Name: Protocolli per infezione orale delle larve di lepidotteri con Baculovirus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-09-03T23:29:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Impara le tecniche di infezione orale di larve di lepidotteri con baculovirus per valutare l'efficacia insetticida. Questo metodo include saggi di alimentazione con gocce e cubetti di dieta per determinare dosi letali.

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Si prega di visitare <a href="http://www.springerprotocols.com/Abstract/doi/10.1007/978-1-59745-457-5_18">protocolli Springer</a> per saperne di più sul baculovirus ingegneria come agente insecidical e le tecniche di infezione orale utilizzati in questo test.

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

protocolli per infezione orale delle larve di lepidotteri con baculovirus

Protocols for Oral Infection of Lepidopteran Larvae with Baculovirus

Baculoviruses sono ampiamente utilizzati sia come vettori di espressione proteica e come agenti di controllo degli insetti infestanti. Questo video mostra come le larve di lepidotteri possono essere infettati con poliedri da goccioline di alimentazione e dieta plug-biotest. Questo accompagnamento Springer protocolli sezione offre una panoramica del ciclo di vita baculovirus e l&#39;uso di baculoviruses come agenti di insetticidi, con discussione dei pro e dei contro per l&#39;uso di baculoviruses come insetticidi, ei progressi compiuti nel miglioramento genetico di baculoviruses per una migliore efficacia insetticida.

In questo video, dimostriamo tecniche di infezione orale delle larve di lepidotteri con baculovirus per determinare l&#39;efficienza insetticida.

Protocolli per infezione orale delle larve di lepidotteri con Baculovirus

I baculovirus sono ampiamente utilizzati sia come vettori per l'espressione proteica che come agenti per il controllo dei parassiti insetti. Questo video mostra come le larve di lepidotteri possano essere...

