Name: Elettroporazione di micobatteri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-05-23T14:35:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: Scopri l'elettroporazione dei micobatteri per l'ingegneria genetica utilizzando Mycobacterium smegmatis. Questo metodo ottimizzato supera le barriere della parete cellulare per ottenere efficienze di trasformazione elevate.

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elettroporazione di micobatteri

Electroporation of Mycobacteria

Trasformazione ad alta efficienza è una limitazione importante nello studio dei micobatteri. Il Mycobacterium genere può essere difficile da trasformare, questo è principalmente causato dalla parete cellulare spessa e cerosa, ma è aggravata dal fatto che la maggior parte delle tecniche molecolari sono state sviluppate per le specie lontanamente imparentati tra loro come Escherichia coli e Bacillus subtilis. Nonostante questi ostacoli, i plasmidi micobatteri sono stati identificati e la trasformazione del DNA di molte specie di micobatteri sono stati descritti. Il metodo più efficace per l&#39;introduzione di DNA in micobatteri è elettroporazione. Molti parametri contribuiscono alla trasformazione di successo: queste includono la specie / ceppo, la natura del DNA trasformazione, il marcatore utilizzato, il mezzo di crescita, e le condizioni per l&#39;impulso di elettroporazione. Metodi ottimizzato per la trasformazione di entrambi lenta e veloce-coltivatore sono disponibili a questo link. Efficienze di trasformazione per le diverse specie di micobatteri e con diversi marcatori selezionabili sono segnalati.

Strategie di micobatteri patogeni sono ancora limitate. Il tasso di crescita lenta della maggior parte delle specie, la natura impervia della parete cellulare, ed i pericoli di lavorare con agenti patogeni rendono micobatteri difficili da studiare e sono in gran parte responsabili della nostra scarsa conoscenza di questi organismi. In questo video viene mostrata la tecnica di elettroporazione, che coinvolge le cellule sottoporre ad un breve impulso elettrico ad alta per consentire l&#39;ingresso di DNA. E &#39;il metodo più usato per introdurre il DNA nelle cellule dei micobatteri.

Elettroporazione di micobatteri

La trasformazione ad alta efficienza rappresenta una limitazione significativa nello studio dei micobatteri. Il genere Mycobacterium può risultare difficile da trasformare; ciò è dovuto principalmente...

