Il metodo MODS per la diagnosi di tubercolosi e di tubercolosi multiresistente

Ogni tre persone nel mondo, una è infetta dalla tubercolosi. La diagnosi di tubercolosi attiva previene nuove infezioni perché i pazienti con tubercolosi attiva continueranno a infettare tra le 10 e le 15 altre persone all'anno fino al momento in cui vengono trattati o muoiono. Mods è un acronimo che usiamo per evitare di dover dire osservazione microscopica, saggio di suscettibilità ai farmaci, e il motivo per cui si chiama diventerà evidente man mano che la metodologia verrà spiegata.

Nel breve video, illustreremo la metodologia mods per la diagnosi rapida ed economica della tubercolosi e della tubercolosi multiresistente ai farmaci. Il video illustrerà la metodologia passo dopo passo. Discuteremo le implicazioni per la biosicurezza del lavoro con la coltura liquida e spiegheremo anche alcune delle importanti questioni di garanzia della qualità necessarie per l'uso di questa metodologia.

Il test mods è stato sviluppato presso l'Università Kayana di Lima, in Perù, nel laboratorio di Bob Gilman. A seguito di osservazioni inizialmente effettuate da cavi. LOOSE stava cercando di identificare modi rapidi per rilevare il mycobacterium tuberculosis nelle colture utilizzando indicatori colorimetrici.

Ma ha notato che l'osservazione di quelle colture al microscopio ha rivelato la presenza di crescita di microbatteri diversi giorni prima che gli indicatori colorimetrici cambiassero colore, ed è stato sulla base di tale osservazione che è stato sviluppato il test del MOD. Il test del MOD è stato sviluppato in un contesto con risorse limitate ed è mirato a contesti con risorse limitate, quindi poco meno di 3 per test per il rilevamento della tubercolosi basato su colture liquide e per il rilevamento di resistenza multifarmacologica. È estremamente attraente e per la prima volta porta questo tipo di capacità diagnostica in luoghi in cui le risorse sono limitate.

Quindi il test mods si basa su tre principi fondamentali. Il primo è che il mycobacterium tuberculosis cresce nei terreni liquidi molto più rapidamente di quanto non faccia nei terreni solidi. Questo è un fatto noto da molti anni.

Il secondo è che se osserviamo quei mezzi liquidi al microscopio, possiamo rilevare la crescita della myb tuberculosis molto più rapidamente che aspettare la comparsa macroscopica delle colonie su terreni solidi. E in effetti, quella crescita è del tutto caratteristica in modo tale che possiamo distinguere la tubercolosi da batteri o contaminazione fungina, o addirittura dalla crescita di micobatteri non tubercolari atipici che potrebbero essere presenti. Infine, e questa è forse la cosa più eccitante del test mods, è che possiamo incorporare i farmaci è la rifampicina e quindi la resistenza multi-farmaco direttamente dall'espettorato.

Utilizzando questi farmaci all'inizio del test, possiamo rilevare sia la tubercolosi che allo stesso tempo se l'isolato è resistente o meno a questi due farmaci. E questo ovvia alla necessità di sottocultura e creare un test indiretto di suscettibilità ai farmaci. Quindi ora delineeremo solo l'attrezzatura necessaria per eseguire il test delle mod.

È necessario un frigorifero per conservare i terreni preparati. È necessaria una bilancia per pesare l'is e la rifampicina. È necessario un vortice per la miscelazione dell'espettorato.

Con la soluzione di decontaminazione, è necessaria la centrifuga per concentrare il campione di espettorato decontaminato e questo dovrebbe essere in grado di raggiungere 3000 G.La centrifuga non deve essere refrigerata, ma è assolutamente essenziale che sia sicura per il bios e per essere sicura per il bios. Per i lavori sui micobatteri che richiedono che i secchi della centrifuga possano essere sigillati con coperchi chiudibili a chiave. È necessaria un'incubatrice in grado di raggiungere i 37 gradi centigradi e mantenere i 37 gradi centigradi.

Non è necessario che questo sia arricchito di CO2. Per leggere le piastre mods è necessario un microscopio invertito, e questo dovrebbe avere obiettivi di quattro x e 10 x e l'autoclave è necessaria per sterilizzare i terreni e anche per lo smaltimento della coltura microbatterica, i micro rifiuti sono necessari per l'aliquot nei terreni, una cabina di sicurezza biologica. La classe due è richiesta per le procedure che comportano la manipolazione di campioni di espettorato e l'inoculazione di piastre.