Il virus Vao è comunemente utilizzato come vettore di DNA in combinazione con linee cellulari di insetti per l'espressione proteica. Tuttavia, il fatto che questo virus infetti efficacemente gli insetti con conseguenze letali lo rende anche un agente insetticida efficace. In Brasile, ad esempio, il virus balo di tipo selvaggio viene applicato su oltre 1 milione di ettari di coltivazioni di soia ogni anno per il controllo della larva del fagiolo vellutato; per aumentarne l'efficacia insetticida, i virus Balo sono stati ingegnerizzati geneticamente con geni che codificano tossine specifiche per insetti attive all'interno dell'emolinfa dell'insetto.In questo video, dimostriamo metodi per l'infezione orale di larve di lepidotteri con il virus bacao al fine di analizzarne l'efficacia insetticida. Ciao, sono del laboratorio Blind Boning del Dipartimento di Oftalmologia della Iowa State University, e io sono Wendy Sparks, anch'io del laboratorio Boning. Oggi vi mostreremo due procedure per l'infezione da virus VA di lter e larve.Prima, Harran ti mostrerà come infettare larve neonate utilizzando un saggio biologico mediante alimentazione per gocciolamento. Successivamente, ti mostrerò come infettare larve a stadio intermedio o avanzato utilizzando un saggio biologico con dieta arricchita con sangue. Cominciamo dunque.I saggi biologici con somministrazione tramite goccioline possono essere utilizzati per determinare la dose letale di abacavir e la sopravvivenza in base al tempo di larve infettate dal virus balo. Per questo saggio si utilizzano generalmente larve di primo stadio o neonate.Prima di iniziare, assicurarsi di avere a disposizione i contenitori con la dieta appropriata. Inoltre, preparare le opportune diluizioni del virus aggiungendo colorante alimentare verde fino a una concentrazione del 4% in volume. Per determinare la concentrazione virale letale, la diluizione deve produrre un intervallo di mortalità compreso tra l'1% e il 99%. Potrebbero essere necessari bio saggi preliminari per stabilire un intervallo adeguato di concentrazioni virali. Dopo aver agitato il tubo con il vortex per evitare l'aggregazione dei poliedri, depositare due cerchi concentrici di piccole gocce della soluzione virale in una piastra di Petri da 60 millimetri.Per ogni concentrazione di virus utilizzata, ricordarsi di preparare anche un controllo negativo con infezione fittizia. Successivamente al trattamento, trasferire da 25 a 30 larve neonate al centro dei cerchi concentrici utilizzando un pennello sterile. Chiudere il piatto con il coperchio e sigillarlo con parafilm per impedire alle larve di uscire.È consigliabile utilizzare pennelli diversi per il trasferimento di ciascun tipo di virus, al fine di evitare contaminazioni tra i diversi trattamenti. Lasciare la piastra a temperatura ambiente per 10-15 minuti, periodo durante il quale i larve ingeriscono il cibo. Le larve che si sono alimentate possono essere identificate dalla colorazione verde dell'intestino anteriore, risultante dal trasferimento del colorante alimentare verde; trasferire esclusivamente queste larve in contenitori di plastica da un'oncia contenenti alimento, mettendo una larva per contenitore.Dopo il trasferimento delle larve, coprire i contenitori con i coperchi e incubare a 28 °C per 24 ore dopo l'infezione. Eliminare tutti i contenitori che contengono larve morte. Queste morti precoci sono probabilmente dovute a lesioni provocate dalla manipolazione.Quando si utilizza questo bioassay per determinare la dose letale, le larve devono essere controllate ogni due o tre giorni fino a quando le larve di controllo non infette e qualsiasi larva trattata con il virus sopravvissuta avranno purgato o avranno iniziato a scavare per impuparsi; le larve infette dal virus rimarranno in superficie al cibo e moriranno dopo alcuni giorni. Le larve morte talvolta si raggrinziscono e diventano nere; le larve che muoiono a causa dell'infezione diventano essenzialmente sacche di poliedri, che si dissolveranno completamente. Se perturbate meccanicamente in questo momento, registrare la mortalità larvale per ogni trattamento.Gli esperimenti per determinare la concentrazione letale devono essere ripetuti tre o quattro volte in occasioni distinte. Utilizzare 30 individui per ciascuna dose per ogni trattamento con virus o controllo. Utilizzare un programma appropriato di analisi probit, come polo o SAS, per calcolare i valori di lc 50, gli intervalli di confidenza al 95% e le statistiche appropriate.Questo saggio di alimentazione tramite gocce può essere utilizzato anche per determinare i valori di tempo di sopravvivenza ST 50. In questo caso, la mortalità dei larvi viene valutata ogni quattro-otto ore con osservazioni più frequenti. Se il tasso di mortalità è elevato, i saggi del tempo di sopravvivenza vengono eseguiti utilizzando una dose lc 99 del virus; i tempi medi di sopravvivenza e i limiti di confidenza al 95% vengono calcolati mediante il metodo stimatore di Kaplan-Meier, usando un programma S-PLUS o SAS.Ora che Harang ti ha mostrato il saggio biologico con alimentazione a gocce, ti mostrerò il saggio biologico con tappo di dieta. Nel saggio con tappo di dieta, larve a stadio intermedio o avanzato vengono nutrite con un tappo di dieta trattato con una dose nota di virus per determinare la dose letale o LD 50. Il giorno precedente l'esecuzione del saggio, rimuovi la dieta dal bicchiere per far sì che le larve digiunino per tutta la notte.Questo passaggio aumenterà la velocità con cui le larve ingeriscono il virus. Il giorno successivo, inoculare il cubetto di dieta, preparando la dieta tagliandola in piccoli cubi di circa due millimetri cubi. Se i cubetti di dieta sono troppo piccoli, si seccheranno.Se i cubetti di dieta sono troppo grandi, le larve non riusciranno a consumare l'intero cubetto di dieta durante la notte. Aggiungere ora uno o due microlitri di sospensione di poliedri a ciascun cubetto di dieta. La sospensione contiene il 4% in volume di colorante alimentare.Lasciare che la sospensione venga assorbita dalla dieta per cinque-quindici minuti. Ricordare di preparare anche un cubo di dieta trattato con virus fittizio come controllo negativo. Successivamente, trasferire un cubo di dieta a ciascun larva del quarto stadio in ogni coppetta.Quindi, il giorno successivo, posizionare le provette nell'incubatrice a 28 gradi Celsius per tutta la notte; scartare le larve che non hanno completamente consumato il cubetto di dieta. Successivamente, aggiungere un pezzo grande di dieta in ciascuna provetta per le larve rimanenti. Mantenere le larve a 28 gradi Celsius, aggiungendo ulteriore dieta secondo necessità, fino a quando le larve mock-infette e le larve infette dal virus sopravvissute avranno smesso di alimentarsi o avranno iniziato la pupazione.In questo momento, registrare il numero di insetti morti e quelli sopravvissuti. Mostreremo soltanto due metodi per infettare gli insetti con il virus back, il prelievo ematico e la biopsia della dieta tramite piastra. Durante questa procedura, è importante ricordare che i cadaveri di larve uccise dal virus sono tipicamente fragili e possono rompersi facilmente, rilasciando il virus.Pertanto, sterilizzare le superfici di lavoro e smaltire i guanti contaminati e i materiali monouso in modo appropriato per prevenire contaminazioni. Questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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In questo video, dimostriamo microapplicator due tecniche utilizzate per infettare le larve di lepidotteri con baculovirus per determinare l'efficienza insetticida.

