Name: Dissezione del sistema nervoso centrale larvali in Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-11-09T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Impara la dissezione del sistema nervoso centrale in larve di Drosophila melanogaster. Questa tecnica consente di studiare l'espressione proteica nel sistema nervoso con precisione anatomica.

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<ol><li> Sezionare 3 ° larve instar, lasciando collegato al sistema nervoso centrale la cuticola. Mettere in una provetta da 1,5 ml. </li><li> Fissare in PBS (1x) contenente 2% di formaldeide per 40 minuti con dondolo. ; Usa 250ul per ogni SNC 5-10 sezionato. </li><li> Rimuovere la formaldeide e brevemente lavare 3 volte con PBS + 0.1% Triton X-100 (PBST). Utilizzare una pipetta Pasteur finemente tirato per evitare la perdita di tessuto. </li><li> Blocco non specifici siti di legame con le proteine ​​e le membrane delle cellule permeabilize incubando tessuto 1-8 ore in PBST + 5% di BSA, dondolo a 4 ° C. </li><li> Incubare in anticorpo primario diluito in PBST + 5% di BSA a dondolo a 4 ° C durante la notte. Diluizione degli anticorpi ottimale varia per gli anticorpi diversi. </li><li> Sciacquare 3x in PBST seguito da due lavaggi 30min a 4 ° C. </li><li> Incubare in anticorpo secondario diluito in PBST + 5% di BSA per 1-3 ore a dondolo a 4 ° C. Sciacquare 3x in PBST seguito da due lavaggi 30min a 4 ° C. Se il secondario è coniugato con un composto sensibile alla luce, avvolgere il tubo in foglio di alluminio. </li><li> Sezionare il tessuto ulteriormente (se necessario) e montata sul diapositive. </li></ol>

<ol>
	<li>Lin, D. M., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopic+and+increased+expression+of+fasciclin+II+alters+motoneuron+growth+cone+guidance.">Ectopic and increased expression of fasciclin II alters motoneuron growth cone guidance.</a> Neuron. 13, 507-523 (1994).</li><li>Park, Y., Fujioka, M., Kobayashi, M., Jaynes, J., Datta, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=even+skipped+is+required+to+produce+a+trans-acting+signal+for+larval+neuroblast+proliferation+that+can+be+mimicked+by+ecdysone.+Development+128.">even skipped is required to produce a trans-acting signal for larval neuroblast proliferation that can be mimicked by ecdysone. Development 128.</a> , 1899-1909 (2001).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

Questo video mostra come sezionare il sistema nervoso centrale da terzi larve instar Drosophila. Dopo la dissezione, il sistema nervoso centrale possono essere colorati utilizzando un protocollo standard di immunoistochimica. Attualmente, è molto più ancora sconosciuto su come il sistema nervoso adulto è generato e come si memorizza e trasmette informazioni. Studi della Drosophila sviluppo larvale SNC dovrebbe accrescere la nostra conoscenza del cablaggio del sistema nervoso e la funzione. Larve di Drosophila presentano una serie di...

<table><tbody><tr><td>Pinzette</td><td>a punta fine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri da 9 pozzi</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piatto di Petri in plastica</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dissezione del sistema nervoso centrale larvali in drosophila melanogaster

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

Il sistema nervoso centrale (SNC) di larve di Drosophila è complessa e poco conosciuta. Un modo per indagare il sistema nervoso centrale è quello di utilizzare immunoistochimica per esaminare l&#39;espressione di nuove e diverse proteine ​​marker. La colorazione delle larve di tutto non è praticabile perché la cuticola dura anticorpi impedisce di penetrare all&#39;interno della cavità del corpo. Al fine di macchiare questi tessuti è necessario sezionare l&#39;animale prima di fissaggio e la colorazione. In questo articolo mostriamo come a sezionare le larve di Drosophila, senza danneggiare il sistema nervoso centrale. Inizia strappare la larva a metà con un paio di pinze bene, e poi girare la cuticola &quot;inside-out&quot; per esporre il sistema nervoso centrale. Se la dissezione viene eseguita con cura il sistema nervoso centrale rimarranno attaccati alla cuticola. Noi di solito mantenere il sistema nervoso centrale collegato alla cuticola durante le fasi di fissazione e colorazione, e solo rimuovere completamente il sistema nervoso centrale dalla cuticola appena prima del montaggio dei campioni su vetrini. Mostriamo anche alcune immagini rappresentative di un sistema nervoso centrale larvale macchiata di Eva, un fattore di trascrizione espresso in un sottogruppo di neuroni nel sistema nervoso centrale. L&#39;articolo si conclude con una discussione di alcuni degli usi pratici di questa tecnica e le potenziali difficoltà che potrebbero sorgere.