Le strategie patogene dei micobatteri rimangono poco comprese a causa della lenta velocità di crescita della maggior parte delle specie. La natura impermeabile della parete cellulare e i rischi associati al lavoro con agenti patogeni rendono difficile lo studio dei micobatteri e sono in gran parte responsabili della nostra scarsa conoscenza di questi organismi. In questo video, illustreremo la tecnica dell'elettroporazione, che consiste nell'esporre le cellule a un breve e intenso impulso elettrico, il quale permette l'ingresso del DNA.È il metodo più utilizzato per l'introduzione di DNA in cellule micobatteriche. Ciao, sono Ron Good del laboratorio di Tanya Parish del Centro di Malattie Infettive presso i Bats e la London School of Medicine and Dentistry. Oggi vi mostreremo una procedura per l'elettroporazione dei micobatteri.Nel nostro laboratorio studiamo Microbacterium tuberculosis, ma poiché è altamente patogeno e richiede impianti di contenimento di livello C3, vi mostreremo questa tecnica utilizzando il Microbacterium smegmatis non patogeno. Quindi, procediamo ad elettroporare alcuni batteri. Per elettroporare i micobatteri, dobbiamo preparare cellule competenti.È importante ricordare che i micobatteri patogeni rappresentano un importante rischio biologico. Pertanto, tutte le operazioni di coltura e di manipolazione genetica devono essere eseguite in un'adeguata contenimento. Le strutture all'interno di una cappa di sicurezza di classe uno devono prevedere una valutazione del rischio come prima fase di qualsiasi esperimento con micobatteri patogeni.Per preparare queste colture, si parte dal ceppo mantenuto in laboratorio su mezzi solidi come il Lemko, inoculando con un'ansa piena di micobatteri in 5 ml di brodo Lemko contenente tween. Poiché molti micobatteri sono organismi dalla crescita relativamente lenta, è estremamente importante mantenere un'adeguata tecnica asettica per evitare contaminazioni da batteri o funghi che potrebbero superare in crescita i micobatteri. È spesso consigliabile preparare colture duplicate, nel caso in cui una di esse venga contaminata.Le cellule di micobatteri hanno la tendenza ad aggregarsi in coltura a causa del loro spesso rivestimento ceroso. La vortexazione e l'aggiunta di un detergente non ionico come il tween 82 nel mezzo riducono queste aggregazioni e forniscono una sospensione cellulare più omogenea. Dopo l'inoculo, incubare la coltura a 37 gradi Celsius con agitazione a cento giri al minuto per tutta la notte.Dopo la crescita della coltura madre, inoculare una coltura su larga scala di circa cento millilitri di lemko tw in un matraccio conico da 250 millilitri con una diluizione 1:100 della coltura notturna. Continuare l'incubazione a 37 gradi Celsius sotto agitazione per circa 16-24 ore, momento in cui la densità ottica può essere verificata mediante spettrofotometro. Se il valore risulta compreso tra 0,8 e 1, le cellule si trovano nella fase logaritmica ottimale di crescita.In seguito, incubare le cellule sul ghiaccio per 1,5 ore prima del raccolto, il che contribuirà ad aumentare l'efficienza di trasformazione di quattro volte. Incubazioni più lunghe sul ghiaccio provocano una riduzione dell'efficienza. Successivamente, raccogliere le cellule versando le colture in provette di centrifugazione grandi.Centrifugare a 300 G per 10 minuti; dopo la centrifugazione, lavare le cellule tre volte in glicerolo al 10% freddo di ghiaccio, riducendo ogni volta il volume, in modo che per un volume di coltura di cento millilitri, si utilizzino 20 millilitri per il primo lavaggio, poi 10 millilitri e infine 5 millilitri per l'ultimo lavaggio. Dopo i lavaggi, risospendere le cellule in un volume compreso tra un decimo e un centesimo del volume originale di glicerolo al 10% freddo di ghiaccio. A questo punto, le cellule possono essere allicate, congelate e conservate a meno 70 gradi Celsius per utilizzi futuri.L'efficienza di trasformazione aumenta spesso dopo il congelamento delle cellule. Prima di utilizzare queste cellule competenti, queste devono essere scongelate, raccolte mediante centrifugazione e risospese in glicerolo fresco al 10% prima dell'uso. Per effettuare l'elettroporazione, è necessario un elettroporatore, ovvero un apparecchio in grado di erogare un impulso ad alta tensione di 2,5.Si utilizzano chilovolt. I batteri e il DNA vengono collocati nelle cuvette per elettroporazione. E sebbene l'intervallo o la lunghezza del percorso possa essere identico in diverse cuvette, queste variano in base al volume che possono contenere.Utilizziamo regolarmente 200 microlitri di cellule in una cuvetta da 0,2 centimetri per elettroporare le cellule. Preparare innanzitutto il campione di DNA in modo che sia privo di sali e altre impurità. Questo passaggio è importante per ridurre al minimo il rischio di scariche elettriche durante l'elettroporazione.Prima di versare i batteri, assicurarsi che i campioni di DNA siano di elevata purezza. Il rapporto di assorbanza tra 60 e 80 dovrebbe essere vicino a 1,8. Aggiungere da 0,5 a 5 microgrammi di DNA privo di sale, in un volume non superiore a 5 microlitri, a 200 microlitri di sospensione microbatterica. Può essere inclusa un'elettroporazione di controllo senza DNA per verificare la frequenza di mutanti resistenti agli antibiotici.Quindi lasciare la miscela sul ghiaccio per 10 minuti. Questo ridurrà la presenza di cellule vitali nel campione e di sali nella soluzione di DNA, minimizzando così l'arco elettrico dopo l'incubazione sul ghiaccio. Rimescolare accuratamente