Name: Generazione di Stabile transgenici C. elegans Utilizzando Microiniezione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-08-15T12:12:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: Impara la tecnica di microiniezione nel gonade di C. elegans per generare linee transgeniche stabili. Questo metodo consente la visualizzazione in vivo dell'espressione genica mediante marcatori fluorescenti.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Vogliamo riconoscere lo spirito di cooperazione di tutti i membri Lab Caldwell. Disturbi del movimento di ricerca in laboratorio è stato sostenuto dalla Bachmann-Strauss Fondazione Parkinson e distonia, Regno Parkinson Foundation, American Parkinson Disease Association, il morbo di Parkinson Associazione dell&#39;Alabama, Michael J. Fox Foundation for Parkinson Research, e una ricerca di laurea.

Espressione Costruzione plasmidi Due plasmidi sono necessari: uno per espressione tessuto-specifica del gene di interesse e un secondo come marcatore trasformazione selezionabili. Sperimentale plasmidi <ol><li> Selezionare un promotore che si esprime nel tessuto / cellula tipo di interesse, ad esempio, un nervo o muscolo-specifico promotore. Se uno è di esprimere geni multipli all&#39;interno del tessuto stesso, una cassetta promotore plasmide nel sistema Gateway (Invitrogen) può essere utilizzato. Questo approccio consente l&#39;inserimento di un gene di interesse a valle del promotore di 4 clonazione ricombinazione. Generalmente, 2-5 kb di sequenze a monte è sufficiente disporre di espressione corretta e precisa. </li><li> Il cDNA del gene di interesse può essere clonato in due modi: <ol><li> Clonazione convenzionale utilizzando enzimi di restrizione. </li><li> Gateway per la clonazione, è amplificato mediante PCR utilizzando primers che contengono il Gateway att sequenza B ricombinazione. Il cDNA amplificato viene prima ricombinato nel pDONR201 vettore donatore per creare il vettore di ingresso e poi trasformato in E. coli ceppo DH5a. A seguito di selezione dei ricombinanti successo e mini-prep isolamento del DNA, il vettore di ingresso viene ricombinato nel promotore contenenti vettore destinazione per creare il plasmide di espressione. Dettagli sulla clonazione ricombinazione sono disponibili sia dal manuale Gateway Invitrogen o in Caldwell et al. 5. </li></ol></li></ol> Marker selezionabile plasmidi Esempi di plasmidi marcatore transgenici sono rol-6 o utilizzo del promotore muscolo del corpo muro unc-54 per guidare l&#39;espressione di proteine ​​fluorescenti. Questi plasmidi marker sono generalmente disponibili all&#39;interno della comunità scientifica su richiesta. Microiniezione di C. elegans Preparazione <ol><li> Procedere all&#39;isolamento del DNA dei due plasmidi che devono essere iniettati. Quantificare loro e si mescolano in un rapporto 1:1 di 50 ng / mL ciascuno. </li><li> Preparare pastiglie agar: <ol><li> Fare una soluzione al 2% di agarosio in acqua, calore o microonde fino alla dissoluzione. </li><li> Sono di varie 22 x 50 bicchieri di copertura mm su un banco. </li><li> Utilizzando una pipetta Pasteur, una goccia di agarosio fuso su una copertura in vetro e collocare immediatamente un secondo bicchiere coprire il calo a 90 alla prima. Ripetere l&#39;operazione per diversi bicchieri coprire altre. Il diametro del disco appiattito di agarosio deve essere compreso tra 15-20 mm. </li><li> Dopo l&#39;agarosio si è solidificato (questo richiede solo momenti), togliere il vetro di copertura e permettere al pad per asciugare completamente (diverse ore a notte). </li><li> Conservare le pastiglie in una scatola di vetro di copertura a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Fai caricatori aghi per soluzione di DNA: Caricatori aghi vengono creati da 100 microlitri tubi capillari che vengono riscaldate in mezzo su una fiamma aperta e rapidamente tirato a circa il doppio della loro lunghezza. Le due metà sono scattato a parte una