Separazione elettroforetica delle proteine

La separazione di proteine individuali da miscele proteiche complesse può essere ottenuta mediante elettroforesi su gel di poliacrilamide, nota anche come PAGE. Le proteine migrano in risposta a un campo elettrico attraverso i pori della matrice del gel. La combinazione delle dimensioni dei pori del gel e della carica, delle dimensioni e della forma della proteina determina la velocità di migrazione della proteina. In questo video, illustreremo un metodo per la separazione elettroforetica delle proteine.

Ciao, sono il dottor Bobul Chakravarti del Centro di Proteomica dell'Istituto Graduate Keck delle Scienze della Vita Applicate. Oggi vi mostrerò un procedimento per eseguire l'elettroforesi su gel 1D. Cominciamo dunque.

Per iniziare, assemblare il sandwich di lastre di vetro dell'apparato di elettroforesi seguendo le istruzioni del produttore, utilizzando due lastre di vetro pulite e due distanziali da 1,5 millimetri. Ora fissare il sandwich di lastre di vetro al supporto per la colatura. Successivamente, preparare la soluzione del gel di separazione descritta nei protocolli correnti.

Aggiungere la quantità specificata di perossodisolfato di ammonio al 10% e versare nella soluzione, quindi mescolare delicatamente. A causa dell'elevata concentrazione di acrilamide, non è necessaria la degasificazione. Utilizzando una pipetta di plastica monouso da 10 millilitri, applicare immediatamente la soluzione del gel di separazione sul sandwich lungo un bordo di uno degli spaziatori, fino a quando l'altezza della soluzione tra le lastre di vetro è di circa 11 centimetri.

Successivamente, utilizzare un'altra pipetta per coprire lentamente la parte superiore del gel con uno strato di spessore approssimativamente di un centimetro di alcol isobutilico satura d'acqua o di acqua distillata. Eseguire questa operazione stratificando delicatamente l'acqua lungo il bordo di uno, e poi dell'altro degli spaziatori, lasciando polimerizzare il gel da 30 a 60 minuti. A temperatura ambiente, il sovrastrato d'acqua garantisce che il gel di acrilamide polimerizzi in una linea retta.

Una volta che il gel si è polimerizzato, siamo pronti per versare il gel di accumulo. Prima, eliminare lo strato di acqua distillata, quindi risciacquare con un tris CL x in SDS a un pH di 8,8. Preparare ora la soluzione del gel di accumulo come indicato nei protocolli correnti.

Successivamente, utilizzando una pipetta di plastica, far scorrere lentamente la soluzione del gel di accumulo al centro del sandwich lungo un bordo di uno degli spaziatori, fino a quando l'altezza della soluzione all'interno del sandwich è di circa un centimetro dal bordo superiore delle piastre. Prestare attenzione a non introdurre bolle d'aria nel gel di accumulo. Una volta versato il gel, inserire un pettine in teflon da 0,75 millimetri nello strato di soluzione del gel di accumulo.

Lasciare polimerizzare la soluzione del gel di sovrapposizione da 30 a 45 minuti a temperatura ambiente; a questo punto siamo pronti per preparare i campioni proteici. Per iniziare la preparazione dei campioni proteici, diluire una porzione del campione proteico da analizzare in rapporto uno a uno con buffer campione 2X SDS.

Per soluzioni proteiche diluite, si consiglia di utilizzare un rapporto da cinque a uno tra proteina e tampone campione SDS sei volte concentrato. Se il campione è un pellet proteico precipitato, sciogliere la proteina in 50-100 microlitri di tampone campione XSDS uno volte. Riscaldare quindi i campioni per tre-cinque minuti a 100 gradi Celsius in un tubo microcentrifuga con tappo a vite sigillato, immerso in un bagno termico.

Successivamente, rimuovere con attenzione il pettine in teflon senza strappare i bordi dei pozzetti in poliacrilamide. Dopo aver rimosso il pettine, sciacquare i pozzetti con tampone elettroforetico SDS 1X. Quindi, utilizzando una pipetta, riempire i pozzetti con tampone elettroforetico SDS 1X.

Dopo aver sciacquato e riempito le pozzette con tampone, fissare il sandwich del gel alla camera superiore del tampone. Seguendo le istruzioni del produttore, riempire la camera inferiore del tampone con la quantità raccomandata di tampone per elettroforesi XSDS 1X. Successivamente, inserire il sandwich fissato alla camera superiore del tampone all'interno della camera inferiore del tampone.

Ora riempire completamente la camera superiore del tampone con un tampone elettroforetico XSDS in modo che i pozzetti del gel di accumulo siano riempiti di tampone. Il gel è ora pronto per essere caricato: utilizzando una pipetta automatica da 25 o 100 microlitri con punte per caricamento gel, inserire il campione proteico in uno o più pozzetti applicando con attenzione il campione come un sottile strato sul fondo dei pozzetti. Caricare i pozzetti di controllo con standard di peso molecolare.

Aggiungere anche un volume uguale di un buffer campione XSDS in ogni pozzetto vuoto per evitare la diffusione delle corsie adiacenti. Siamo ora pronti per iniziare l'elettroforesi su gel. Per eseguire l'elettroforesi, collegare l'alimentatore alla cella ed eseguire a 30 milliampere di corrente costante per un gel a lastra spesso 1,5 millimetri.

Dopo che il colorante indicatore blu al mentolo ha raggiunto il fondo del gel di separazione, scollegare l'alimentatore. Ora che l'elettroforesi è terminata, scartare il tampone di elettroforesi e rimuovere la camera superiore del tampone con il sandwich del gel ad essa collegato. Orientare il gel in modo che sia nota la disposizione dei pozzetti del campione.

Quindi rimuovere il sandwich dalla camera superiore del tampone e appoggiarlo su un foglio di carta assorbente o di carta da cucina. Successivamente, estrarre con attenzione uno dei distanziatori a metà lunghezza a partire dal bordo del sandwich lungo tutta la sua estensione. Utilizzare il distanziatore esposto come leva per sollevare con cautela la lastra di vetro, esponendo così il gel.

Rimuovere il gel dalla piastra inferiore. Tagliare un piccolo triangolo da un angolo del gel in modo da non perdere l'orientamento dei pozzetti durante la colorazione e l'essiccazione. La procedura di elettroforesi su gel è ora completata.

Il gel può ora essere sottoposto a diverse procedure di rilevamento delle proteine. Vi abbiamo appena mostrato come separare le proteine mediante elettroforesi su gel. Questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con il vostro esperimento.