le cellule con una pipetta o un vortice prima dell'impulso ad alta tensione per risospendere le cellule e garantire una miscelazione completa del DNA. Eventuali aggregazioni cellulari provocheranno arco elettrico e ridurranno l'efficienza di trasformazione.Successivamente, trasferire la miscela in una cuvetta qve con intercapedine elettrodica da 0,2 centimetri precedentemente raffreddata. Ancora una volta, prestare attenzione a non introdurre bolle nella miscela. Inoltre, per ridurre l'arco elettrico.Assicurarsi che l'esterno del qve sia completamente asciutto prima di posizionarlo nella camera dell'impulso. Dopo aver asciugato accuratamente il qve e aver impostato la resistenza del controllore dell'impulso a mille ohm, inserire il qve nella camera di elettroporazione. Successivamente, impostare la tensione a 2,5 kilovolt ed applicare l'impulso fino a quando si sente un segnale acustico, che indica lo scaricamento del condensatore nel QVE.Una costante di tempo superiore a 10 indicherà un'elettroporazione riuscita. Un'elettroporazione non riuscita è generalmente indicata da arcing, che provoca una scintilla, fenomeno spesso evitabile. Modificando la resistenza sul controllo dell'impulso, riporre il Q vet sul ghiaccio per 10 minuti.Dopo l'incubazione, trasferire la sospensione cellulare in un flacone sterile contenente cinque millilitri di brodo lemko TW. È importante diluire le cellule almeno dieci volte immediatamente dopo l'impulso, per favorire il recupero cellulare e aumentare la sopravvivenza dei trasformanti. Successivamente, incubare le cellule a 37 gradi Celsius per due o tre ore; al termine dell'incubazione, raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 3000 G per 10 minuti, quindi sono pronte per essere piastrate.Dopo la centrifugazione, effettuare un'opportuna diluizione del sospensione nel brodo lemko in modo che ogni piastra riceva da 30 a 300 colonie. È importante assicurarsi che le colonie resistenti derivino da una singola cellula; pertanto, verificare che le cellule siano completamente risospese prima della semina. Se le cellule non vengono diluite, può risultare molto difficile visualizzare le colonie realmente resistenti contro uno sfondo di colonie sensibili. Seminare ora le cellule su agar lemko contenente l'antibiotico appropriato.Incubano le piastre a 37 gradi Celsius fino a quando le colonie diventano visibili. Ciò richiederà da tre a cinque giorni dopo la crescita delle colonie. Contare i trasformanti.Per calcolare l'efficienza di trasformazione. Diversi fattori influenzano l'efficienza della trasformazione. Tra questi vi sono la fase di crescita delle cellule al momento del raccolto, il mezzo di elettroporazione e l'intensità del campo e la costante di tempo dell'impulso erogato.L'efficienza della tecnica di elettroporazione dipende anche dalla scelta del DNA per la trasformazione e, a volte, dalla scelta del marcatore selezionabile. Otteniamo regolarmente efficienze comprese tra 10 alla quinta e 10 alla sesta unità formanti colonie per microgrammo di DNA, utilizzando la resistenza all'igromicina o alla streptomicina in ems magma. Per far crescere i trasformanti, si effettua un'agricoltura su piastra dei micobatteri elettroporati su mezzo solido contenente l'agente selettivo.Incubare con antibiotico a 37 gradi per due o tre giorni. Dopo l'incubazione di due o tre giorni, è possibile analizzare i trasformanti secondo le esigenze della maggior parte delle applicazioni; devono essere isolati e analizzati tre trasformanti. È importante verificare l'identità del plasmide extracromosomico dopo la trasformazione.Poiché le delezioni e i riarrangiamenti sono comuni, ti ho appena mostrato come elettrolizzare il mycobacterium s magma. Se hai intenzione di eseguire questa procedura con microrganismi patogeni, ricorda di adottare adeguate misure di sicurezza. Ecco tutto.Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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Fonte: Stefan, A., et al., I benefici multiformi della co-espressione proteica in Escherichia coli. J. Vis. Exp. (2015)Questo video mostra la procedura per trasformare l'Escherichia coli con un plasmide che trasporta un gene di resistenza agli antibiotici, compresa la preparazione cellulare, l'elettroporazione, il recupero e la selezione dei trasformanti.

Preparazione e trasformazione di batteri mediante elettroporazione ad alta tensione

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Rapid Protocollo per la preparazione di elettrocompetenti<em&gt; Escherichia coli</em&gt; E<em&gt; Vibrio cholerae</em

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Elettroporazione di effettori batterici funzionali in cellule di mammifero

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Questo protocollo descrive la cromatografia di esclusione dimensionale, una tecnica facile e riproducibile per arricchire le vescicole extracellulari del Mycobacterium tuberculosis dai supernatanti di coltura.

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Caratterizzazione di sistemi di efflusso multifarmaco in Acinetobacter baumannii utilizzando un ceppo batterico carente di efflusso e un sistema di espressione genica a singola copia

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Scopri l'elettroporazione dei micobatteri per l'ingegneria genetica utilizzando Mycobacterium smegmatis. Questo metodo ottimizzato supera le barriere della parete cellulare per ottenere efficienze di trasformazione elevate.

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