volta che il tubo capillare si raffredda. Accumulo 10-20 caricatori ago per l&#39;iniezione. Conservare in posizione verticale in un rack provetta. Prestare attenzione per non impalare se stessi i punti. </li><li> Fai aghi microiniezione: L&#39;ago è costituito da un tubo capillare speciale che contiene un filamento interno in vetro, questo filamento funge da stoppino per la soluzione del DNA. Questi sono tirati su un ago-estrattore macchina. Usiamo un Narishige PP-830 estrattore con una regolazione di calore di 24,8. Aghi diversi sono tirati alla volta e sono memorizzati in una scatola di plastica di piccole dimensioni. Aghi multipli possono essere facilmente &quot;montata&quot; su una striscia di plastilina per la conservazione a lungo termine. </li><li> La punta dell&#39;ago &quot;interruttori&quot;: La punta dell&#39;ago microiniezione viene tirato così fine che in realtà è chiuso a finire e deve essere rotto aperto con frammenti di piccole di vetro di copertura. Questi sono preparati avvolgendo una x 18 18 vetro di copertura mm in un tovagliolo di carta e delicatamente applicando una pressione fino a quando si rompe in vari pezzi. Frammenti di dimensioni utili sono circa 3 x 4 mm. </li><li> Crescono wild type (N2) vermi allo stadio adulto in anticipo per iniezione utilizzando le procedure standard 6. Preparare adeguatamente messo in scena circa 100 worm / costruire iniettato. </li></ol> Procedura <ol><li> Aprire la valvola principale di un serbatoio di elio che è collegato ad un braccio l&#39;ago microiniezione e supporto. Chiudere la valvola di regolazione per consentire al gas di entrare nella linea, portando la pressione a 35 bar. Si noti che il gas può essere rilasciato con un pedale. </li><li> Inserire un caricatore ago in una tubazione tradizionale pipetter bocca (che si trova in contenitori di vetro, tubi capillari) e redige una piccola quantità di miscela plasmide (~ 1 ml). </li><li> Il caricatore ago è accuratamente inserito nel back-end di un ago per l&#39;iniezione e delicatamente inserito tutto il percorso attraverso la lunghezza dell&#39;ago fino ad avvertire resistenza. Espellere la soluzione di DNA da parte soffia dolcemente, quindi rimuovere il caricatore. </li><li> Inserire l&#39;ago nel braccio microiniezione, avendo cura di collocarla all&#39;interno della guarnizione di gomma interno. </li><li> Inserire un ago-rottura scheggia di vetro di copertura su un bordo di un pad agar. Coprire il frammento, così come tutta la superficie del pad agar, con olio alocarburi. Posizionare il pad agar sul palcoscenico di un microscopio invertito. </li><li> Posizionare l&#39;ago nel centro del campo visivo con l&#39;obiettivo di 4X e di illuminazione in campo chiaro, ma non ancora la più bassa nell&#39;olio. Inoltre, la posizione del bordo interno del frammento di copertura in vetro del centro, per poi focalizzarsi su di esso (ancora con obiettivo 4X). Abbassare l&#39;ago nel petrolio, portandola nello stesso piano focale, come il frammento di vetro di copertura. Sollevare l&#39;ingrandimento passando per l&#39;obiettivo 40X. Ridefinire sul bordo del frammento e riposizionare la punta dell&#39;ago, se necessario. </li><li> Per aprire la punta di un ago per l&#39;iniezione, DELICATAMENTE spingere l&#39;ago contro il bordo del coperchio in vetro coccio, mentre allo stesso tempo, applicando un breve impulso di gas attraverso il pedale. L&#39;ago sarà sufficientemente rotto aperto quando piccole gocce di liquido sfuggire alla fine l&#39;ago. Eccesso di flusso di liquido a causa di un&#39;apertura troppo grande non è auspicabile, in quanto uccidono gli animali. </li><li> Rimuovere il tampone di agar dal palco sollevando l&#39;ago, ma non cambiare la X o Y. posizione. Far scorrere il palco fuori da sotto l&#39;ago, rimuovere il pad agar e mettetelo su un microscopio da dissezione. Trasferire un worm sul pad, sotto la superficie dell&#39;olio. Se il verme si contorce, DELICATAMENTE accarezzarlo finché