Generazione di Stabile transgenici C. elegans Utilizzando Microiniezione

Sea elegance è un organismo modello incredibilmente utile sia per la nostra conoscenza delle sue linee cellulari che per la ricchezza di informazioni prodotte dall'aver sequenziato e analizzato il suo intero genoma. In questo video, dimostriamo il processo di micro iniezione di plasmidi in Sea Elegance e la selezione di prole transgenica utilizzando la microscopia a fluorescenza Come animale trasparente e multicellulare, Sea Elegance è ideale per visualizzare in vivo transgeni che esprimono proteine marcate in fluorescenza. Ciao, mi chiamo Laura Berkowitz e sono una ricercatrice associata presso il Caldwell Lab del Dipartimento di Scienze Biologiche dell'Università dell'Alabama.

E io sono Adam Knight, anche lui del Calwell Lab dell'Università dell'Alabama. Oggi ti mostrerò come prepararti ed eseguire la microiniezione di plasmina per generare l'eleganza del mare transgenico e ti mostrerò come selezionare e mantenere le linee di eleganza della foca transgenica. Quindi iniziamo.

Prima di iniziare la microiniezione, abbiamo alcuni passaggi di preparazione, che vi mostrerò ora. Innanzitutto, preparare il DNA plasmidico da iniettare, sono necessari due plasmidi, uno che codifica l'espressione tissutale specifica del nostro gene di interesse e il secondo che fornisce un marcatore di trasformazione selezionabile. Mescola i plasmidi insieme in un rapporto uno a uno di 50 nanogrammi per microlitro.

Successivamente, prepara i cuscinetti della coclea, che verranno utilizzati per immobilizzare i vermi per l'iniezione. Per realizzare i cuscinetti della coclea, posizionare prima diversi vetri di copertura da 22 x 50 millimetri sul piano di lavoro. Usando una pipetta da pascolo, posizionare una goccia di 2%agros fuso su un vetro di copertura e posizionare immediatamente un secondo bicchiere di copertura sopra la goccia con un angolo di 90 gradi rispetto al primo.

Lasciare solidificare l'aerodinamica per alcuni secondi, quindi rimuovere il vetro di copertura superiore. Il diametro del disco appiattito di aero dovrebbe essere compreso tra 15 e 20 millimetri. Come un animale domestico, lascia asciugare completamente il tappetino all'aria per diverse ore o durante la notte.

Una volta asciutti, conservare i tamponi in una scatola di vetro a temperatura ambiente. Quindi, prepara i caricatori di aghi per la soluzione di DNA. Per fare questo, prendi un tubo capillare da cento microlitri e scaldalo nel mezzo di una fiamma libera e tiralo rapidamente a circa il doppio della sua lunghezza.

Una volta che il tubo capillare si è raffreddato, separare le due metà. Accumulare da 10 a 20 caricatori di aghi per iniezione. Puoi conservarli in posizione verticale in una provetta da microcentrifuga.

Brack, stai attento. Le punte del caricatore dell'ago sono molto affilate. Ora fai i micro aghi per iniezione.

Questi aghi sono costituiti da uno speciale tubo capillare che contiene un filamento di vetro interno. Questo filamento funge da stoppino per la soluzione di DNA. Per realizzare gli aghi utilizziamo un Niki PP otto 30 Polar Con un'impostazione di calore di 24,8, vengono tirati più aghi alla volta per la conservazione.

È possibile montare più aghi su una striscia di argilla da modellare. Piccoli frammenti di vetro di copertura verranno utilizzati per aprire la punta dell'ago estratta. Questi frammenti vengono preparati avvolgendo un vetro di copertura di 18 x 18 millimetri in una salvietta Kim e applicando delicatamente una pressione fino a quando non si rompe in più pezzi.

Utilizzare frammenti di dimensioni di circa tre per quattro millimetri. Oltre a preparare il DNA e gli aghi, prepara da 50 a 100 correttamente messi in scena. Due worm di tipo selvaggio per ogni costrutto vettoriale di espressione da iniettare.

Ora siamo pronti per configurare il microscopio per microiniezioni. Per iniziare a configurare il microscopio, aprire la valvola principale sul serbatoio dell'elio che è collegata al braccio e al supporto dell'ago per microiniezione. Chiudere il regolatore per consentire al gas di entrare nella linea.

Portando la pressione a 35 PSI, il gas può essere rilasciato utilizzando un pedale. Quindi, inserire un caricatore di aghi in un tubo pipettatore a bocca standard e far cadere una piccola quantità della miscela plasmidica di circa un microlitro. Ora inserire delicatamente il caricatore fino in fondo attraverso l'ago per microiniezione fino a quando non si avverte resistenza.

Espellere la soluzione di DNA soffiando delicatamente e quindi rimuovere il caricatore. Una volta caricato il DNA, inserire l'ago nel braccio di microiniezione, facendo attenzione a posizionarlo all'interno della piccola guarnizione interna in gomma per poi fissarlo al braccio del manipolatore. Quindi, posizionare un frammento di vetro di copertura che rompe l'ago su un bordo di una coclea.

