Elettroporazione di micobatteri

Strategie di micobatteri patogeni sono ancora limitate. Il tasso di crescita lenta della maggior parte delle specie, la natura impervia della parete cellulare, ed i pericoli di lavorare con agenti patogeni rendono micobatteri difficili da studiare e sono in gran parte responsabili della nostra scarsa conoscenza di questi organismi. In questo video viene mostrata la tecnica di elettroporazione, che coinvolge le cellule sottoporre ad un breve impulso elettrico ad alta per consentire l'ingresso di DNA. E 'il metodo più usato per introdurre il DNA nelle cellule dei micobatteri.

Le strategie patogenetiche dei micobatteri rimangono poco conosciute, dato che il lento tasso di crescita della maggior parte delle specie è lento. La natura impenetrabile della parete cellulare e i rischi di lavorare con gli agenti patogeni rendono i micobatteri difficili da studiare e sono in gran parte responsabili della nostra scarsa comprensione di questi organismi. In questo video dimostreremo la tecnica dell'elettroporazione, che consiste nel sottoporre le cellule a un impulso elettrico breve ed elevato, che consente l'ingresso del DNA.

È il metodo più utilizzato per introdurre il DNA nelle cellule micobatteriche. Ciao, sono Ron Good del laboratorio di Tanya Parish del Center of Infectious Disease at the Bats e della London School of Medicine and Dentistry. Oggi vi mostreremo una procedura per l'elettrofunzionamento dei microbatteri.

Nel nostro laboratorio studiamo il microbatterio tubercolosi, ma poiché è altamente patogeno e richiede strutture di contenimento del C3, vi mostreremo questa tecnica nel microbatterio non patogeno m Mcma. Quindi mangiamo un po' di batteri. Per mangiare micobatteri, dobbiamo creare cellule competenti.

È importante ricordare che i micobatteri patogeni rappresentano un importante rischio biologico. Pertanto, tutta la coltura e la manipolazione genetica devono essere effettuate in un contenimento appropriato. La valutazione del rischio deve costituire la prima parte di qualsiasi esperimento con micobatteri patogeni.

Per realizzarli, si parte dalla coltura che è stata mantenuta in laboratorio su terreni solidi come lemko, coclea inoculata, cinque mils Lemko contenenti brodo tween con un anello pieno di micobatteri. Poiché molti micobatteri sono organismi a crescita relativamente lenta, è estremamente importante mantenere una buona tecnica asettica per prevenire la contaminazione di queste colture con batteri di funghi che possono rapidamente superare i micobatteri. Spesso è saggio impostare colture duplicate nel caso in cui una venga contaminata.

Le cellule dei micobatteri hanno la tendenza ad aggregarsi in coltura a causa del loro spesso rivestimento ceroso. Il vortice e l'aggiunta di detergenti non ionici come il terreno tween 82 riducono questa aggregazione e forniscono una sospensione più omogenea delle cellule. Dopo l'inoculazione, incubare la coltura a 37 gradi Celsius agitando a cento giri al minuto durante la notte.

Dopo che la coltura starter è cresciuta, inoculare una coltura su larga scala circa un centinaio di mil di lemko tw in un pallone conico da 250 mil con una diluizione da uno a 100 della coltura notturna. Continuare l'incubazione a 37 gradi Celsius con agitazione per circa 16-24 ore, momento in cui la densità ottica può essere controllata con lo spettrofotometro. Se legge 0,8 a uno, le cellule sono nella loro fase logaritmica ottimale di crescita.

Successivamente, incubare le cellule su ghiaccio per 1,5 ore prima del raccolto, il che contribuirà ad aumentare di quattro volte l'efficienza della trasformazione. Maggiore. Le incubazioni sul ghiaccio comportano una riduzione dell'efficienza. Successivamente, raccogliere le cellule versando le colture in grandi provette da centrifugazione.

Centrifugare a 300 Gs per 10 minuti dopo la centrifugazione lavare le cellule tre volte in ghiaccio freddo, il glicerolo al 10% riduce il volume ogni volta, in modo tale che per un volume di coltura di un centinaio di pasti, vengono utilizzati 20 pasti per il primo lavaggio, poi 10 mil e infine cinque mil per l'ultimo lavaggio. Dopo i lavaggi, sospendere nuovamente le cellule in uno a 10 a uno a cento del volume originale di ghiaccio freddo. 10% di glicerolo in questa fase, le cellule possono essere aliquotate, congelate e conservate a meno 70 gradi Celsius per un uso futuro.

L'efficienza di trasformazione spesso aumenta dopo il congelamento delle cellule. Prima di utilizzare queste cellule competenti, devono essere scongelate, raccolte mediante centrifugazione e risospese in glicerolo fresco al 10% prima dell'uso. Al fine di parata elettrica, ems mag un elettro, che è un apparecchio in grado di fornire un impulso ad alta tensione di 2,5.

Vengono utilizzati i kilovolt. I batteri e il DNA vengono posti in elettroporazione, cuvette. E sebbene la distanza o la lunghezza del percorso possano essere le stesse in cuvette diverse, variano rispetto al volume che possono contenere.