non tocca la tastiera agar. Il worm umido dovrebbe aderire al secco agarosio. </li><li> Iniezione <ol><li> Rapidamente posto sul retro pad agar sul palco, centrando il verme nel campo visivo. </li><li> Abbassare l&#39;ago nel stesso piano di messa a fuoco come il verme. </li><li> Passa i filtri per Hoffman illuminazione (un tipo di filtro di contrasto). Questo permette dettaglio morfologico del worm per diventare visibili. Se Nomarski / DIC ottica sono disponibili sulla portata rovesciata che funziona altrettanto bene. Utilizzando l&#39;obiettivo 40X, si concentrano sul centro &quot;sgranata&quot; sinciziale della gonade verme, sotto il pattern &quot;a nido d&#39;ape&quot; dei nuclei germinali (scegliere quale gonade è posizionato sul lato del worm verso l&#39;ago). </li><li> Ottimizzare la posizione dell&#39;ago fino a quando la punta è messa a fuoco (sullo stesso piano della gonade &quot;granulosità&quot;). </li><li> Inserire delicatamente l&#39;ago nel centro della gonade e applicare un breve impulso di pressione del gas per espellere una goccia o due di DNA nel braccio gonade. Si dovrebbe osservare un&#39;onda di diffusione in tutto il liquido gonade distale. Non assumere più liquidi è meglio, in quanto il liquido troppo può fluire nel piegare prossimale del braccio gonade, che può fermare la produzione di ovociti. Se possibile, a seconda della posizione del worm, iniettare l&#39;altro braccio gonade nello stesso modo. </li><li> E &#39;importante lavorare velocemente, mentre l&#39;iniezione di un verme, come si può facilmente essiccare. La decisione di iniettare il secondo braccio gonade dipende da quanto velocemente si può riposizionare l&#39;ago e worm. L&#39;intero processo è effettuato, a meno di 1-2 minuti. </li></ol></li><li> Togliere il vetro di copertura dal palco e posizionarlo su una portata dissezione. Applicare 1ml di M9 tampone (22mm KH 2 PO 4, 42mm Na 2 HPO 4, 85mm NaCl, 1 mM MgSO 4) direttamente sul verme iniettato (questo potrebbe comportare immergendo la punta della pipetta sotto la superficie del petrolio alocarburi). Il buffer dovrebbe reidratare il worm, che sarà poi galleggiare sulla superficie pad agarosio. Trasferimento al worm di un piatto normale con un pick verme. Il pad agarosio può essere riutilizzato più volte fino a quando non è diventato troppo saturo di buffer e il worm non aderire. </li></ol> Selezione transgenici <ol><li> Vermi iniettato, il P 0 generazione, vengono trasferiti ai singoli fresca, piatti batteri seminati (60 mm) e ha permesso di riprodurre. Tipicamente, gli animali iniettati vengono incubate a 20 ° C per 2-3 giorni fino a quando la prole apparire. </li><li> Il 1 prole F sono osservati per la prova del marcatore transgenici (come fluorescenza) utilizzando uno stereomicroscopio a fluorescenza. Ogni fluorescente, vettore F 1, animale è clonato separatamente su una piastra di nuovo (in quanto discendenti da ogni F 1 sono considerati una linea distinta). La F 1 ermafroditi sono autorizzati a riprodurre. Di nuovo, questo è tipicamente effettuata a 20 ° C per 2-3 giorni fino a quando la prole apparire. </li><li> La generazione F 2 è osservato per gli animali transgenici pure. F 2 animali che hanno ereditato ed esprimere l&#39;array transgenici sono considerati una linea di &quot;stabile&quot;. NOTA: Al 1 ° Fetà ci possono essere molti animali transgenici, ma non sono stabili. La maggior parte degli F 1 animali transgenici non saranno diffusi in F 2 linee stabili. NOTA: Per controllare la variabilità del numero di copie del gene, generare un minimo di tre linee indipendenti stabile per costruire iniettato. </li><li> Ogni linea indipendente stabile dovrebbe essere mantenuto come una linea separata di vermi. Ogni linea può essere propagato con il trasferimento di diversi animali transgenici per un piatto di nuovo ad ogni generazione, questo deve essere eseguita utilizzando uno stereomicroscopio a fluorescenza se il marcatore è fluorescente. </li></ol>