Coprire il frammento e l'intera superficie del tampone della coclea con olio di carbonio sacro. Quindi posizionare la coclea sul tavolino di un microscopio invertito. Dopo che il cuscinetto della coclea è in posizione, posizionare l'ago al centro del campo di visualizzazione utilizzando l'obiettivo Forex e l'illuminazione del campo chiaro, ma non abbassarlo ancora nell'olio.

Quindi posiziona il bordo interno del frammento di vetro di copertura al centro, quindi concentrati su di esso. Abbassa l'ago nell'olio, portandolo sullo stesso piano focale del frammento di vetro di copertura. Aumenta l'ingrandimento passando all'obiettivo 40x, quindi rimetti a fuoco il bordo del frammento e riposiziona la punta dell'ago se necessario.

Ora apri la punta dell'ago per iniezione. Spingere delicatamente l'ago contro il bordo del frammento di vetro di copertura, applicando allo stesso tempo un breve impulso di gas tramite il pedale. L'ago sarà sufficientemente aperto.

Quando piccole goccioline di liquido fuoriescono dall'estremità del flusso di liquido in eccesso dell'ago a causa di un'apertura troppo grande, un'apertura non è desiderabile in quanto ucciderà gli animali. Una volta che l'ago è pronto, iniziamo la microiniezione. Quindi, rimuovere il cuscinetto della coclea dal tavolino sollevando l'ago.

Ma non modificare la posizione dell'asse X o Y. Far scorrere il tavolino fuori da sotto l'ago. Rimuovere il tampone della coclea e posizionarlo su un microscopio da dissezione.

Trasferisci una parola sul tampone sotto la superficie dell'olio. Se il verme si dimena delicatamente fino a toccare il cuscinetto della coclea, il verme umido dovrebbe aderire all'agro secco. Riposizionare rapidamente la coclea sul tavolino, centrando il verme nel campo visivo.

Quindi abbassare l'ago sullo stesso piano di messa a fuoco del verme. Impostare i filtri sul cannocchiale invertito sull'illuminazione Hoffman. Questo filtro di contrasto consente di rendere visibili i dettagli morfologici del verme.

Utilizzando l'obiettivo 40x, concentrarsi sul centro sensoriale granuloso della gonade del verme sotto il modello a nido d'ape dei nuclei germinali. Scegli la gonade posizionata sul lato del verme rivolto verso l'ago. Bene. Regolare la posizione dell'ago fino a quando anche la punta non è a fuoco.

Inserire delicatamente l'ago al centro della gonade e applicare un breve impulso di pressione del gas per espellere una o due goccioline di DNA nel braccio della gonade. Dovresti osservare un'ondata di liquido che si diffonde attraverso il pungolo distale con molta pratica e abilità. Puoi colpire il centro del pungolo ogni volta.

Tieni presente che è importante lavorare rapidamente durante l'iniezione di un verme. Poiché può facilmente essiccarsi. L'intero processo dovrebbe idealmente richiedere meno di uno o due minuti.

Una volta completata l'iniezione, rimuovere il tampone della coclea dal tavolino e posizionarlo su un cannocchiale da dissezione. Applicare un microlitro di tampone M nine direttamente sul verme iniettato. Ciò potrebbe comportare l'immersione della punta della pipetta sotto la superficie dell'olio halo carb.

Il tampone dovrebbe reidratare il verme e quindi galleggerà via dalla superficie dell'aerospad, trasferendo il verme su una piastra normale usando un plettro a vite senza fine. Ora consegnerò i vermi iniettati ad Adam e lui ci mostrerà la selezione e il mantenimento delle linee transgeniche. I vermi iniettati vengono trasferiti in singole piastre da 60 millimetri con semi freschi e lasciati riprodurre.

Questi worm rappresentano la generazione P zero. In genere gli animali iniettati vengono incubati a 20 gradi Celsius per due o tre giorni fino alla comparsa della prole. Una volta che la prole appare, siamo pronti per iniziare lo screening per i vermi transgenici.

La prole F1 viene osservata per l'evidenza del marcatore transgenico. In questo caso, il marcatore selezionabile è fluorescente, quindi possiamo eseguire lo screening utilizzando uno stereomicroscopio fluorescente. Ogni animale portatore fluorescente F1 viene clonato separatamente su una nuova piastra.

Il P zero iniettato può produrre solo da una a cinque prole fluorescente tra tutti i suoi F1. Lascia che gli ermafroditi F1 si riproducano a 20 gradi per due o tre giorni fino alla comparsa della prole. Una volta che la generazione F 2 è pronta, vengono osservate anche per gli animali transgenici. F due animali che hanno ereditato ed espresso un marcatore transgenico sono considerati una linea stabile.

Ogni linea stabile indipendente dovrebbe essere mantenuta come una linea separata di vermi che propagano ogni linea trasferendo diversi animali transgenici su una nuova piastra ad ogni generazione. Questa operazione deve essere eseguita utilizzando uno stereomicroscopio fluorescente. Se il marcatore selezionabile è fluorescente per controllare la variabilità del numero di copie del gene, generare un minimo di tre linee stabili indipendenti per costrutto iniettato.

Ti abbiamo appena mostrato come microiniettare espressione, costrutti vettoriali, e vedere elgan e selezionare per linee stabili. Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.