scientific</td><td>49-100</td><td>Per la coltura standard di Drosophila</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio fluorescente (RFP)</td><td>TriTech Research</td><td>SMT1-FL</td><td>Per il trasferimento e il selezionamento standard di Drosophila &quot;fly pushing&quot; in base alla fluorescenza</td></tr><tr><td>Tappetino FlyStuff per Drosophila</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-172</td><td>Per il trasferimento standard di Drosophila &quot;fly pushing&quot;</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clarke</td><td>06-666A</td><td></td></tr><tr><td>Bagno termostatato MyBath 4L</td><td>Midwest Scientific</td><td>MB-2000-4</td><td>Per lo shock termico&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>NanoDrop One</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-400-518LY</td><td>Per la quantificazione del DNA</td></tr><tr><td>Mezzo Nutri-fly Bloomington Formulation</td><td>Genesee Scientific</td><td>66-121</td><td>Per la coltura standard di Drosophila</td></tr><tr><td>Omogeneizzatore con motore cordless Pellet Pestle</td><td>DWK Life Sciences</td><td>K749540-0000</td><td>Per l'omogeneizzazione dei campioni per l'estrazione di DNA genomico</td></tr><tr><td>Bottiglie in polipropilene</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-130</td><td>Per la coltura standard di Drosophila</td></tr><tr><td>Provette in polistirene</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-116</td><td>Per la coltura standard di Drosophila, inclusa l'applicazione di shock termico</td></tr><tr><td>Primer/oligonucleotide DR-white_8f</td><td>N/A; qualsiasi servizio di sintesi di oligonucleotidi è sufficiente</td><td>N/A</td><td>5'GTGGATCAGGTGATCCAGG</td></tr><tr><td>Primer/oligonucleotide DR-white_8a</td><td>N/A; qualsiasi servizio di sintesi di oligonucleotidi è sufficiente</td><td>N/A</td><td>5&amp;rsquo;-CTTAAGCCATCGTCAGTTGC</td></tr><tr><td>Primer/oligonucleotide DR-white_9f</td><td>N/A; qualsiasi servizio di sintesi di oligonucleotidi è sufficiente</td><td>N/A</td><td>5&amp;rsquo;-GAGCCCACCTCCGGACTGGAC</td></tr><tr><td>R Studio</td><td>Posit</td><td>Versione 2023.06.1+524</td><td>Versione scaricabile gratuita; qualsiasi versione di R Studio è accettabile, anche se i dati presentati sono stati analizzati con la&amp;nbsp; versione 2023.06.1+524</td></tr><tr><td>Pacchetti R Studio: Biostrings</td><td>Bioconductor.org (Versione 3.24)</td><td>Versione 2.76.0</td><td>Lo script R chiederà all'utente di installare questo pacchetto</td></tr><tr><td>Pacchetti R Studio: sangerseqR</td><td>Bioconductor.org (Versione 3.24)</td><td>Versione 1.44.0</td><td>Lo script R chiederà all'utente di installare questo pacchetto</td></tr><tr><td>SapphireAMP Fast PCR</td><td>Takara</td><td>RR350B</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Leica</td><td>M60</td><td>Per il trasferimento standard di Drosophila &quot;fly pushing&quot;</td></tr><tr><td>Wizard SV Gel and PCR Clean up&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr></tbody></table>

misurazione della riparazione delle rotture a doppio filamento del dna mediante il saggio dr-white in drosophila melanogaster

Measuring DNA Double-Strand Break Repair Using the DR-white Assay in Drosophila melanogaster