<ol><li>Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrachromosomal+DNA+transformation+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).</li>
<li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+in+C.elegans%3A+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).</li>
<li>Kelly, W. G., Xu, S., Montgomery, M. K., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+requirements+for+somatic+and+germline+expression+of+a+generally+expressed+Caenorhabditis+elegans+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Distinct requirements for somatic and germline expression of a generally expressed Caenorhabditis elegans gene.</a> Genetics. 146, 227-238 (1997).</li>
<li>Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torsin-mediated+neuroprotection+from+cellular+stresses+to+dopaminergic+neurons+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans.</a> J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).</li>
<li>Caldwell, G. Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. , John Wiley and Sons. West. Sussex, England. (2006).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
</ol>

Quando si esegue questa procedura, è importante ricordarsi di: - Iniettare direttamente nel centro della gonade - Non iniettare liquidi troppo - Lavorare velocemente per evitare essiccazione. Se si verificano problemi con l&#39;ago, come si è rotto troppo grande, è meglio rifare un ago fresco, piuttosto che cercare di iniettare con meno di aghi ideale. La generazione di vermi transgenici ha molte applicazioni quali: - Identificazione di geni mutanti, nel metodo chiamato soccorso trasformazione <br...

<table><tbody><tr><td>Agarosio</td><td>Ultrapuro</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>Olio peralogenato, Voltalef</td><td>Hulle 10S</td><td>elfatochem, Francia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vetrino coprioggetto 18x18 mm</td><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-A</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino coprioggetto 20x30 mm</td><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5A</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino coprioggetto 22x50 mm</td><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-E</td><td></td></tr><tr><td>Cappillare da 100 µl</td><td></td><td>VWR international</td><td>53432-921</td><td></td></tr><tr><td>Cappillare di vetro per aghi</td><td>&quot;Kwik-Fil&quot;</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Tiratore di aghi</td><td>Strumento</td><td>Narishige International</td><td>Modello PP-830</td><td></td></tr><tr><td>Sistema microINJECTOR</td><td></td><td>Tritech Research, Inc.</td><td>MINJ-1000</td><td>Microscopio, Piastra, Manipolatore</td></tr><tr><td>Dissezione, con fluorescenza</td><td>Microscopio</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Dissezione</td><td>Microscopio</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ645</td><td></td></tr></tbody></table>

generazione di stabile transgenici c. elegans utilizzando microiniezione

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenici Caenorhabditis elegans possono essere facilmente create tramite microiniezione di una soluzione di DNA plasmidico in gonade 1. Il DNA plasmidico riorganizza per formare concatamers extracromosomico che sono stabilmente ereditato, anche se non con la stessa efficienza di cromosomi effettivo 2. Un gene di interesse è co-iniettata con un marker fenotipici evidenti, come ad esempio rol-6 o GFP, per consentire la selezione di animali transgenici sotto un microscopio da dissezione. Il gene esogeno può essere espresso dal suo promotore nativo per gli studi di localizzazione cellulare. In alternativa, il transgene può essere guidata da un diverso tessuto-specifica promotore di valutare il ruolo del prodotto genico in quella cella particolare o tessuto. Questa tecnica di guida in modo efficiente l&#39;espressione genica in tutti i tessuti del C. elegans, tranne per l&#39;embrione linea germinale o ai primi 3. Creazione di animali transgenici è ampiamente utilizzata per una vasta gamma di paradigmi sperimentali. Questo video mostra la procedura di microiniezione di generare vermi transgenici. Inoltre, la selezione e la manutenzione di stabili transgenici C. elegans linee è descritto.

