Evoluzione molecolare del ricombinasi Tre

Mi chiamo Frank Alz. Sono un responsabile di gruppo presso l'Istituto Maxx Plunk per la Biologia e la Genetica delle Cellule Maculari di Dresda. E ora parlerò del nostro lavoro volto a sviluppare ricombinasi specifiche per il sito per la chirurgia molecolare.

Fondamentalmente come strumento per poter escindere sequenze predefinite dal genoma, e più specificamente per tentare di eliminare le cellule infette dal virus. Fondamentalmente, quindi, per escindere il provirus HIV dal genoma delle cellule infette. Un altro concetto è che adattiamo uno strumento genetico già ben consolidato, ovvero la ricombinasi Cre, affinché si leghi, riconosca e utilizzi un sito bersaglio da noi predefinito.

Pertanto, ci siamo proposti di verificare se fosse possibile creare una ricombinasi specifica per un sito che si verifica naturalmente nell'LTR di un virus HIV. E se fossimo stati in grado di farlo, avremmo previsto che sarebbe stato possibile rimuovere il provirus dal genoma. Fondamentalmente, il ciclo vitale del virus prevede una fase in cui il virus si integra nelle cellule e, attraverso la trascrizione inversa, genera un template di DNA delimitato da due ripetizioni terminali.

Vengono chiamati ripetizioni terminali lunghe o LTR brevi. Queste vengono quindi trasportate nel nucleo e si integrano più o meno casualmente nel genoma dell'ospite. A questo punto si ha una situazione in cui è presente un cosiddetto provirus, che è integrato e delimitato da due ripetizioni terminali lunghe, ovvero da due LTR.

Il concetto era che, se fossimo stati in grado di creare una ricombinasi in grado di riconoscere una sequenza presente nell'LTR, avremmo potuto escindere il provirus sotto forma di ciclo dal genoma dell'ospite ed eliminare quindi il virus dalle cellule. Questa era l'idea concettuale. Beh, la ricombinasi è in realtà una proteina legante il DNA e individua un sito molto specifico.

Pertanto, possiede un dominio di legame al DNA, che riconosce una certa sequenza all'interno del DNA. E solo quando trova questa sequenza esatta, l'enzima diventa attivo. Non è attivo su nessuna delle altre sequenze.

I principi dell'evoluzione molecolare sono sostanzialmente noti a chiunque, poiché non sono altro che allevamento. Dunque, un principio dell'evoluzione molecolare è che si introducono mutazioni e poi si attua un processo di selezione, scegliendo una determinata proprietà. È la stessa cosa che si fa nell'allevamento delle piante.

Sai di volere determinate caratteristiche, come una certa dimensione o un certo colore, e poi selezioni sempre nuovamente, per la generazione successiva, la progenie che presenta tali caratteristiche, iniziando a incrociarle tra loro. È esattamente ciò che facciamo anche con le molecole. Si tratta, fondamentalmente, della stessa cosa, ma su scala ridotta.

Quindi partiamo da un enzima che possiede una certa attività, nel nostro caso la ricombinasi CRE, e da una proteina di tipo selvaggio. Successivamente introduciamo una leggera mutazione nel sito a cui questa ricombinasi si lega, che tuttavia mantiene un'attività estremamente, estremamente, estremamente bassa. Poi introduciamo mutazioni casuali nell'enzima, nella ricombinasi, e selezioniamo i mutanti che ora sono in grado di legarsi a questo sito mutato.

Ottenuto ciò, possiamo quindi combinare tra loro i diversi mutanti per arrivare infine al prodotto finale desiderato, in modo che la ricombinasi riconosca la sequenza che abbiamo definito nell'LTR. Quindi, come detto, partiamo con una libreria di mutagenesi casuale. Questa operazione viene tipicamente eseguita mediante PCR soggetta a errori.

Pertanto, utilizziamo condizioni di PCR che, ad esempio, impiegano una polimerasi con elevata frequenza di errori. In questo modo generiamo una libreria casuale che presenta mutazioni in molteplici posizioni. Possiamo anche utilizzare una ceppo mutatore, un ceppo batterico mutatore, che introduce numerose mutazioni in determinati trascritti.

E questi vengono quindi utilizzati come materiale di partenza. L'altra tecnologia che utilizziamo è che, dopo un certo periodo, impieghiamo un DNA shuffling. Si tratta essenzialmente di una tecnologia che consente di combinare diverse mutazioni vantaggiose, poiché non si sa esattamente quale delle mutazioni sia vantaggiosa, ma si avranno diversi mutanti che presentano mutazioni differenti.

Quindi si ha un gene che presenta una mutazione qui, la quale è vantaggiosa. Si ha una seconda copia che presenta una mutazione in un altro punto, e per unire queste due mutazioni, si procede con una frammentazione casuale dei diversi frammenti, che vengono poi riuniti in una reazione PCR per riassemblare i prodotti. A questo punto, con una certa frequenza, si otterrà una combinazione dei due in cui una parte della ricombinazione deriva da questo mutante e un'altra parte da quell'altro mutante.