Gli studi tradizionali sulla riparazione delle rotture a doppio filamento del DNA (DSB) sono spesso limitati a indagini biochimiche o a sistemi unicellulari (ad esempio, cellule, lieviti). Per facilitare lo studio della riparazione delle DSB in un organismo multicellulare, utilizziamo il saggio DR-white in Drosophila melanogaster. Il saggio DR-white è un saggio reporter semplice ma versatile per la riparazione delle DSB, che contiene una singola sequenza di riconoscimento per I-SceI, scindibile mediante l'espressione della meganucleasi I-SceI. L'espressione di I-SceI può essere indotta costitutivamente, mediante shock termico o tramite altri promotori, consentendo indagini sulla riparazione specifica per tessuto o stadio di sviluppo. Un vantaggio principale del saggio è la capacità di distinguere gli esiti della riparazione che coinvolgono ricombinazione omologa (HR), giunzione non omologa di estremità (NHEJ) e appaiamento di filamenti singoli (SSA). Questo articolo fornisce un protocollo dettagliato per il consolidato saggio DR-white, inclusa una procedura passo dopo passo per indurre DSB nella linea germinale premiotica e analizzare fenotipicamente gli eventi di riparazione mediante valutazione della prole. Vengono inoltre descritte analisi molecolari degli eventi di riparazione mediante reazione a catena della polimerasi (PCR), sequenziamento e lo script R Tracking of Indels by DEcomposition (TIDE). Questo protocollo rappresenta uno strumento utile per lo studio dei meccanismi genetici e molecolari della riparazione del DNA in un modello organismo.

