Intervista: HIV-1 DNA provirale escissione Utilizzando un ricombinasi Evolved

Mi chiamo JohE Hvar e mi sto dirigendo verso il Dipartimento di Biologia Cellulare e Biologia, l'HE Pet Institute di Amburgo, in Germania. L'HE PET Institute è un istituto di ricerca di base che si concentra esclusivamente sull'ep umana, sui virus patogeni e sì, e sulle questioni connesse, direi. Quindi il nostro dipartimento è principalmente interessato allo studio della regolazione dell'espressione genica dell'HIV e all'interazione in particolare intracellulare dell'HIV con i componenti della cellula ospite.

Sulla base di questi dati, cerchiamo anche di sviluppare terapie sperimentali e sperimentali per la malattia da HIV. Il problema con l'HIV è che l'HIV è un retrovirus o lentivirus e, come ogni retrovirus, l'HIV si integra dopo l'infezione della cellula ospite, il genoma virale nel genoma della cellula ospite. Finora, non ci si può più sbarazzare del provirus integrato.

Ciò significa che, in termini di terapia, stiamo parlando di una malattia cronica con una terapia che dura tutta la vita e fondamentalmente con tutti i problemi connessi alle terapie che durano tutta la vita, come gli effetti collaterali dei farmaci, l'insorgenza di resistenza e così via. Ebbene, da molti anni nella ricerca di base, conosciamo la cosiddetta ricombinasi, che si verifica naturalmente nelle ricombinazioni come nel lievito o nei batteri, per esempio. E queste ricombinazioni sono sequenze di DNA specifiche riconosciute e mescolano i geni e riarrangiano il genoma e così via.

E in particolare una ricombinasi chiamata ricombinazione decre viene utilizzata nella ricerca di base e il situ nella ricerca di base. E CRE sta fondamentalmente riconoscendo la sua sequenza specifica. E se si dispone di una sequenza situata tra due siti di riconoscimento, CRE è in grado di asportare sostanzialmente la sequenza intermedia.

Quindi l'idea già da 10 o 15 anni è quella di sradicare il virus e, dall'altra parte, di usare la ricombinasi come il dolore, per esempio, per asportare il profilo. DNA, questo dovrebbe essere in teoria possibile perché al momento dell'infezione, l'HIV trascrive inversamente, il suo genoma RA in DNA e, e a causa di questa sequenza di processo di trascrizione inversa chiamata le lunghe ripetizioni terminali sono generate e segnano fondamentalmente i cinque bris o l'inizio e il bordo del brime libero, la fine del profilo integrato D.So in teoria, se si potesse arrivare a una ricombinazione a tre, che re riconosce specificamente in una sequenza nel LTR, così sarebbe, il non d'accordo attaccherebbe fondamentalmente l'estremità a cinque primi e l'estremità BRI libera del profilo integrato, il DNA asporterebbe il DNA e sostanzialmente sradicherebbe il virus dalla cellula disinfettata. Ora, il problema con l'HIV è che abbiamo diversi isolati forse anche in, in, in, in un, in una singola persona, in un singolo paziente, tuttavia, in particolare per quanto ne sappiamo finora, la sequenza è all'inizio e alla fine del virus del genoma virale.

Quindi, in altre parole, gli LTR sono più conservati rispetto, ad esempio, ai geni dell'HIV. Quindi penso che ci siano buone possibilità che possiamo cavarcela con solo pochi numeri di ricombinazione che fondamentalmente riconoscono la vasta maturità di tutti gli isolati di HIV. E se non lo è, in pratica allora dobbiamo generarne uno nuovo per evoluzione molecolare, che possa essere in futuro semi autotomizzato.

E lo farà, il processo sarà molto più veloce che farlo in laboratorio. Nel nostro collega, il Dr.Frank dell'Istituto Max Splunk è entrato in scena alla fine del quadro. Fondamentalmente è un esperto di ricombinasi e tutto il resto.

Fondamentalmente quello che ha usato è quello che chiamiamo un metodo di evoluzione molecolare. Ma il metodo si basa sulla tecnologia di reazione a catena del polimero PCR. E prende il gene dei pettini di grado ricombinasi presenti in natura e imposta una PCR o reazioni di PCR multiple in condizioni che introducono in modo casuale mutazioni.