Questo video mostra la tecnica di microiniezione nella gonade di C. elegans per creare animali transgenici.

Generazione di Stabile transgenici C. elegans Utilizzando Microiniezione

I ceppi transgenici di Caenorhabditis elegans possono essere facilmente creati tramite microiniezione di una soluzione di plasmide di DNA nella gonade 1. Il DNA plasmidico si riorganizza per...

Sea elegance è un organismo modello incredibilmente utile grazie sia alla nostra conoscenza delle sue linee cellulari sia alla grande quantità di informazioni ottenute dal sequenziamento e dall'analisi del suo intero genoma. In questo video, illustriamo il processo di microiniezione di plasmidi in sea elegance e la selezione di prole transgenica mediante microscopia fluorescente. Essendo un animale trasparente e multicellulare, sea elegance è ideale per la visualizzazione in vivo di transgeni che esprimono proteine etichettate con fluorescenza. Ciao, mi chiamo Laura Berkowitz e sono un'associata di ricerca nel Caldwell Lab del Dipartimento di Scienze Biologiche qui all'Università dell'Alabama.E io sono Adam Knight, anch'io del laboratorio Calwell dell'Università dell'Alabama. Oggi vi mostrerò come prepararsi ed eseguire la microiniezione di plasmina per generare ricci di mare transgenici, e vi mostrerò anche come selezionare e mantenere linee di ricci di mare transgenici. Cominciamo dunque.Prima di iniziare la microiniezione, dobbiamo eseguire alcuni passaggi preparatori, che vi mostrerò ora. Preparare prima il DNA plasmidico da iniettare: sono necessari due plasmidi, uno che codifica per l'espressione specifica del tessuto del nostro gene di interesse e un secondo che fornisce un marcatore di trasformazione selezionabile. Mescolare i plasmidi insieme in un rapporto uno a uno di 50 nanogrammi per microlitro.Successivamente, preparare i cuscinetti a vite, che verranno utilizzati per immobilizzare i vermi durante l'iniezione. Per realizzare i cuscinetti a vite, posizionare innanzitutto alcuni vetrini di dimensioni 22 per 50 millimetri sul bancone del laboratorio. Utilizzando una pipetta Pasteur, depositare una goccia di agarosio fuso al 2% su un vetrino e immediatamente appoggiare un secondo vetrino sulla goccia, disponendolo perpendicolarmente, cioè a un angolo di 90 gradi, rispetto al primo.Lasciare solidificare l'aerogel per alcuni secondi, quindi rimuovere il vetrino superiore. Il diametro del disco appiattito di aerogel dovrebbe essere compreso tra 15 e 20 millimetri. Come per un animale domestico, lasciare asciugare completamente il pad all'aria per diverse ore o durante la notte.Una volta asciutte, conservare le piastre in una scatola di vetro coperta a temperatura ambiente. Successivamente, preparare i caricatori per l'ago con la soluzione di DNA. A tale scopo, prendere un capillare da cento microlitri e riscaldarlo al centro con una fiamma libera, quindi tirarlo rapidamente fino a raggiungere circa il doppio della sua lunghezza.Dopo che il capillare si è raffreddato, spezzare in due parti le estremità. Accumulare da 10 a 20 caricatori per microago da utilizzare per l'iniezione. È possibile conservarli in posizione verticale all'interno di una provetta per microcentrifuga.Brack, faccia attenzione. Le punte del caricatore di aghi sono molto affilate. Ora prepari gli aghi per microiniezione.Questi aghi sono realizzati a partire da un tubo capillare speciale che contiene un filamento di vetro interno. Questo filamento funge da stoppino per la soluzione di DNA. Per fabbricare gli aghi, utilizziamo un Niki PP eight 30 Polar con un'impostazione di calore pari a 24,8, e vengono tirati contemporaneamente diversi aghi per la conservazione.