Drosophila richiede Rad51 per la riparazione mediante ricombinazione omologa
Esperimenti germinativi di successo producono le classi fenotipiche previste mostrate nella Figura 3A e almeno 20 prole valutabili per ogni provetta. Fenotipi inattesi o meno di 20 prole valutabili indicano contaminazione o produttività insufficiente e devono essere esclusi come specificato al punto 1.4.3. Per l'analisi TIDE, i campioni di successo generano un amplicone di circa 1,7 kb e cromatogrammi con scarso rumore di fondo prima del sito di rottura; DNA a basso rendimento o contaminato e cromatogrammi rumorosi sono subottimali e non devono essere analizzati.
Quando si utilizza il saggio DR-white con una fonte di I-SceI inducibile per shock termico, la frequenza di riparazione mediante ricombinazione omologa (HR) in moscerini di tipo selvatico è del 38,5 ± 1,2% (media ± SEM), mentre la riparazione mediante SSA avviene circa nel 3,2 ± 0,35% dei casi (Figura 3B&#160;e File Supplementare 4). Rad51 (codificato dall'omologo spnA in Drosophila) è necessario per il passaggio di invasione del filamento nella ricombinazione omologa14,19. Pertanto, la perdita di Rad51 dovrebbe determinare una riparazione HR inefficiente. In effetti, in un contesto DmRad51-/-, la riparazione HR è ridotta all'1,3 ± 0,4%, con un conseguente aumento della riparazione mediante SSA (34,5 ± 1,8%; Figura 3B&#160;e File Supplementare 4)14. Ciò è molto probabilmente dovuto al fatto che gli eventi di riparazione avviati come ricombinazione omologa vengono invece riparati mediante l'appaiamento di sequenze ripetute in singolo filamento del gene white.
Drosophila CtIP contribuisce a una riparazione HR efficiente nei tessuti somatici
L'algoritmo TIDE consente la misurazione della scelta della via di riparazione nelle cellule somatiche. In un contesto non mutante, la ricongiunzione estremi non omologa (NHEJ) con elaborazione si verifica nel 59,0% degli eventi di riparazione rilevabili, mentre la ricombinazione omologa (HR) si verifica nel 41,0% (Figura 4B&#160;e File Supplementare 4). CtIP svolge un ruolo importante nell'avvio della riparazione tramite HR promuovendo la resezione degli estremi del DNA20. Di conseguenza, in un contesto DmCtIP-/-, la scelta della via HR è notevolmente ridotta nelle cellule somatiche, passando dal 41,0% nei controlli eterozigoti al 10,9% nei mutanti omozigoti (Figura 4B e File Supplementare 4)16. Questo indica che in Drosophila, CtIP contribuisce alla riparazione tramite HR, ma non è essenziale per tale processo.
<img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/72635/72635fig1.jpg" /> 
Figura 1: Saggio del reporter DR-white per interruzioni a doppio filamento (DSB) e risultati della riparazione. Il saggio Direct Repeat of white contiene due copie non funzionali del gene white: Sce.white (con un'inserzione di 23 pb contenente il sito di riconoscimento I-SceI e un codone di stop prematuro) e iwhite (sequenza donatrice troncata alle estremità 5′ e 3′). Incrociando moscerini contenenti DR-white e un transgene I-SceI si genera un'interruzione a doppio filamento (DSB) sito-specifica, analizzabile a livello fenotipico o molecolare. I fenotipi risultanti sono: (A) progenie dagli occhi bianchi (y+ w−), indicante assenza di DSB, ricombinazione omologa intersister o riparazione NHEJ; (B) progenie dagli occhi rossi (y+ w+), indicante ricombinazione omologa intracromosomica che ripristina la sequenza wild-type SacI dalla sequenza donatrice iwhite; e (C) progenie con corpo giallo e occhi bianchi (y− w−), indicante riparazione mediante single-strand annealing (SSA) o crossing-over mitotico. Figura adattata da Do et al.14. Abbreviazioni: CO = crossing-over; DR-white = Direct Repeat of white; DSB = interruzione a doppio filamento; HR = ricombinazione omologa; NHEJ = joining non omologo delle estremità; SSA = annealing del singolo filamento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/72635fig1large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/72635/72635fig2.jpg" /> 
Figura 2: Derivati del saggio DR-white. (A) Il saggio DR-white.mu contiene 28 SNP silent nella sequenza donatrice iwhite.mu, determinando una divergenza di sequenza del 1,4% tra le ripetizioni dirette. La conversione genica di singoli polimorfismi varia tra gli eventi di ricombinazione omologa (HR) e può essere determinata mediante sequenziamento. (B) Il saggio DR-white con il donatore iwhiteΔ9 distingue la ricombinazione interomologa da quella intracromosomica. L'HR proveniente dal donatore intracromosomico iwhite ripristina la sequenza wild-type SacI e produce prole con occhi rossi. L'HR proveniente dal donatore interomologo iwhiteΔ9 produce prole con occhi arancioni poiché la delezione di 9 pb riduce l'espressione di white. La figura è stata adattata da Do et al.14 e Fernandez et al.15. Abbreviazioni: DSB = interruzione a doppio filamento; HR = ricombinazione omologa; SNP = polimorfismo a singolo nucleotide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/72635fig2large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/72635/72635fig3.jpg" /> 
