Name: In vitro e in Imaging bioluminescenza gene reporter in vivo di cellule staminali embrionali umane (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-05-02T17:59:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Impara a tracciare la proliferazione di cellule staminali embrionali umane in vivo mediante imaging bioluminescente non invasivo. Questo protocollo consente di monitorare la sopravvivenza cellulare post-trapianto in un modello murino vivente.

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Grazie a Tim Doyle, PhD e il Centro di Stanford per imaging in vivo per l&#39;assistenza con l&#39;imaging bioluminescenza. Grazie anche a Ngan Huang, PhD per condividere la sua tecnica su cellule staminali co-iniezione con soluzione matrice. Infine, grazie a Steve Feltri, Ph.D. assistenza per la cura degli animali veterinari.

<ol><li> Costruzione di Gene Doppia Reporter Fusion <ol><li> Al fine di eseguire l&#39;imaging bioluminescenza delle cellule staminali embrionali umane, è necessario prima di ottenere cellule che esprimono stabilmente un gene luciferasi giornalista come luciferasi lucciola guidata da un promotore costitutivo come ubiquitina o EF1a. </li><li> Il focus di questo protocollo è sulle applicazioni gene reporter, in modo dettagliato le procedure non sono forniti qui. Tuttavia, la strategia generale del nostro laboratorio è quello di utilizzare un doppio vettore costruire fusione che contiene lucciola luciferasi (fluttuazioni) e migliorato proteina verde fluorescente (EGFP) separate da un distanziale all&#39;interno pCDNA 3.1 +. </li><li> In breve, il nostro gene di fusione doppio era originariamente situato a valle del promotore del citomegalovirus in pCDNA 3.1 (+), quindi il 3,3 kbp frammento è stato asportato con la digestione e NdeI Noti e smussato-end legatura nel sito di clonazione multiplo di un auto-inattivazione (SIN ) vettori lentivirali, sotto il controllo di un promotore Ubiquitina. </li></ol></li><li> Trasduzione lentivirali <ol><li> hESC possono essere trasdotte 3-5 giorni dopo il passaggio ad una molteplicità di infezione (MOI) di 10 (titolo virale di circa 107 incubati con 106 celle). </li><li> Lo stock scongelato virale possono essere aggiunti direttamente ai media hESC fresca. </li><li> Aggiornare i media 12 e 24 ore dopo. </li><li> Dopo 48 ore, efficienza di trasduzione in grado di valutare qualitativamente usando la microscopia a fluorescenza. Successivamente, FACS può essere utilizzato per isolare le cellule infette. </li></ol></li><li> HESC coltura e Introduzione alla Imaging Set-up <ol><li> Cultura tuo hESC luciferasi positivo alimentatore senza condizioni. Noi di solito seguono il protocollo standard WiCell e utilizzare le piastre a 6 e rivestito in fattore di crescita ridotta Matrigel, utilizzando sia i media condizionata o commerciali, senza alimentatore mezzi di comunicazione. </li><li> Per rilevare le cellule luciferasi positivo, è necessario avere la sonda giornalista di D-luciferina già preparato. Per fare questo, luciferina aliquota a 1-1,5 ml preparati ad una concentrazione finale di 45 mg / ml. Mantenere le aliquote a -20 ° C, quando non in uso ed evitare l&#39;esposizione alla luce da coprire con un tovagliolo di carta, quando non in deposito. </li><li> Al fine di visualizzare le cellule luciferasi positivo, usiamo IVIS 50 e 200 IVIS Imaging Systems (Xenogen Corporation, Alameda, CA). Quest&#39;ultimo sistema comprende un apparato integrato isoflourane e la camera di induzione di anestesia temporanea di piccoli animali. </li></ol></li><li> Nell&#39;imaging bioluminescenza in vitro di hESC <ol><li> Per nell&#39;imaging bioluminescenza in vitro, è importante mantenere condizioni di sterilità. Pertanto, il sistema di imaging devono essere sterili, preferibilmente in una stanza di coltura cellulare. </li><li> Prima di imaging, rimuovere il supporto delle cellule e aggiungere quel tanto che basta PBS per coprire le cellule. Ad esempio, aggiungere 1 ml di PBS a ciascun pozzetto di un 6-pozzetti contenenti vostre culture hESC. </li><li> Il rapporto tra D-Luciferin di PBS dovrebbe essere 1:100, quindi aggiungere 10 ml di scongelato D-Luciferin in ciascun pozzetto della piastra ben 6. </li><li> Aspettate un minuto, quindi scattare una foto con un tempo di esposizione di 1 secondo. Se il segnale è debole, aumentare l&#39;intervallo di esposizione e riprovare. </li><li> Il segnale bioluminescente riflette numero di cellulare, in modo da saggi di quantificazione può essere effettuata che correlano segnale con il numero di cellule differenti. </li></ol></li><li> Preparazione del mouse e l&#39;iniezione di cellule per imaging in vivo <ol><li> Reporter gene fornisce un metodo di imaging ad alta velocità, poco costoso e sensibile per le cellule di inseguimento dopo il trapianto per giorni, settimane e anche mesi. Ciò è particolarmente importante in quanto le cellule staminali trapiantate frequente forma teratomi, sono