E il trucco è ora quello di selezionare le nuove versioni della ricombinasi che hanno acquisito una nuova capacità o una nuova attività, vale a dire il riconoscimento di sequenze specifiche dell'HIV. E lo sta facendo in cicli ripetuti. Lui, lui, ha impiegato circa 120 o più cicli per fare questo metodo molecolare, questo tipo di evoluzione molecolare.

Quando finalmente ha trovato questo specifico, ora chiamato tre per la ricombinazione specifica LTR con questa nuova ricombinanza che ora riconosce specificamente le sequenze dell'HIV. Quindi lo studio iniziale qui è stato, gli, gli esperimenti con i ricombinanti sono stati eseguiti qui all'HE PET Institute di Amburgo. E quello che abbiamo fatto è stato soprattutto consegnare questa ricombinazione con vettori, vettori genici in colture cellulari umane che erano state infettate con un isolato più o meno clinico di H HIV V.

E nel tempo, nell'arco di sei-otto settimane, siamo stati in grado di dimostrarlo. Ora il ricombinante è eccitante quantitativamente, hanno integrato il profilo HIV DA, fondamentalmente l'intera coltura viene curata sbarazzandosi dell'HIV. Ci sono sicuramente numerosi problemi con questa tecnologia.

Prima di tutto, dobbiamo assicurarci che l'espressione della ricombinasi non causi effetti collaterali tossici. Non ce lo aspettiamo, perché per le ricombinazioni naturali come il gre, esistono i cosiddetti animali transgenici. Esprimono questa ricombinazione GRE e va bene, quindi ci sono alcuni problemi, ma non troppo significativi.

Potrei dirlo a questo punto. Quindi c'è la speranza che non ci siano effetti collaterali tossici, ma non si sa mai quando si devono fare gli esperimenti. E ci sono anche problemi che forse non riconosceremo tutti gli isolati clinici con esso in modo da ottenere, possiamo sbarazzarci dell'isolato dominante, l'isolato dell'HIV in un paziente.

Ma sceglieremo tra isolati minori, minori nel tempo. Questo, non lo sappiamo, dobbiamo fare questi esperimenti. Poi c'è un grosso problema con la consegna del gene, con la tecnologia dei vettori.

Dobbiamo utilizzare i cosiddetti vettori lentivirali o anche vettori retrovirali per veicolare il gene o il gene della ricombinasi. Quindi ci sono effetti collaterali? Ci sono, questi vettori causano effetti tossici?

Queste sono tutte le domande che ci siamo. Inoltre, speriamo di migliorare l'attività dei favi. Loro, la ricombinazione sta agendo solo più velocemente di quanto vediamo ora, un paio di settimane, l'attività.

Quindi queste sono tutte domande aperte che dobbiamo sviluppare nei prossimi anni. E questo è ora certamente il problema perché le ricombinasi non sono disponibili per via orale. Quindi non ci sarà nessuna pillola, la pillola della ricombinasi va bene, e ci si libera del virus.

Quindi, ma speculando sulla terapia futura, dobbiamo pensare agli approcci di terapia genica. Quindi forse si può concepire che isoliamo le cosiddette cellule staminali ematopoietiche o cellule CD 34 positive dal sangue di pazienti con infezione da HIV. E poi in laboratorio introduciamo il gene per i favi nelle cellule di questo paziente.

Infine, reintroduciamo, reiniettiamo il paziente, freniamo, infondiamo le cellule del paziente e ora hanno modificato geneticamente le cellule del paziente nella schiena dello stesso paziente. Quindi quello che dovrebbe accadere è che il sistema immunitario o il sistema ematopoietico del paziente si ricostituisca nel tempo almeno parzialmente con cellule che dopo l'infezione da HIV, possono liberarsi del virus perché ora esprimono una ricombinasi. Quindi l'effetto sarebbe che una carica virale diminuirà nel paziente ma migliorerà la qualità della vita, certamente.

E possiamo anche sperare che il sistema immunitario si stia ricostituendo in questi pazienti, almeno parzialmente. Quindi ora la, la, la funzione, le, le cellule immunitarie che sono completamente funzionali, saranno in grado, si spera, di attaccare le cellule infette rimanenti in questi pazienti. Se possiamo o meno sradicare completamente e totalmente l'HIV da un paziente, non possiamo dirlo in questo momento.