Figura 3: Flusso di lavoro sperimentale per il rilevamento degli esiti della riparazione di interruzioni a doppio filamento nella linea germinale premeiotica. (A) L'incrocio 1 combina il reporter DR-white (o un suo derivato) con un transgene I-SceI (in questo esempio, sul secondo cromosoma). La progenie che contiene sia il saggio DR-white che il transgene I-SceI mantiene gli eventi di riparazione nei tessuti germinale e somatico. Per analizzare singoli eventi di riparazione nella linea germinale premeiotica, la progenie portatrice di entrambi i transgeni viene incrociata con moscerini tester y w (incrocio 2), e la progenie viene analizzata come descritto nella Figura 1. (B) Singoli eventi di riparazione di interruzioni a doppio filamento nella linea germinale di moscerini di tipo selvaggio (n = 106 linee germinali) e di mutanti omozigoti DmRad51 (n = 46 linee germinali). **P &#60; 0,01; ****P &#60; 0,0001 mediante ANOVA a due vie seguita dal test di confronti multipli di Sidak. Le barre rappresentano le medie; le barre di errore rappresentano l'errore standard della media (SEM). I dati sono stati rielaborati da Do et al.14. Abbreviazioni: ANOVA = analisi della varianza; CO = ricombinazione incrociata; DSB = interruzione a doppio filamento; HR = ricombinazione omologa; NHEJ = unione di estremi non omologhi; SEM = errore standard della media; SSA = appaiamento a singolo filamento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/72635fig3large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/72635/72635fig4v2.jpg" /> 
Figura 4: Flusso di lavoro sperimentale per il rilevamento degli esiti della riparazione delle rotture a doppio filamento (DSB) mediante Tracking of Indels by DEcomposition. (A) Analisi di moscerini portatori del transgene DR-white e di I-SceI indotto mediante estrazione di DNA genomico (gDNA), amplificazione PCR del sito della DSB, sequenziamento Sanger e analisi TIDE con lo script R. (B) Dati rappresentativi ottenuti da mutanti DmCtIP-/-&#160; (n = 23) e controlli eterozigoti DmCtIP+/-&#160; (n = 31). Gli eventi di riparazione rilevabili sono calcolati come ricombinazione omologa (HR) più giunzione non omologa delle estremità (NHEJ) con elaborazione, escludendo l’assenza di DSB o NHEJ senza indel. ****P &#60; 0,0001 mediante ANOVA a due vie seguita dal test multiplo di confronti di Sidak. Le barre rappresentano le medie; le barre di errore indicano l’errore standard della media (SEM). I dati sono stati riesaminati da Thomas et al.16. Acronimi: ANOVA = analisi della varianza; DSB = rottura a doppio filamento; gDNA = DNA genomico; HR = ricombinazione omologa; NHEJ = giunzione non omologa delle estremità; PCR = reazione a catena della polimerasi; SEM = errore standard della media; TIDE = Tracking of Indels by DEcomposition. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/72635fig4largev2.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
File Supplementare 1: Script R TIDE per l'identificazione di inserzioni e delezioni nei cromatogrammi di sequenza rispetto a un controllo senza DSB. Il nome del file di controllo modificabile dall'utente, i nomi dei file campione e la sequenza bersaglio di I-SceI sono indicati verso la fine dello script. Gli input richiesti, i file di output e la loro interpretazione sono descritti nella sezione 2.3. Sono necessari i pacchetti sangerseqR e Biostrings.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/Supplemental File 1.R" target="_blank">Cliccare qui per scaricare questo file.</a>
File Supplementare 2: Guida con screenshot passo dopo passo al flusso di lavoro dello script R di TIDE. I riquadri illustrano le operazioni del software descritte nella sezione 2.3.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/Supplemental File 2 (1).pdf" target="_blank">Cliccare qui per scaricare il file.</a>
File Supplementare 3: Esempio di output TIDE e calcoli degli eventi di riparazione. Il valore 0-indel rappresenta l'assenza di DSB o NHEJ senza indel; la riga HR separata rappresenta il prodotto canonico di cancellazione di 23 pb; tutti i restanti percentuali di indel sono sommati come NHEJ con elaborazione. La riparazione totale rilevabile viene calcolata come somma di HR e NHEJ con elaborazione.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/Supplemental File 3.xlsx" target="_blank">Cliccare qui per scaricare questo file.</a>
File Supplementare 4: Dati grezzi alla base della Figura 3B e della Figura 4B, organizzati in fogli di lavoro modificabili separati. Questi dati sono stati riesaminati a partire dagli studi precedentemente pubblicati citati nelle legende delle figure corrispondenti.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/Supplemental File S4_R1_v2.pdf" target="_blank">Cliccare qui per scaricare questo file.</a>