È possibile montare più aghi su una striscia di argilla modellabile. Piccoli frammenti di vetrino verranno utilizzati per rompere la punta dell'ago tratto. Questi frammenti vengono preparati avvolgendo un vetrino di 18 per 18 millimetri in un fazzoletto Kim e applicando delicatamente pressione fino a quando si rompe in diversi pezzi.Utilizzare frammenti di dimensioni pari a circa tre per quattro millimetri. Oltre a preparare il DNA e gli aghi, preparare circa da 50 a 100 esemplari adeguatamente stadiati. Due esemplari di vermi di tipo selvatico per ciascun costrutto vettoriale di espressione da iniettare.Ora siamo pronti per configurare il microscopio per microiniezione. Per iniziare la configurazione del microscopio, aprire la valvola principale della bombola di elio collegata al braccio e al supporto dell'ago per microiniezione. Chiudere il regolatore per consentire al gas di entrare nella linea.Portando la pressione a 35 PSI, il gas può essere rilasciato utilizzando un pedale a pressione. Successivamente, inserire un caricatore di aghi in un tubo di pipetta manuale standard e aggiungere una piccola quantità della miscela plasmidica, circa un microlitro. Ora inserire delicatamente il caricatore completamente all'interno dell'ago per microiniezione fino a quando non si avverte resistenza.Espellere la soluzione di DNA soffiando delicatamente, quindi rimuovere il caricatore. Una volta caricato il DNA, inserire l'ago nell'arto di microiniezione, avendo cura di posizionarlo all'interno della piccola guarnizione di gomma interna, quindi fissarlo al braccio del manipolatore. Successivamente, posizionare un frammento di vetrino coprioggetto per la rottura dell'ago su un bordo del tappetino per ago. Coprire il frammento e l'intera superficie del tampone elicoidale con olio di carbonio vuoto. Quindi posizionare il tampone elicoidale sul palchetto di un microscopio invertito. Una volta che il tampone elicoidale è posizionato, centrare l'ago nel campo visivo utilizzando l'obiettivo Forex e l'illuminazione a campo chiaro, senza però abbassarlo ancora nell'olio.Posizionare successivamente il bordo interno del frammento di vetrino coprioggetto al centro, quindi metterlo a fuoco. Abbassare l'ago nell'olio, portandolo nello stesso piano focale del frammento di vetrino coprioggetto. Aumentare l'ingrandimento passando all'obiettivo 40x, quindi rimettere a fuoco sul bordo del frammento e riposizionare la punta dell'ago se necessario.Ora rompere l'apertura della punta dell'ago di iniezione. Spingere delicatamente l'ago contro il bordo del frammento di vetrino, applicando contemporaneamente un breve impulso di gas tramite il pedale. L'ago verrà così sufficientemente aperto.Quando piccole gocce di liquido fuoriescono dall'estremità dell'ago a causa di un'apertura troppo grande, il flusso eccessivo di liquido non è desiderabile poiché ucciderebbe gli animali. Una volta che l'ago è pronto, iniziamo la microiniezione. Successivamente, rimuovere il tampone dell'arco dallo stadio sollevando l'ago.Ma non modificare la posizione degli assi X o Y. Estrarre la piastra da sotto l'ago. Rimuovere il tampone elicoidale e posizionarlo su un microscopio stereoscopico.Trasferisci un verme sul tampone posizionato al di sotto della superficie dell'olio. Se il verme si muove leggermente, accarezzalo finché non entra in contatto con il tampone dell'ago, il verme umido dovrebbe aderire all'ago secco. Posiziona rapidamente il tampone dell'ago