In questo articolo mostriamo come di sezionare il sistema nervoso centrale da terze larve instar Drosophila.

Dissezione del sistema nervoso centrale larvali in Drosophila melanogaster

Il sistema nervoso centrale (SNC) delle larve di Drosophila è complesso e poco conosciuto. Un modo per indagare l'SNC consiste nell'utilizzare l'immunoistochimica per...

Mi chiamo Nate Fer. Sono uno studente laureato qui a Princeton. Ok. La cosa che vuoi fare è trovare il verme e poi trasferirlo in una piastra con del PBS.Quindi ecco come appariranno; tagliateli a metà e tutte le interiora fuoriescono. Qui ho l'esoscheletro con un insieme di strutture interne, e cerco di assicurarmi che sia rivoltato, verificando che il sistema nervoso centrale sia ancora attaccato. Ok. Sì. È proprio qui.Proprio lì. Quale? Puoi vedere sulla pinza alla mia destra.Ecco, hai due lobi diversi e poi c'è il sistema nervoso centrale stesso che si estende verso il basso come una radice principale, proprio qui sul lato destro degli uncini boccali scuri e del resto della cuticola. Vorresti separare il sistema nervoso centrale in questo modo? Sì, certo.Posso farcela. E questa è una vista dall'alto verso il basso. Quindi si vedono i due lobi e poi il sistema nervoso centrale stesso.Allora, perché si esegue questo esperimento? Beh, siamo interessati allo studio dell'espressione proteica nel sistema nervoso delle larve. E quindi il modo migliore per farlo è semplicemente dissociare il tessuto larvale.E poiché è difficile per gli anticorpi penetrare attraverso la cuticola in un tessuto intero, isoliamo prima il sistema nervoso centrale della larva e poi utilizziamo il tessuto dissezionato per effettuare l'analisi desiderata per quanto riguarda la colorazione proteica. E perché lo fate? Perché proprio questo approccio?Nel caso specifico, dipende davvero dai propri interessi in termini di analisi. La proteina che sto studiando è espressa durante tutto lo sviluppo, e vogliamo osservare come cambia la localizzazione della proteina e quali tipi di cellule la esprimono. Pertanto, desideriamo ottenere un andamento temporale lungo tutto lo sviluppo.Quali sono i problemi specifici di questo esperimento? Beh, uno dei problemi, come ho accennato all'inizio, è che è necessario dissezionare il tessuto. Di conseguenza, ci sono molte difficoltà, almeno inizialmente, soprattutto per quanto riguarda l'abilità tecnica necessaria per tenere ferma la larva, aprirla con attenzione ed eseguire la tecnica a camera rovesciata.Per raggiungere il SNC esposto, sarà necessario utilizzare una pinzetta con punte fini. Infatti, se le punte della pinzetta non sono abbastanza sottili, sarà come lavorare con i guantoni invece che con le dita. Pertanto, all'inizio può risultare un po' difficile imparare la tecnica, ma successivamente non è così complicato.E, in realtà, la colorazione non è affatto così difficile. Si tratta semplicemente di una colorazione standard con anticorpi. Ma bisogna fare attenzione quando si pipettano le soluzioni su e giù nel tubo, per non perdere il tessuto, che può essere piuttosto piccolo.

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