Il saggio DR-white è un saggio genetico reporter versatile per rilevare gli esiti della riparazione delle rotture a doppio filamento del DNA nell'organismo multicellulare Drosophila melanogaster.

Misurazione della riparazione delle rotture a doppio filamento del DNA mediante il saggio DR-white in Drosophila melanogaster

Gli studi tradizionali sulla riparazione delle rotture del doppio filamento (DSB) del DNA sono frequentemente limitati a indagini biochimiche o a sistemi unicellulari (ad esempio, cellule, ...

Il nostro laboratorio è interessato al campo dell'integrità del genoma, con un focus su come le cellule riparano le rotture a doppio filamento del DNA. A differenza di altri saggi di riparazione del DNA, il saggio DR-white di Drosophila misura la riparazione delle rotture a doppio filamento in contesti multicellulari, inclusi le cellule somatiche e le cellule della linea germinale.Dopo aver completato gli incroci genetici e l'induzione delle rotture a doppio filamento, lasciare che la progenie dell'incrocio tester si sviluppi. A partire dal momento in cui compaiono le prime mosche, valutare la progenie nell'arco di circa nove giorni. Anestetizzare le mosche utilizzando anidride carbonica oppure trasferirle in una provetta vuota senza cibo e congelarle a -20 gradi Celsius per almeno 30 minuti. Posizionare le mosche su un apposito tappetino per mosche. Per la valutazione, identificare le mosche portatrici della ripetizione diretta del cassetto white o del cassetto DR-white mediante la fluorescenza RFP. Valutare il colore degli occhi e del corpo. Il transgene y-plus associato al cassetto DR-white produce un colore del corpo marrone intermedio, non completamente di tipo selvatico. Confrontare queste mosche con la progenie gialla white negativa per RFP, priva del cromosoma DR-white, al fine di distinguere l'assenza di rottura a doppio filamento o il ripristino mediante non-homologous end joining dal processo di single-strand annealing. Classificare come assenza di rottura a doppio filamento o non-homologous end joining le mosche con corpo più scuro e tendente al marrone. Includere nel set di dati soltanto le provette contenenti almeno 20 mosche analizzate.Per l'analisi molecolare degli eventi di riparazione, raccogliere le mosche sottoposte a shock termico che portano entrambi i transgeni DR-white e I-SceI, come nella progenie dell'Incrocio 1. Posizionare singole mosche in provette microcentrifuga da 1,5 millilitro e congelare rapidamente i campioni in un bagno di ghiaccio secco ed etanolo. Omogeneizzare ciascun campione in 50 microlitri di buffer A utilizzando un omogeneizzatore elettrico. Successivamente, incubare i campioni in un bagno termico a 65 gradi Celsius per 30 minuti. Aggiungere 100 microlitri di buffer B a ciascun campione e mescolare brevemente capovolgendo le provette. Incubare i campioni sul ghiaccio per almeno 30 minuti, quindi centrifugarli a circa 16.000 g per 15 minuti a 4 gradi Celsius. Trasferire 125 microlitri del sopranatante chiarificato in una nuova provetta microcentrifuga da 1,5 millilitro, evitando qualsiasi precipitato. Aggiungere 100 microlitri di isopropanolo e mescolare brevemente capovolgendo la provetta. Centrifugare i campioni a circa 16.000 g per 10 minuti a temperatura ambiente. Aspirare il sopranatante, avendo cura di non disturbare il pellet di DNA. Lavare il pellet con 250 microlitri di etanolo al 70% freddo di ghiaccio, mescolando delicatamente capovolgendo la provetta. Centrifugare i campioni a circa 16.000 g per cinque minuti a 4 gradi Celsius e aspirare nuovamente il sopranatante. Lasciare la provetta scoperta a temperatura ambiente per far evaporare l'etanolo residuo senza eccessiva essiccazione del pellet. Quindi, aggiungere 20 microlitri di acqua priva di nucleasi e lasciare ricostituire il pellet durante la notte a 4 gradi Celsius. Il giorno successivo, battere delicatamente la provetta per mescolare e misurare la concentrazione di DNA.Amplificare tramite PCR la regione Sce.white utilizzando 100 nanogrammi di DNA genomico e i primer