I reagenti necessari per eseguire le modifiche sono i seguenti, Middlebrook sette H nove media cascione e glicerolo Panta, che è l'integratore antibiotico e OADC. Le scorte di integratori alimentari degli antibiotici sono e rifampicina dimetil solfossido, DMSO per la preparazione di rifampicina, idrossido di sodio, citrato di sodio e nyl cisteina per la decontaminazione dell'espettorato di, fosfato di sodio e fosfato monopotassico per la preparazione del tampone fosfato, ipoclorito di sodio al 10% per lo smaltimento dei rifiuti infetti e disinfettante per la pulizia delle superfici di lavoro. Sono inoltre necessarie le seguenti materie plastiche e materiali di consumo: provette di vetro sterili, filtri da 0,2 micrometri per solventi acquosi e filtri da 0,2 micrometri per solventi organici, provette per microcentrifuga, provette da centrifuga da 15 mil, peppe sierologiche sterili da 50 millilitri, 10 millilitri, punte per micropipette sterili Past Peppes, piastre per colture tissutali a 24 pozzetti e sacchetti per ine sigillabili di tipo Ziploc, che vengono posizionate dopo che il campione di espettorato è stato inoculato nel terreno.

Ci sono quattro gruppi di soluzioni stock che possono essere preparate in anticipo. La soluzione tampone fosfato è costituita da una combinazione di soluzioni monobasiche di fosfato di sodio, diba e fosfato di potassio regolate a un pH di 6,8 più o meno 0,2. Questa soluzione viene sterilizzata in autoclave a una temperatura compresa tra 121 e 124 gradi centigradi per 15 minuti e un'aliquota viene coltivata su agar nutriente per confermare la sterilità.

Questo può essere conservato in frigorifero a una temperatura compresa tra due e otto gradi centigradi per un massimo di un mese. Ogni campione di espettorato richiede 10 millilitri di soluzione tampone fosfato. La soluzione madre per la decontaminazione dell'espettorato è una combinazione di idrossido di sodio citrato di sodio.

Queste soluzioni sono combinate in volumi uguali e sterilizzate in autoclave a 121-124 gradi centigradi per 15 minuti e possono anche essere conservate in frigorifero a una temperatura compresa tra due e otto gradi centigradi per un massimo di un mese. Sono necessari due millilitri di questa soluzione per ogni campione di espettorato. Il terreno di coltura di base è composto da Middlebrook seven H nine con cascione e glicerolo.

La polvere di sette H nove viene sciolta in acqua distillata sterile contenente glicerolo e cascione e mescolata con agitazione costante fino a completa dissoluzione. Questo mezzo viene sterilizzato in autoclave a una temperatura compresa tra 121 e 124 gradi centigradi per 15 minuti e, dopo il raffreddamento, viene diviso in quat da 4,5 millilitri in tubi di vetro sterili da 16 x 100 millimetri. Il terreno viene incubato a 37 gradi per 48 ore per verificare la sterilità, che è indicata da una mancanza di torbidità dopo questo tempo e può essere conservato a una temperatura compresa tra due e otto gradi centigradi con il tappo ben chiuso per un massimo di un mese.

Ogni campione di espettorato richiede una provetta contenente 4,5 millilitri di questa coltura. Le soluzioni madre antibiotiche medie vengono preparate come segue, vengono sciolte completamente in acqua distillata sterile e filtrate con un filtro a siringa da 0,2 micrometri per solventi acquosi. Le aliquote da 20 microlitri possono quindi essere conservate in provette sterili per microcentrifugazione a meno 20 gradi centigradi per un massimo di sei mesi, ogni aliquota da 20 microlitri è sufficiente per un massimo di cento campioni.

Le soluzioni stock di rifampicina da otto milligrammi per mil sono preparate sciogliendo la rifampicina in DMSO e acqua distillata sterile. Questa miscela viene filtrata con un filtro a siringa da 0,2 micrometri per solventi organici e la soluzione può essere conservata in aliquote da 20 microlitri in provette sterili per microcentrifuga a meno 20 gradi centigradi per un massimo di sei mesi, ogni aliquota da 20 microlitri è sufficiente per un massimo di 100 campioni. Veniamo ora alla parte della metodologia vera e propria e ai tre passaggi che è necessario compiere il giorno della procedura.

Questo sta convertendo le soluzioni di serie in soluzioni funzionanti. Prima abbiamo la soluzione di decontaminazione, poi abbiamo la soluzione dei supporti. E infine, le soluzioni funzionanti dei farmaci sono e Rifampicina.

