Topo Epidermal cresta neurale delle cellule staminali (EPI-NCSC) Culture

Ciao, sono Maya Sibu Bloom dell'Istituto di Genetica Umana e del Northeast England Stem Cell Institute dell'Università di Newcastle. E questo è del Medical College del Wisconsin. Oggi vi mostreremo il nostro procedimento per preparare Al Explan da follicoli viscosi di topi.

I bulbi piliferi sono il tessuto di partenza per la preparazione di colture di cellule staminali neurali dermiche. Questa procedura prevede la dissezione del cuscinetto dei baffi e la microdissezione dei follicoli piliferi, seguita dall'isolamento dei BUL e dal loro posizionamento in una piastra da coltura. Cominciamo dunque.

Questa procedura inizia con la dissezione del bulbo dai follicoli dei peli vibrissali di topo adulto. In genere utilizziamo topi di età compresa tra due e sei mesi, tuttavia i topi più giovani tendono a fornire un numero maggiore di cellule staminali. Gli animali vengono anestetizzati e immersi completamente in una miscela uno a uno di Betadine e perossido di idrogeno per circa tre minuti a scopo disinfettante, quindi si irrorano interamente il topo, in particolare la regione facciale, con etanolo al 75% e lo si trasferisce al microscopio stereoscopico.

Nell'armadietto a flusso laminare, dissezionare con cura i cuscinetti WHI, evitando di tagliare i bulbi piliferi, e porli in soluzione salina equilibrata ad temperatura ambiente. Per dissezionare i follicoli WHI, tenere la pelle accanto al follicolo con una pinzetta e quindi tagliare intorno al follicolo con forbici dritte. Tagliare in profondità.

Per evitare di danneggiare i bulbi piliferi, sollevare il follicolo del vibrisso dal cuscinetto dei vibrischi e trasferirlo in una nuova piastra. Con HBSS fresco, trasferire i follicoli nella stessa piastra. Fissare un follicolo pilifero con pinze affilate e aghi su una piastra di Petri in vetro rivestita con garza di seta contenente HBSS.

Sciacquare il tessuto adiposo lasso e il tessuto dermico con getti di tampone finché il follicolo del vibrisso non è pulito. Se necessario, tagliare il nervo del follicolo del vibrisso e rimuovere i tessuti aderenti raschiando e ripetendo più volte lo sciacquo con HBSS. Tagliare longitudinalmente il follicolo visco con una microlama.

Evitare di tagliare troppo in profondità poiché ciò danneggerebbe il rigonfiamento. Rimuovere qualsiasi traccia di sangue con ripetuti lavaggi con HBSS fino a quando non scompare. La comparsa di sangue è un buon indicatore del fatto che il taglio è stato abbastanza profondo.

Successivamente, effettuare un taglio trasversale al di sopra del livello del seno conesso e successivamente un secondo taglio trasversale a livello del seno anulare, molto vicino alla pelle, all'interno del frammento isolato del follicolo. Ora si potrà osservare il rigonfiamento all'interno della capsula. Ecco, si vede qui.

Prendere un'estremità della capsula con la pinzetta ed eliminare il rigonfiamento. Ora si vedrà la capsula vuota e il pool di rigonfiamenti isolati. Posizionare i rigonfiamenti isolati in una piastra di coltura separata in HBSS a temperatura ambiente.

Assicurarsi che nessun altro tessuto stia contaminando i bulbi raccolti. A questo punto, i bulbi possono essere coltivati prima della coltura in piante bulbo. Le piastre di coltura da 35 millimetri vengono rivestite con collagene posizionando gocce di 50 microlitri di collagene e 10 microlitri sterili.

Soluzione salina al 6% una accanto all'altra. Mescolare bene con una pipetta doppia piegata e spingere verso il bordo della piastra di coltura; incubare tutta la notte in un ambiente pulito, senza far asciugare. A tale scopo, utilizziamo un essiccatore con una piastra contenente acqua sul fondo.

Il giorno successivo, giorno della coltura. Lavare le piastre con soluzione fisiologica, pre-incubare le piastre per la coltura rivestite con collagene e risciacquate per circa tre ore. Con mezzo di coltura nell'incubatrice; il mezzo di coltura è costituito da 85%alpha MEM modificato, 10% siero fetale bovino e 5% estratto di embrione di pollo del giorno 11.

Dopo il pre-incubazione, rimuovere il mezzo di coltura dalle piastre e aggiungere diverse BUL con il minor quantitativo possibile di mezzo. Rimuovere il mezzo di coltura in eccesso. Incubare per un'ora nell'incubatrice cellulare in un'atmosfera umidificata con 10% di ossigeno e 5% di CO2.

Dopo un'ora, aggiungere lentamente 1,5 millilitri di coltura. Le piante di media grandezza dovrebbero aderire al substrato di collagene; sostituire il 50% del mezzo di coltura ogni giorno. Ok, ora andiamo avanti.

E ora un'occhiata alle colture. Entro tre o quattro giorni, cellule altamente migratorie emigreranno dai grumi cellulari. Si osservi la loro morfologia stellata e la predominante assenza di contatti tra cellula e cellula.

Nel corso dei prossimi giorni, altre cellule emigreranno e le cellule già emigrate prolifereranno rapidamente, inclusi rari tipi cellulari con morfologia appiattita, che a volte diventano evidenti alcuni giorni dopo le cellule della cresta neurale epidermica. A volte si osservano cellule staminali in queste colture. Queste cellule non sono cellule staminali della cresta neurale epidermica, ma piuttosto cellule staminali epidermiche putative, meno mobili, o progenitori; le colture costituite da queste cellule devono essere scartate.

È stato appena mostrato come preparare colture di espianti bulbari che contengono cellule staminali neurogeniche epidermiche. Poiché le cellule neurogeniche sono altamente migratorie, abbandoneranno l'espianto bulbare entro tre o quattro giorni. Dopo l'espianto, il bulge viene quindi rimosso e rimane in piastra una popolazione pura di cellule neurogeniche.

Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di disinfettare attentamente il topo per evitare contaminazioni. Si deve inoltre praticare un taglio profondo nel cuscinetto del rischio, in modo da non danneggiare i follicoli piliferi. Per quanto riguarda le colture, è fondamentale distinguere tra la frazione migratoria, costituita da cellule della cresta neurale, e i cheratinociti non migratori dalla caratteristica forma a selciato.

Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.