diretti e inversi DR-white. Includere il DNA genomico di una mosca controllo DR-white priva del transgene I-SceI, quindi eseguire la reazione utilizzando condizioni di termociclaggio appropriate. Eseguire circa 2 microlitri del prodotto di PCR su un gel al 1% in tampone Tris-acetato-EDTA per confermare l'amplificazione di Sce.white. Verificare che l'amplicone sia di circa 1,7 chilobasi, quindi purificare gli ampliconi Sce.white. Misurare la concentrazione di DNA e sequenziare il prodotto di PCR purificato utilizzando il primer di sequenziamento DR-white.Dopo aver scaricato i pacchetti R richiesti, esaminare i cromatogrammi di sequenza e selezionare solo quelli con poco o nessun rumore di fondo precedente al sito di interruzione per l'analisi. Scaricare i file di traccia della sequenza con estensione .ab1. Posizionarli tutti in una singola cartella del computer e semplificare il più possibile i nomi dei file di sequenza. Aprire lo script R Tracking of Indels by DEcomposition o TIED nell'ambiente di sviluppo integrato RStudio. Nel riquadro di origine, individuare la riga che inizia con control e inserire esattamente il nome del file di sequenza di controllo così come salvato, compresa l'estensione tra virgolette. Individuare la riga che inizia con sample name e inserire ciascun nome del file di sequenza del campione all'interno delle parentesi, inserendo ogni nome del file tra virgolette separate e separandoli con virgole. Quindi, salvare lo script R TIED modificato nella stessa cartella contenente le sequenze da analizzare. Nell'ambiente di sviluppo integrato, accedere alla cartella TIED utilizzando la scheda File nel riquadro di output. Fare clic sul menu a discesa Altro e selezionare Apri nuovo terminale qui. Nel terminale appena aperto, digitare R e premere Invio. Una volta avviato R, eseguire lo script R TIED digitando il comando source con il nome del file dello script e premere Invio. Lo script genera una rappresentazione grafica e un file di valori separati da virgole contenente i dati grezzi per ciascun campione. Aprire ciascun file di valori separati da virgole e interpretare i dati grezzi come proporzioni di indel nella sequenza del campione. Infine, identificare l'eliminazione canonica di 23 paia di basi riportata separatamente nella parte inferiore dell'output come valore di ricombinazione omologa. Interpretare il valore di indel pari a 0 come assenza di interruzione a doppio filamento o di riparazione mediante unione delle estremità non omologa senza indel, e sommare i restanti valori di indel per determinare l'unione delle estremità non omologa con elaborazione.Gli esperimenti sulla linea germinale riusciti hanno prodotto le classi fenotipiche previste e almeno 20 prole valutabili per ogni provetta. In moscerini di tipo selvatico che esprimono I-SceI indotto da shock termico, la ricombinazione omologa si è verificata in circa il 38,5% della prole, rispetto al 3,2% per l'annealing della singola elica. In un contesto mutante omozigote per DmRad51, la riparazione mediante ricombinazione omologa è diminuita fino a circa l'1,3%, con un conseguente aumento della riparazione mediante annealing della singola elica a circa il 34,5%. In cellule somatiche con un background non mutante, la ricongiunzione delle estremità non omologa con elaborazione ha rappresentato circa il 59% degli eventi di riparazione rilevabili, mentre la ricombinazione omologa ha rappresentato il 41%. In un contesto mutante omozigote per DmCtIP, la scelta della via della ricombinazione omologa è diminuita al 10,9%.Questo protocollo può essere applicato a diversi tessuti, stadi di sviluppo e posizioni genomiche per determinare i fattori che influenzano la riparazione. Inoltre, questo saggio è stato modificato per misurare esiti della riparazione come la lunghezza delle tracce di conversione genica e la preferenza per il modello di riparazione. Questo saggio di riparazione del DNA può essere utilizzato per determinare vari fattori coinvolti nel processo di riparazione mediante l'uso di mutanti genetici in Drosophila.