Il metodo di decontaminazione, utilizzato per la metodologia mods, è la metodologia standardizzata di decontaminazione con idrossido di sodio nalk. Il nalk è un mucolitico, che aiuta a digerire l'espettorato e permette all'idrossido di sodio di effettuare la decontaminazione. Per questo, abbiamo bisogno della nostra soluzione madre di idrossido di sodio citrato di sodio e 0,1 grammi di NA vengono aggiunti a 20 ml di quella soluzione.

Qualsiasi soluzione che non viene utilizzata il giorno della preparazione deve essere scartata. Anche la preparazione finale del terreno di coltura deve essere effettuata solo il giorno dell'uso. I sette terreni H nine conservati sono combinati con OADC e Panta: 4,5 millilitri di terreno sono combinati con 0,5 millilitri di OADC e 0,1 millilitri di Panta in ciascuna provetta.

Questo è sufficiente per un campione. Le soluzioni funzionanti di ciascun farmaco vengono preparate il giorno dell'uso e tutte le soluzioni che non vengono utilizzate devono essere scartate perché l'attività non può essere garantita. Le aliquote conservate vengono diluite in 24. Piastre di coltura tissutale a pozzetti in serie con terreni sette H nove oh A DC in modo tale che la concentrazione finale del pozzetto che si ottiene dopo l'aggiunta del campione di espettorato con terreno sia di 0,4 microgrammi per mil di acido forico e di un microgrammo per mil per la rifampicina.

Passiamo ora alla procedura di decontaminazione, due mil di campione di espettorato vengono inseriti in una provetta Falcon a base conica e vengono quindi aggiunti due mil della nostra soluzione decontaminante di latte idrossido di sodio. Il coperchio viene riposizionato e avvitato saldamente, dopodiché la sospensione viene a vortice e lasciata riposare per 15 minuti, durante i quali avviene la procedura di decontaminazione. Trascorso questo tempo, vengono aggiunti 14 millilitri di soluzione tampone fosfato.

Il coperchio viene riposizionato e avvitato ermeticamente e la provetta viene inserita nella centrifuga dopo 50 minuti a 3000 G, il surnatante S viene travasato e il pellet che rimane è il campione che desideriamo preparare utilizzando le provette da 5,1 millilitri di sette panter H nine OEDC. Il nostro pellet viene risospeso a un volume di circa due millilitri. Metà di questo campione risospeso viene conservato come backup in una provetta per microcentrifuga.

Questo è quindi disponibile nel caso in cui la nostra coltura venga contaminata e sia necessario espiare nuovamente il campione. L'altro millilitro viene aggiunto ai restanti sette H nine oh un panter DC che si trova nel nostro tubo di vetro, e questo è il nostro campione pronto per la placcatura. 900 microlitri di questa sospensione di terreno e campione vengono posti in ciascuno dei quattro pozzetti in una colonna di una piastra da 24 pozzetti.

I pozzetti rimanenti della piastra a 24 pozzetti vengono riempiti con campioni successivi in modo tale che cinque campioni riempiano una piastra da 24 pozzetti, uno per ciascuna delle cinque colonne, e la sesta colonna viene lasciata senza campione. La sesta colonna funge da controllo negativo in questa colonna. Sono stati posizionati tutti i componenti del terreno senza un campione di espettorato e chiaramente qualsiasi crescita in questa colonna indica che abbiamo un problema con la contaminazione incrociata e l'intera piastra deve essere scartata.

Ogni lastra che eseguiamo richiede una colonna di controllo negativo. Quindi ora abbiamo la nostra lastra contenente tutti i nostri campioni e terreni. Dobbiamo aggiungere le nostre sospensioni antibiotiche in una piastra separata.

Abbiamo preparato le nostre diluizioni come descritto in precedenza di Rifampicina e Isid, e con un multi pet a quattro canali, raccogliamo 100 microlitri da ciascuno di questi pozzetti e distribuiamo 100 microlitri di sette H nove OADC a ciascuno dei due pozzetti di controllo e 100 microlitri di Rifampicina e 100 microlitri di isid a ciascuno dei due pozzetti contenenti farmaci. Una volta completato il piatto, il coperchio viene riposizionato all'interno. Da questo punto in poi, una sacca Ziploc non viene più aperta e, pertanto, le colture che crescono in terreni liquidi non hanno mai l'opportunità di lasciare la sacca.