rigettate dal sistema immunitario dell&#39;ospite, o semplicemente morire. </li><li> Il metodo più semplice per la formazione di teratomi l&#39;imaging in vivo è quello di iniettare hESC che esprimono il gene reporter luciferasi lucciola nella schiena di topi SCID e di acquisire immagini bioluminescenti con il sistema IVIS. </li><li> Quando sei pronto per trapiantare le cellule, l&#39;uso dispasi o collagenasi per allentare le cellule, lavare più volte, e sospendere in una miscela 1:1 di fattore di crescita ridotto matrigel e DMEM. Di solito abbiamo prima mescolare le cellule con DMEM refrigerato e poi aggiungere nel matrigel. Per ciascun sito di iniezione sottocutanea, iniettiamo 200.000 cellule sospese in un volume di 50-100 ul del matrigel / DMEM miscela. Il numero di cellule può essere regolata a seconda dell&#39;applicazione in uso. Ricordate di tenere tutto in ghiaccio prima dell&#39;iniezione. </li><li> Una volta che le cellule sono pronte, anestetizzare il mouse inserendo nella casella di induzione con isofluorano flusso acceso. Dopo 1-5 minuti, il mouse è addormentato e può essere posizionato sul tavolo operatorio con isoflurano continuo. </li><li> Perché pelliccia naturale auto-fluorescente e può oscurare l&#39;immagine bioluminescente, avremo bisogno di togliere il pelo dalla parte posteriore del mouse. Il modo più semplice per farlo è di utilizzare un rasoio elettrico, ma è anche possibile utilizzare depilazione gel. Pulire con alcool per sterilizzarela pelle dopo </li><li> Successivamente, elaborare il vostro sospensione di cellule in una siringa. 23-27 aghi calibro funzionano meglio in quanto non si intasano con le cellule. Se l&#39;ago è troppo grande (&lt;23 gauge) del tratto dell&#39;ago può lasciare un grande buco attraverso il quale le cellule possono refluire fuori. </li><li> Iniettare le cellule sotto la pelle nella schiena del mouse. Perché la pelle è piuttosto ampio, con il pollice e l&#39;indice per pizzicare e allungare la zona da iniettare. Iniettare sotto la pelle, facendo attenzione a non forare troppo in profondità. Inoltre, cercare di mantenere l&#39;ago di scivolare fuori del sito di iniezione mentre lo stantuffo: questo impedirà la creazione di un foro nella pelle attraverso i quali le cellule possono perdita se si tenta di iniettare di nuovo. </li><li> Dopo che le cellule vengono iniettate, attendere qualche ora per permettere al mouse per svegliarsi e correre prima di ri-anestesia per l&#39;imaging bioluminescenza. In questo modo evita di tossicità isoflurano. </li></ol></li><li> Nell&#39;imaging bioluminescenza in vivo delle cellule trapiantate <ol><li> Per l&#39;imaging intero bioluminescenza animali, facciamo un&#39;iniezione intraperitoneale di D-luciferina a 375 mg / kg di peso corporeo. Pesare l&#39;animale per calcolare il dosaggio prima dell&#39;iniezione. </li><li> Iniettare il D-luciferina nel peritoneo, poco lontano dalla linea mediana. Fare attenzione a non andare troppo in profondità o si può danneggiare gli organi interni. Se il mouse comincia a svegliarsi, metterlo nella scatola eliminazione diretta e attendere un minuto o due. Per i topi, la bioluminescenza massimo si verifica di solito 15-40 minuti dopo l&#39;iniezione. </li><li> Ricordati di inserire carta nera opaca nella casella di imaging che aiutano ad assorbire qualsiasi luce non emessa dal hESC. Posizionare il mouse (fino retro) nella camera di imaging con isoflurano, in cima alla carta nera. Inizia con un tempo di esposizione di 10 secondi. Se il segnale è saturo, provare a diminuire il tempo di esposizione, se troppo debole, aumentare l&#39;esposizione. </li><li> Una volta che il tempo di esposizione del segnale è stato ottimizzato per il mouse, cominciare a prendere le immagini ogni minuto fino a quando il segnale raggiunge un massimo. Questo è fatto meglio utilizzando il software di imaging per selezionare &quot;regioni di interesse (ROI)&quot; che coprono le sedi di iniezione. Attraverso il monitoraggio della intensità del segnale in ogni ROI si può facilmente determinare quando il segnale comincia a diminuire, indica che l&#39;intensità del segnale massimo è stato raggiunto. Il segnale di massima dovrebbero essere usati come dati finali. </li><li> Quando si è soddisfatti con le vostre immagini, togliere il mouse da isoflurano e permettergli di svegliarsi nella sua gabbia. Di solito, il mouse dovrebbe svegliarsi in 15 minuti. </li><li> Giornalista di imaging bioluminescenza gene può essere ripetuta ogni giorno, settimanali e mensili per tutto il tempo la hESC sopravvivere l&#39;animale. Segnale da un teratoma sviluppo aumenterà in modo esponenziale nel corso del tempo, tipicamente dell&#39;ordine di settimane, come il hESC cominciano a proliferare. </li><li> Dopo il periodo di tempo desiderato di immagini bioluminescenza è acquisito, l&#39;animale può essere sacrificata e sezioni di tessuto utilizzato per l&#39;esame istologico. </li></ol></li></ol>