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Genetica

Analisi del DNA doppio filamento Break (DSB) di riparazione in cellule di mammifero

In questo video, descriviamo la tecnica di microscopia a immunofluorescenza per rilevare specifiche proteine di risposta al danno del DNA localizzate nei siti di rottura del doppio filamento di DNA nelle cellule mononucleate umane. Le proteine sono riconosciute da specifici anticorpi primari, che a loro volta si legano agli anticorpi secondari marcati con fluorofori che emettono fluorescenza durante la visualizzazione microscopica, consentendo la visualizzazione delle proteine come focolai...

Microscopia a immunofluorescenza per l'analisi delle rotture del DNA a doppio filamento

L'epidermide embrionali di fase molto avanzata di Drosophila embrioni fornisce un sistema in vivo per l'analisi rapida risposta puntura ferita e possono essere combinati con manipolazioni genetiche o trattamenti chimici microiniezione per avanzare gli studi nella guarigione delle ferite per la traduzione in modelli di mammiferi.

Microiniezione Wound Assay e<em&gt; In vivo</em&gt; Localizzazione di Epidermal Wound risposta Giornalisti a<em&gt; Drosophila</em&gt; Embrioni.

Riparazione di rotture a doppio filamento del DNA è un processo dinamico, che richiede non solo la formazione di complessi di riparazione presso le pause, ma anche la loro risoluzione dopo che la lesione è indirizzata. Qui, usiamo il microscopia di immunofluorescenza per interruzioni di double-stranded transitorie e di lunga durata come strumento per sezionare questo meccanismo di mantenimento del genoma.

Che caratterizzano i processi di riparazione del DNA alle rotture del DNA transitori e duraturo doppio filo da microscopia di immunofluorescenza

Vi presentiamo un protocollo utilizzando un approccio genetico in avanti allo screening per i mutanti che mostrano neurodegenerazione in Drosophila melanogaster. Incorpora un saggio di arrampicata, analisi istologica, mappatura genica e sequenziamento del DNA per identificare in ultima analisi nuovi geni legati al processo di neuroprotezione.

In Vivo Avanti Schermo Genetico per Identificare Nuovi Geni Neuroprotettivi in Drosophila melanogaster

Questo protocollo è progettato per valutare la fattibilità della Drosophila in ogni fase dello sviluppo, dall'embrione all'adulto. Il metodo può essere utilizzato per determinare e confrontare la fattibilità di diversi genotipi o condizioni di crescita.

Un metodo diretto e semplice per valutare la vitalità di Drosophila melanogasterda embrione ad adulto

L'integrità della barriera emato-encefalica è fondamentale per la funzione del sistema nervoso. Nella Drosophila melanogaster, la barriera emato-encefalica è formata da cellule gliali durante l'embriogenesi tardiva. Questo protocollo descrive i metodi per la formazione e la manutenzione delle barriere emato-encefalice negli embrioni di D. melanogaster e delle larve instar terze.

Analisi per l'integrità della barriera del cervello edelico nella Drosophila melanogaster

Nel presente protocollo, dimostriamo come visualizzare la resezione finale a doppio filamento del DNA durante la fase S/ G2 del ciclo cellulare utilizzando un metodo basato sull'immunofluorescenza.

Valutazione della resezione finale globale a doppio filamento del DNA utilizzando l'etichettatura BrdU-DNA abbinata all'imaging di discriminazione del ciclo cellulare

Questo protocollo descrive un saggio di giunzione delle estremità extracromosomiche non omologhe (NHEJ) e un saggio di ricombinazione omologa (HR) per quantificare l'efficienza di NHEJ e HR nelle cellule HEK-293T.

Analisi dell'unione di estremità non omologhe e dell'efficienza di ricombinazione omologa in cellule HEK-293T utilizzando sistemi reporter basati su GFP

Presentiamo protocolli per la valutazione della competenza del percorso di riparazione a doppio filamento di rottura nelle cellule utilizzando una suite di substrati reporter extracromosomici basati sulla luminescenza.

Valutazione dell'attività di riparazione della rottura del doppio filamento del DNA utilizzando saggi reporter ad alto rendimento e quantitativi basati sulla luminescenza

Scopri il saggio DR-white per misurare la riparazione delle rotture a doppio filamento del DNA in Drosophila melanogaster. Questo metodo distingue tra ricombinazione omologa, NHEJ e SSA in organismi multicellulari.

Misurazione della riparazione delle rotture a doppio filamento del DNA mediante il saggio DR-white in Drosophila melanogaster

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