nuovamente sul palco, centrando il verme nel campo visivo.Quindi abbassare l'ago fino a portarlo nello stesso piano di fuoco del verme. Passare ai filtri sul microscopio invertito per l'illuminazione Hoffman. Questo filtro di contrasto permette di rendere visibili i dettagli morfologici del verme.Utilizzando l'obiettivo 40x, mettere a fuoco il centro sensoriale granulare della gonade del verme situato al di sotto del modello a nido d'ape dei nuclei germinativi. Scegliere la gonade posizionata sul lato del verme rivolto verso l'ago. Regolare con precisione la posizione dell'ago finché anche la punta risulti a fuoco.Inserire delicatamente l'ago al centro della gonade ed applicare un breve impulso di pressione gassosa per espellere una o due gocce di DNA nel braccio della gonade. Con molta pratica e abilità, si dovrebbe osservare un'onda di liquido diffondersi lungo la gonade distale. È possibile colpire ogni volta il centro della gonade.Tenere presente che è importante lavorare rapidamente durante l'iniezione di un verme, poiché può disidratarsi facilmente. L'intero processo dovrebbe idealmente richiedere meno di uno o due minuti.Una volta completata l'iniezione, rimuovere il cuscinetto dell'archetto dalla piastra e posizionarlo su un microscopio stereoscopico. Applicare un microlitro di buffer M nine direttamente sul verme iniettato. Questo potrebbe richiedere di immergere la punta della pipetta al di sotto della superficie dell'olio halo carb.Il buffer dovrebbe reidratare il verme, che successivamente galleggerà sulla superficie del pad aeros; trasferire il verme su una piastra normale utilizzando un worm pick. Ora consegnerò i vermi iniettati ad Adam, che ci mostrerà la selezione e il mantenimento delle linee transgeniche. I vermi iniettati vengono trasferiti su piastre fresche da 60 millimetri individuali, seminate, e lasciati riprodurre.Questi vermi rappresentano la generazione P zero. Generalmente, gli animali iniettati vengono incubati a 20 gradi Celsius per due o tre giorni, fino alla comparsa della prole. Una volta che la prole appare, siamo pronti per iniziare la selezione dei vermi transgenici.I progeni F1 vengono osservati per verificare la presenza del marcatore transgenico. In questo caso, il marcatore selezionabile è fluorescente, quindi possiamo effettuare lo screening utilizzando un microscopio stereoscopico a fluorescenza. Ogni animale F1 portatore del marcatore fluorescente viene clonato separatamente in una nuova piastra.Il P zero iniettato può produrre solo da uno a cinque prole fluorescenti tra tutti i suoi F1. Lasciare che gli ermafroditi F1 si riproducano a 20 gradi per due o tre giorni, fino a quando non compaiono i discendenti. Una volta pronta la generazione F2, anche questa viene osservata alla ricerca di animali transgenici. Gli animali F2 che hanno ereditato ed espresso un marcatore transgenico sono considerati una linea stabile.Ogni linea stabile indipendente deve essere mantenuta come una linea separata di vermi; propagare ciascuna linea trasferendo diversi animali transgenici in una nuova piastra a ogni generazione. Questa operazione deve essere eseguita utilizzando un microscopio stereoscopico a fluorescenza. Se il marcatore selezionabile è fluorescente, al fine di controllare la variabilità nel numero di copie del gene, generare almeno tre linee stabili indipendenti per ogni costrutto iniettato.Abbiamo appena mostrato come eseguire microiniezioni di costrutti vettoriali di espressione e come selezionare linee stabili. È tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