Tutte le letture della piastra d'ora in poi vengono eseguite all'interno della sacca e la sacca viene posta in una sacca per autoclave e scartata alla fine della coltura. E in questo modo, evitiamo la manipolazione di sospensioni altamente concentrate di micobatteri. Adesso diremo solo qualche parola sul controllo di qualità.

Ci sono controlli di qualità integrati nella metodologia mods, che sono essenziali per l'uso corretto del test. Innanzitutto, ci sono i controlli negativi e questi vengono eseguiti su ogni singola piastra. Questi sono stati menzionati in precedenza, ma in sintesi, abbiamo una colonna che contiene tutti i costituenti del terreno senza la presenza di un campione di espettorato insieme ad altri cinque campioni di espettorato su una piastra, i pozzetti nella colonna devono essere esaminati proprio come qualsiasi altro pozzetto e la presenza di qualsiasi crescita in questi pozzetti indica che la contaminazione incrociata ha avuto luogo e che nessuno dei risultati sulla piastra può quindi essere attendibile.

La piastra deve quindi essere scartata e tutti i campioni devono essere nuovamente placcati. Inoltre, ci sono controlli interni che sono controlli positivi. Questi vengono eseguiti su una piastra separata e questa piastra viene preparata dopo che tutte le altre piastre del campione sono state preparate alla fine della giornata per ridurre al minimo il rischio di contaminazione incrociata all'interno del laboratorio.

Su questa piastra separata, eseguiamo un ceppo completamente sensibile di Mycobacterium tuberculosis e un ceppo resistente all'isid e alla rifampicina. Se ci sono dubbi sull'esecuzione di un ceppo multiresistente a più farmaci su una piastra, un ceppo monoresistente alla rifampicina può essere eseguito senza un ceppo monoresistente al posto di questi due ceppi sensibili e MDR. Lo scopo di questi ceppi è quello di dimostrare non solo che i media supportano la crescita, quindi tutti i nostri controlli positivi dovrebbero avere una crescita nella ricchezza libera dalla droga, ma anche che le nostre concentrazioni di droga sono corrette e quindi i controlli positivi suscettibili non dovrebbero crescere in presenza di is e Rifampicina e i controlli positivi resistenti dovrebbero ovviamente crescere attraverso le concentrazioni di Rifampicina e is che sono presenti nella piastra.

Ok, ora passiamo alla lettura delle targhe. Se consideriamo il giorno di placcatura dei nostri campionatori, la lettura della lastra del giorno zero inizia il quinto giorno. Prima di allora, la crescita dei micobatteri era molto rara.

Le lastre vengono esaminate al microscopio ottico invertito. Vale a dire che le piastre vengono esaminate dal basso verso l'alto, e questo ci permette di vedere molto chiaramente le corde cercando di visualizzare le colture dall'alto è ostacolato dalla condensa sul coperchio delle lastre, e anche perché la lunghezza focale non è adeguata a un microscopio standard. L'esame microscopico viene generalmente effettuato con le colture positive 10 volte oggettive considerate come quelle in cui ci sono almeno due unità formanti colonie in entrambi i pozzetti privi di farmaci.

La presenza di contaminazione è facilmente riconoscibile perché il terreno diventa torbido e al quinto giorno c'è generalmente una crescita eccessiva della maggior parte del pozzo. Al contrario, la crescita dei micobatteri non porta a una torbidità della crescita iniziale dei micobatteri sotto forma di piccole forme simili a virgole, che progrediscono costantemente fino a formare corde o grovigli caratteristici. Entro due settimane, una crescita fortemente positiva avrà formato conglomerati di micobatteri con cordoni visibili solo alle estremità.

La stragrande maggioranza delle colture che stanno per diventare positive sono positive entro il giorno 14, e quindi raccomandiamo letture giornaliere dal quinto al giorno 14 e successivamente letture ogni due o tre giorni in base al carico di lavoro di laboratorio Il giorno in cui una coltura è chiaramente positiva nei due pozzetti senza farmaci, il farmaco contenente pozzetti dovrebbe essere letto. Qualsiasi crescita in presenza di uno dei due farmaci indica resistenza a quel farmaco. È molto importante notare che se la regione del farmaco contenente pozzetti viene eseguita più di una settimana dopo che è stata notata una coltura positiva nei pozzetti privi di farmaco, ciò potrebbe non rappresentare una resistenza poiché si osserva una crescita occasionale.