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Rispetto ad altre modalità come la PET e risonanza magnetica, la bioluminescenza è limitata risoluzione spaziale e di penetrazione nel tessuto ridotto a causa della relativamente debole energia dei fotoni emessi (2-3 eV), per queste ragioni che finora non è stato applicabile in animali di grandi dimensioni. Tuttavia, bioluminescenza ha il vantaggio di essere a basso costo, ad alta produttività, e non invasivo, il che rende altamente auspicabile che in cellule staminali in vivo inseguimento nei piccoli animali. Non bioluminescenza geni repor...

<table><tbody><tr><td>Mezzo Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle&amp;rsquo;s (DMEM)</td><td></td><td>Hyclone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matrice di membrana basale BD Matrigel&amp;#8482;</td><td>Ridotta nei fattori di crescita (opzionale: priva di fenolo rosso)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di mantenimento mTeSR1 per cellule staminali embrionali umane</td><td></td><td>Stem Cell Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata al fosfato (PBS)</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferina di lucciola, sale potassico</td><td></td><td>Biosynth International, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di Collagenasi IV</td><td></td><td></td><td></td><td>Sciogliere 30 mg di Collagenasi di Tipo IV in 30 mL di mezzo DMEM-F12. Filtrare in condizioni sterili e conservare a 4 gradi (Celsius).</td></tr><tr><td>Pipette Pasteur sterili preriscaldate</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastre da coltura cellulare a 6 pozzetti</td><td></td><td>Techno Plastic Products</td><td>92006</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro e in imaging bioluminescenza gene reporter in vivo di cellule staminali embrionali umane