E poi quest'uomo qui avrà un effetto aggiuntivo che migliorerà e, e permetterà, sarete in grado di selezionare molto più rapidamente i candidati che possiedono le proprietà desiderate. Quindi imposterei la definizione specificando che la proteina di tipo selvaggio non ha assolutamente alcuna attività su un certo sito. Quindi, se prendiamo ad esempio la nostra sequenza selezionata dall'LTR, dall'H-I-V-L-T-R, se proviamo la cre ricombinasi sulla sequenza, non avrete assolutamente alcuna attività.

La ricombinasi CRE non è in grado di ricombinare il sito e, per definizione, si ottiene una nuova ricombinasi quando si dispone di un enzima capace di legare e ricombinare questa sequenza. Non abbiamo predeterminato il numero di cicli da eseguire, ma abbiamo effettuato tanti cicli quanti necessari fino a ottenere un enzima con l'attività desiderata. Abbiamo quindi iniziato con mutazioni molto lievi nel sito, per poi cominciare a combinare tra loro le diverse mutazioni.

Questo era uno dei passaggi importanti per cui questo processo funzionava. Abbiamo quindi esaminato degli intermedi ed è stato necessario effettuare numerosi cicli per individuare un enzima sufficientemente attivo da passare al ciclo successivo. È molto simile a qualsiasi processo di selezione.

Si stabilisce una determinata attività desiderata, una certa caratteristica che si vuole ottenere, quindi si inizia l'allevamento. E finché non si ottiene ciò che si desiderava, non si è arrivati al risultato e si devono effettuare ulteriori generazioni. È sostanzialmente questo il principio.

Vorrei anche precisare che i 120 cicli di evoluzione, o per essere esatti centoventotto, hanno permesso soltanto di individuare un passaggio intermedio in cui abbiamo affermato: "ora possiamo fermarci perché abbiamo ottenuto una certa attività". Le ricombinasi attualmente disponibili sono ancora meno attive rispetto alla ricombinasi CRE nel suo sito di tipo selvatico. Pertanto, per ottenere una ricombinasi più attiva, sarebbe necessario effettuare ulteriori cicli di evoluzione.

Quindi, in pratica, non si conclude qui, dove siamo ora nel processo evolutivo. Non vedo limitazioni tecniche. È discutibile fino a che punto si può spingere questo processo.

Quindi i loci sul lato LTR, ovvero la sequenza presente nell'LTR HA, condividono una similarità del 50% con la sequenza del locus naturale sul lato P, ovvero il lato naturale riconosciuto dall'enzima che media la ricombinazione. La domanda è quindi: si può spingere ulteriormente questo limite? Non lo sappiamo ancora, ma il fatto che abbiamo solo una similarità del 50% con il sito di tipo selvaggio suggerisce che ciò sia possibile. La ricombinasi funziona bene nelle cellule di cultura tessutale umana, anche se, come detto, non è altrettanto attiva della ricombinasi query sul suo sito specifico.

Quindi probabilmente la stabilità è in qualche modo inferiore rispetto alla ricombinasi della sequenza in esame, ovvero l'enzima di tipo selvatico, e sarebbero necessarie ulteriori selezioni e ulteriori cicli di evoluzione per migliorare queste caratteristiche in futuro. Il primo passo consiste quindi nel migliorare il sito, questa specifica ricombinasi, la ricombinasi tre, renderla più attiva, magari individuare altri siti particolarmente evidenti che potrebbero rappresentare buoni bersagli in un LTR e trovare una ricombinasi molto efficace per questo scopo. Successivamente, sarebbe necessario testare questa ricombinasi in diversi saggi, inizialmente nuovamente in cellule di coltura tissutale, ma poi, cosa molto importante, in modelli animali.

Pertanto, dovremmo verificare se questa ricombinasi ha effetti collaterali indesiderati in un organismo. E poi, ovviamente, un aspetto molto complesso consiste nello sviluppare un buon sistema di somministrazione per questa ricombinasi, il che non è affatto semplice. Si tratta di un intero settore di ricerca da sviluppare.

Si trattava essenzialmente di un approccio di terapia genica che avremmo dovuto adottare. Beh, credo che stiamo assistendo a un passaggio della medicina verso una dimensione sempre più molecolare. E, naturalmente, per questo abbiamo bisogno di strumenti che ci permettano di operare su tale scala.

E qui è dove vedo il futuro del processo evolutivo. Dobbiamo quindi creare enzimi su misura che agiscano su un processo che desideriamo particolarmente sfruttare; nel caso della ricombinasi, si potrebbe fare un’analogia con uno strumento per un chirurgo che, durante un intervento, deve asportare qualcosa di specifico. Abbiamo ora bisogno di strumenti con cui un chirurgo molecolare possa asportare in modo specifico un determinato frammento di DNA dal genoma.

E per questo, ha bisogno degli strumenti necessari per poterlo fare. L'evoluzione molecolare può quindi sostanzialmente svolgere questa funzione. Esistono molti enzimi in natura che possiedono proprietà molto desiderabili per poter compiere questa azione.

E dobbiamo semplicemente adattarli alle nostre esigenze, in modo da renderli utili. E ritengo che l'evoluzione molecolare possa svolgere un ruolo molto importante in questo contesto. Al momento è difficile stabilire quali siano i limiti, poiché questa tecnologia, questo campo, è ancora in una fase embrionale.

Quindi il tempo rivelerà quali sono i limiti. Sono sicuro che ce ne saranno alcuni, ma al momento attuale, penso che le opportunità siano maggiori rispetto ai veri limiti.