Le letture possono interrompersi al giorno 21 se una coltura è negativa, poiché le colture positive dopo questo periodo non vengono mai riscontrate nei pazienti che non ricevono la terapia. Al termine dei 21 giorni di incubazione, le colture possono essere scartate. Le colture rimangono all'interno delle loro sacche Ziploc e vengono poste in sacche per autoclave e autoclave a 121-124 gradi centigradi per 45-60 minuti, dopodiché possono essere scartate in sicurezza. Ora dirò solo qualche parola sulla biosicurezza e sul test delle mod, dato che abbiamo lanciato le mod non solo in Perù, ma anche in Africa e Asia.

Sorge una domanda ricorrente sulla sicurezza e la bioprotezione dell'uso di colture microbatteriche in terreni liquidi. Questa è una paura comprensibile perché ovviamente i liquidi possono essere versati e i mezzi solidi non comportano questo rischio, e c'è anche il rischio di aerosolizzazione quando abbiamo a che fare con sospensioni di micobatteri. In realtà è proprio per questi motivi che crediamo che la metodologia mod sia una metodologia più sicura di qualsiasi metodologia che richieda test indiretti di suscettibilità ai farmaci.

La ragione di ciò è che per i test di suscettibilità indiretta viene preparata una sospensione di una concentrazione nota di microbatteri. Ciò comporta quindi la manipolazione di soluzioni altamente concentrate di microbatteri con tutti i rischi connessi di fuoriuscita e aerosolizzazione. Al contrario, la metodologia mods, come avrete visto, prevede semplicemente l'inoculazione di un campione di espettorato nella nostra piastra, dopodiché la piastra viene sigillata all'interno di un sacchetto di plastica.

Questo sacchetto non viene mai più aperto, e quindi non dobbiamo avere a che fare con queste sospensioni altamente concentrate. Questo non vuol dire che crediamo che la metodologia mod sia completamente sicura: maneggiare i micobatteri comporta sempre un rischio. Tuttavia, i dati provenienti dalla Corea pubblicati nel 2006 sembrano aver confermato la nostra posizione secondo cui le mod non sono più pericolose che denigrare qualsiasi altra cultura.

Si tratta di uno studio condotto su lavoratori di laboratorio, che ha dimostrato che i rischi professionali per i lavoratori di laboratorio che preparano le colture e non hanno alcuna responsabilità per i test di sensibilità ai farmaci non sono maggiori di quelli per coloro che eseguono la microscopia a striscio di espettorato. Al contrario, coloro che maneggiano sospensioni di micobatteri e fanno test di suscettibilità ai farmaci hanno tassi molto più elevati di rischio professionale per la tubercolosi. Chiaramente, è di fondamentale importanza che tutto il personale del laboratorio del lavoro sia protetto il più possibile, e quindi raccomandiamo vivamente che nessuna di queste procedure venga eseguita senza un'adeguata protezione respiratoria personale, con cui intendiamo maschere standard N95.

Inoltre, è richiesta una cappa o una cappa di sicurezza biologica di classe due in cui tutte le aree esauste vengono filtrate attraverso filtri HEPA. Infine, un semplice meccanismo molto importante per evitare turbolenze del flusso d'aria all'interno di un laboratorio è una serratura sulla porta del laboratorio per impedire l'ingresso e l'uscita del personale durante l'elaborazione dei campioni. Ciò riduce il rischio di trasmissione all'interno del laboratorio, quindi spero che questo ti abbia fornito una buona panoramica di ciò che comporta la metodologia mods e e quanto potrebbe essere utile in contesti in cui le risorse sono limitate, ma sono urgentemente richieste diagnostiche di alta qualità per la TB e la MDR.

Per ulteriori informazioni, puoi visitare il nostro sito web, mods peru. org, dove troverai le nostre dettagliate procedure operative standard, la guida per l'utente alle mod. Oltre alle SOP per l'elaborazione di campioni extra polmonari, disponiamo anche di una libreria fotografica di micobatteri e tubercolosi, altri micobatteri e contaminazione batterica e fungina, e puoi anche trovare la nostra strategia di garanzia della qualità e la procedura che consigliamo per l'accreditamento dei laboratori per iniziare a utilizzare i mod.

Infine, c'è un foglio di domande frequenti e accogliamo con favore qualsiasi feedback da parte degli utenti che stanno attualmente utilizzando le mod poiché si tratta di una metodologia iterativa. Come abbiamo spiegato in precedenza, si tratta di un test non proprietario e siamo sempre interessati ai miglioramenti che altri laboratori sono riusciti ad apportare.