In vitro and in vivo Bioluminescence Reporter Gene Imaging of Human Embryonic Stem Cells

La scoperta delle cellule staminali embrionali umane (hESC) ha notevolmente aumentato gli strumenti a disposizione degli scienziati medici interessati alla medicina rigenerativa. Tuttavia, l&#39;iniezione diretta di hESC, e le cellule differenziate da hESC, in organismi viventi è stata finora ostacolata dalla morte delle cellule significativi, la formazione di teratoma, e il rifiuto immune. Comprensione del comportamento hESC vivo dopo trapianto richiede nuove tecniche di imaging di monitorare longitudinalmente localizzazione hESC, la proliferazione e la vitalità. L&#39;imaging molecolare ha dato un mezzo investigatori high-throughput, poco costoso, e sensibile per il monitoraggio della proliferazione cellulare in vivo per giorni, settimane e anche mesi. Questo progresso ha notevolmente aumentato la comprensione della spazio-temporale cinetica di attecchimento hESC, la proliferazione, e teratoma-formazione in soggetti viventi. Una delle principali innovazioni nel campo dell&#39;imaging molecolare è stata l&#39;estensione del test non invasivo gene reporter di biologia molecolare e cellulare in vivo in modalità multi-piattaforme di imaging. Questi geni reporter, sotto il controllo di promotori ingegnerizzati e stimolatori che sfruttano macchinari trascrizionale della cellula ospite s, vengono introdotte nelle cellule utilizzando una varietà di metodi vettoriali e non vettoriale. Una volta nella cellula, i geni giornalista può essere trascritto sia costitutivamente o solo in particolari condizioni biologiche o cellulare, a seconda del tipo di promotore utilizzato. Trascrizione e traduzione di geni reporter in proteine ​​bioattive viene poi rilevato con sensibili, strumentazione non invasiva (ad esempio, fotocamere CCD), utilizzando il segnale che generano sonde come la D-luciferina. Per evitare la necessità di luce eccitatoria per monitorare le cellule staminali in vivo, come è richiesto per l&#39;imaging di fluorescenza, la bioluminescenza giornalista sistemi di imaging gene richiedono solo una sonda esogena somministrata per indurre emissione di luce. Firefly luciferasi, derivato dal Fotino lucciola pyralis, codifica un enzima che catalizza D-luciferina al otticamente metabolita attivo, oxyluciferin. Attività ottica può quindi essere monitorato con una fotocamera esterna CCD. Trasdotte stabilmente cellule che trasportano il giornalista costruire nel loro DNA cromosomico passerà il giornalista costruire DNA alle cellule figlie, consentendo il monitoraggio longitudinale di sopravvivenza hESC e la proliferazione in vivo. Inoltre, poiché l&#39;espressione del prodotto del gene reporter è richiesto per la generazione del segnale, solo le cellule vitali genitore e figlia creerà segnale di bioluminescenza; cellule in apoptosi o morte no. In questo video, i materiali e metodi specifici necessari per la proliferazione delle cellule staminali il monitoraggio e la formazione di teratomi, con immagini bioluminescenza saranno descritti.

Con il crescente interesse per le terapie con cellule staminali, le tecniche di imaging molecolare sono ideali per il monitoraggio del comportamento delle cellule staminali dopo il trapianto. Geni reporter luciferasi hanno permesso non invasiva, la valutazione ripetitivo della sopravvivenza cellulare, la posizione e la proliferazione in vivo. Questo video dimostra come monitorare la proliferazione hESC in un topo vivo.

In vitro e in Imaging bioluminescenza gene reporter in vivo di cellule staminali embrionali umane

La scoperta delle cellule staminali embrionali umane (hESC) ha incrementato drasticamente gli strumenti a disposizione degli scienziati medici interessati alla medicina rigenerativa...