Usiamo abitualmente 200 microlitri di cellule in una quantità di 0,2 centimetri per mangiare le cellule. Innanzitutto, prepara il campione di DNA in modo che sia privo di sali e altri contaminanti. Questo è importante per ridurre al minimo le possibilità di formazione di archi elettrici durante l'elettroporazione.

Prima di porare i batteri, assicurati che i tuoi campioni di DNA siano di elevata purezza. Il rapporto di assorbimento due 60 a 2 80 dovrebbe essere vicino a 1,8. Aggiungere da 0,5 a cinque microgrammi di DNA privo di sale in non più di cinque microlitri di volume a 200 microlitri di sospensione microbatterica, può essere inclusa un'elettroporazione di controllo senza DNA per verificare la frequenza dei mutanti di resistenza agli antibiotici.

Quindi lasciare il composto in ghiaccio per 10 minuti. Ciò ridurrà la presenza di cellule vitali nel campione e di sali nella soluzione di DNA, riducendo al minimo l'arco elettrico dopo l'incubazione del ghiaccio, ridistribuirà accuratamente le cellule con una pipetta o un vortice prima dell'impulso ad alta tensione per risospendere le cellule e garantire la miscelazione del DNA. Qualsiasi aggregazione delle celle porterà alla formazione di archi elettrici e ridurrà l'efficienza della trasformazione.

Quindi, trasferire la miscela in una taratura per elettrodi da 0,2 centimetri pre-raffreddata. Anche in questo caso, fare attenzione a non introdurre bolle nell'impasto. Anche per ridurre l'arco elettrico.

Assicurarsi che l'esterno del qve sia completamente asciutto prima di metterlo nella camera degli impulsi. Dopo aver asciugato accuratamente il qve e con la resistenza del regolatore di impulsi impostata a mille ohm, posizionare il qve nella camera di elettroporazione. Quindi, dopo aver impostato la tensione a 2,5 kilovolt, applicare l'impulso fino a quando non viene emesso un segnale acustico, che indica che il condensatore nel QVE si è scaricato.

Una costante di tempo superiore a 10 indicherà un successo dell'elettroporazione. L'elettroporazione non riuscita è solitamente indicata da un arco elettrico, che provoca una scintilla, che spesso può essere evitata. Modificando la resistenza sul controller a impulsi, rimettere il Q vet sul ghiaccio per 10 minuti.

Dopo l'incubazione, trasferire la sospensione cellulare in un flacone universale sterile contenente cinque mil di brodo lemko TW. È importante diluire le cellule almeno dieci volte subito dopo l'impulso per aiutare le cellule a riprendersi e aumentare la sopravvivenza dei trasformanti. Successivamente, incubare le cellule a 37 gradi Celsius per due o tre ore, quindi sono pronte per essere piastrate dopo l'incubazione, raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 3000 G per 10 minuti.

Dopo la centrifugazione, effettuare un'adeguata diluizione della sospensione nel brodo di lemko in modo tale che ogni piastra ottenga da 30 a 300 colonie. È importante assicurarsi che le colonie resistenti siano sorte da una singola cellula, quindi assicurati che le cellule siano accuratamente risospese prima della placcatura. Se le cellule non sono diluite, può essere molto difficile visualizzare colonie veramente resistenti su uno sfondo Prato di cellule sensibili ora piastra le cellule sulla coclea di lemko con l'antibiotico appropriato.

Incubano le piastre a 37 gradi Celsius fino a quando le colonie diventano visibili. Questo richiederà dai tre ai cinque giorni dopo che le colonie sono cresciute. Conta i trasformanti.

Per calcolare l'efficienza della trasformazione. Diversi fattori influenzano l'efficienza della trasformazione. Questi includono la fase di crescita delle cellule quando vengono raccolti i mezzi di elettroporazione e l'intensità di campo e la costante di tempo dell'impulso erogato.

L'efficienza della tecnica di elettroporazione dipende anche dalla scelta del DNA per la trasformazione, e talvolta dalla scelta del marcatore selezionabile. Otteniamo abitualmente efficienze da 10 al quinto, a 10 al sesto colonie per microgrammo, DNA, utilizzando la resistenza all'igromicina o alla streptomicina nel magma ems. Ora, per far crescere i trasformanti, striare i micobatteri elettroporati su un mezzo solido più la selezione.

Incubare l'antibiotico a 37 gradi per due o tre giorni. Dopo l'incubazione di due o tre giorni, è possibile analizzare i trasformanti come richiesto per la maggior parte delle applicazioni, tre trasformanti devono essere strisciati e analizzati. È importante verificare l'identità del plasmide extra cromosomico dopo la trasformazione.

Poiché le delezioni e i riarrangiamenti sono comuni, ti ho appena mostrato come elettrolizzare il magma del micobatterio. Se hai intenzione di eseguire questa procedura con microbatteri patogeni, ricordati di utilizzare misure di sicurezza adeguate. Quindi questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.