generation-of-stable-transgenic-c-elegans-using-microinjection

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Vermi transgenici sono comunemente utilizzati...

Generazione di transgenici C. elegans Di Trasformazione Biolistic

La produzione di C. elegans Transgeni attraverso recombineering con il GalK Marcatori selezionabili

In organismi modello, transgenesi in grado di manipolare le funzioni del gene, mentre RNAi può knockdown trascritti di mRNA specifico 1-2. Questo protocollo si propone di illustrare le tecniche necessarie per introdurre in modo stabile il DNA trasmessi e transitori di RNA a doppio filamento nel nematode...

RNAi mediata Knockdown Gene e Transgenesi dalla microiniezione nel nematode Necromenic Pristionchus pacificus</em

Questo video descrive la microiniezione, un metodo comune per creare ceppi transgenici di C. elegans. Nell'esempio, vedremo la microiniezione utilizzata per introdurre un complesso di ribonucleoproteina (RNP) per l'editing genetico su basi CRISPR.

Microiniezione di gonadi: un metodo di somministrazione di composti direttamente nella linea germinale di C. elegans

Questo protocollo descrive una procedura rapida e a basso consumo di materiale per l'integrazione di array extracromosomici transgenici nel genoma di Caenorhabditis elegans utilizzando l'irradiazione ultravioletta (UV). Inoltre, questo protocollo è particolarmente adatto per le linee transgeniche che trasmettono array extracromosomici ad alta velocità.

Un protocollo rapido per l'integrazione di array extracromosomici con un'elevata velocità di trasmissione nel genoma di C. elegans

C. elegans è di solito coltivate su piastre di agar solidi o liquidi in colture seminate con E. coli. Per evitare sottoprodotti batterici da confondere studi tossicologici e nutrizionali, abbiamo utilizzato un mezzo liquido axenic, CeHR, crescere e sincronizzare un gran numero di vermi per una gamma di applicazioni a valle.

Culturing Caenorhabditis elegans In axeniche Liquid Media e la creazione di transgeniche Worms da microparticelle Bombardamento

La microinezione di ovociti del mouse è comunemente utilizzata sia per il transgenesi classico ( cioè l'integrazione casuale dei transgeni) sia per il targeting del gene mediato da CRISPR. Questo protocollo riesamina gli ultimi sviluppi della microinjection, con particolare attenzione alle strategie di controllo della qualità e genotipizzazione.

Generazione di topi modificati geneticamente attraverso la microinjection of oocytes

Utilizzando un Cas9 preassemblati complesso ribonucleoproteico (RNP) è un metodo potente per l'editing genomico precisa, efficiente. Qui, si evidenzia sua utilità in una vasta gamma delle cellule e degli organismi, tra cui cellule umane primarie e classico ed emergenti organismi modello.

Enhanced Genome Editing con Cas9 ribonucleoproteina nelle Diverse cellule e degli organismi

Qui, presentiamo un metodo per progettare il genoma di c. elegans usando CRISPR-Cas9 ribonucleoproteine e modelli di omologia riparazione dipendente.

Un veloce e Facile Pipeline per generazione di mutanti di punto Genomic in c. elegans utilizzando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteine

Il toolkit genomico funzionale per i nematodi parassiti Strongyloides stercoralis e Strongyloides ratti comprende transgenesi, mutagenesi mediata da CRISPR/Cas9 e RNAi. Questo protocollo dimostrerà come utilizzare la microiniezione intragonennale per introdurre transgeni e componenti CRISPR in S. stercoralis e S. ratti.

Generazione di transgenici e knockout in specie di Strongyloides mediante microiniezione

Un flusso di lavoro di microiniezione CRISPR/Cas9 per il marcattura fluorescente endogena nella linea germinale di Caenorhabditis elegans per ottenere linee di knock-in omozigoti per l'analisi in vivo della localizzazione delle proteine.

Marcatura Endogena Fluorescente mediata da CRISPR/Cas9 dei geni specifici della linea germinale in Caenorhabditis elegans

Impara la tecnica di microiniezione nel gonade di C. elegans per generare linee transgeniche stabili. Questo metodo consente la visualizzazione in vivo dell'espressione genica mediante marcatori fluorescenti.

Generazione di Stabile transgenici C. elegans Utilizzando Microiniezione

Esplora altri video