Il gold standard per determinare la pluripotenza di una cellula, ovvero la capacità di formare tutti e tre i foglietti embrionali, è la formazione di teratomi in vivo. I teratomi rappresentano inoltre un ostacolo significativo per il trapianto di cellule staminali, e attualmente si conosce poco riguardo alla loro formazione in termini di cinetica di crescita. Una volta che le cellule indifferenziate vengono impiantate nell'ambiente dell'ospite, lo sviluppo di reporter bioluminescenti, della trasduzione genica e della fotografia mediante dispositivi accoppiati a carica ultra-sensibili o fotografia CCD ha permesso una valutazione non invasiva e ripetuta della localizzazione, migrazione, proliferazione e differenziazione cellulare in vivo.In questo video, illustreremo un protocollo dettagliato per monitorare in modo efficace la proliferazione di cellule staminali embrionali umane trapiantate in un topo vivo. Ciao, sono Kit Wilson del laboratorio di Joseph Wu presso i Dipartimenti di Medicina e Radiologia dell'Università di Stanford. Oggi vi mostreremo le procedure per l'imaging di cellule staminali embrionali umane, sia in vitro che dopo il trapianto in un topo vivo.Queste procedure i

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Questo protocollo descrive lo sviluppo, l'espansione e immagini in vivo di cellule NK derivate da hESCs e iPSCs.

Sviluppo, di espansione, e<em&gt; In vivo</em&gt; Monitoraggio delle cellule NK umane da cellule staminali embrionali umane (hESC) ed e cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs)

Live tracking dei singoli progenitori retinici WT in background genetici distinti consente la valutazione del contributo delle cellule di segnalazione non autonomo durante la neurogenesi. Qui, una combinazione di knockdown gene, generazione chimera tramite trasferimento di embrioni in time-lapse imaging confocale vivo è stata utilizzata per questo scopo.

Imaging in vivo del transgenico espressione genica nei singoli retinica Progenitori in embrioni di zebrafish Chimerico da Cell studio Influenze non autonomo

Le cellule staminali neurali/progenitrici mostrano varie dinamiche di espressione dei componenti di segnalazione di Notch che portano a diversi risultati di eventi cellulari. Tale espressione dinamica può essere rivelata dal monitoraggio in tempo reale, non dall'analisi statica, utilizzando un sistema di imaging a bioluminescenza altamente sensibile che consente la visualizzazione di rapidi cambiamenti nelle espressioni geniche.

Risonanza in tempo reale sulla bioluminescenza delle dinamiche di segnalazione di nota durante la neurogenesi di Murine

Descriviamo il trapianto intraparenchimale di cellule progenitrici neurali umane trasdotte con un doppio vettore reporter che esprime la proteina fluorescente verde luciferasi (GFP) nel cervello del topo. Dopo il trapianto, il segnale della luciferasi viene ripetutamente misurato utilizzando bioluminescenza in vivo e cellule innestate che esprimono GFP identificate in sezioni cerebrali utilizzando la microscopia a fluorescenza.

Trapianto intracerebrale e monitoraggio della bioluminescenza in vivo delle cellule progenitrici neurali umane nel cervello del topo

I ritmi circadiani, che esistono nella maggior parte degli organismi, regolano l'organizzazione temporale dei processi biologici. Gli organoidi 3D sono recentemente emersi come modello in vitro fisiologicamente rilevante. Questo protocollo descrive l'uso di reporter bioluminescenti per osservare i ritmi circadiani negli organoidi, consentendo indagini in vitro dei ritmi circadiani nei sistemi multicellulari.

Monitoraggio delle oscillazioni circadiane con un reporter di bioluminescenza negli organoidi

Impara a tracciare la proliferazione di cellule staminali embrionali umane in vivo mediante imaging bioluminescente non invasivo. Questo protocollo consente di monitorare la sopravvivenza cellulare post-trapianto in un modello murino vivente.

In vitro e in Imaging bioluminescenza gene reporter in vivo di cellule staminali embrionali umane

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