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Il metodo qui descritto utilizza l'iniezione diretta di batteri entomopatogeni nella hemocoel...

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L&#39;insetto<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Come un modello di infezione potente per Indagare Patogenesi batterica

Questo video mostra un metodo per stabilire un modello di infezione da Mycobacterium bovis nelle larve della falena della cera maggiore, Galleria mellonella. Un ceppo bioluminescente di Mycobacterium bovis BCG viene iniettato nell'emolinfa della larva per stabilire l'infezione e la bioluminescenza viene misurata a intervalli predefiniti per studiare il progresso dell'infezione.

Una tecnica per stabilire un modello di infezione batterica nelle larve di insetti

La mosca mediterranea della frutta (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) è un parassita dell'agricoltura mondiale. Una comprensione più profonda della sua biologia è fondamentale per controllare le popolazioni di mosche e quindi ridurre l'impatto economico. La microiniezione di embrioni è uno strumento fondamentale che consente sia la trasformazione della linea germinale che gli studi di genetica inversa in questa specie.

Consegna degli acidi nucleici attraverso Embrione microiniezione in tutto il mondo agricolo parassita,<em&gt; Capitata Ceratitis</em

Questo protocollo descrive un sistema di espressione di proteina indotta da scossa di calore (sistema pDHsp/V5-His/sf9 cellulare), che può essere utilizzato per esprimere proteine straniere o per valutare l'attività anti-apoptotica di potenziali proteine straniere e loro troncato amminico acidi in cellule di insetto.

Espressione transiente di geni estranei in cellule di insetto (sf9) per analisi funzionale della proteina

In questo protocollo, baculovirus è prodotta dalla trasfezione transiente del baculovirus plasmide nelle cellule Sf9 e amplificato in una coltura di sospensione serum-free. Il supernatante è purificato mediante cromatografia di affinità di eparina e ulteriormente concentrato mediante ultracentrifugazione. Questo protocollo è utile per la produzione e purificazione di baculovirus per applicazione di terapia genica.

Produzione e purificazione di Baculovirus per applicazione di terapia genica

Qui, presentiamo un protocollo per produrre casa volare carbossilesterasi proteine in vitro con un sistema di espressione di baculovirus mediata delle cellule di insetto e successivamente funzionalmente caratterizzano i loro ruoli in che metabolizza permetrina, quindi, che conferisce piretroidi resistenza conducendo basati su cellule MTT assay e in vitro gli studi metabolici.

Caratterizzazione funzionale di Carboxylesterases in casa resistente all'insetticida mosche, Musca Domestica

Qui, presentiamo i protocolli per l'utilizzazione del insetto cella e baculovirus proteina espressione sistema per produrre grandi quantità di proteine vegetali secernuta per cristallizzazione della proteina. Un vettore di espressione di baculovirus è stato modificato con GP67 o insetto hemolin peptide di segnale per espressione di secrezione della proteina vegetale in cellule di insetto.

Modifica di vettori di espressione di Baculovirus per produrre secreti proteine vegetali nelle cellule di insetto

Il baculovirus expression vector system (BEVS) è una solida piattaforma per lo screening dell'espressione e la produzione di proteina arginina metiltransferasi (PRMT) da utilizzare per studi biochimici, biofisici e strutturali. Quantità di milligrammo di materiale possono essere prodotte per la maggior parte dei PRMT e di altre proteine di interesse che richiedono una piattaforma di espressione eucariotica.

Produzione di proteine PRMT ricombinanti utilizzando il baculovirus Expression Vector System

Gli studi strutturali e biochimici dei trasportatori di membrana umani richiedono quantità di milligrammi di proteine stabili, intatte e omogenee. Qui descriviamo metodi scalabili per lo screening, l'espressione e la purificazione di trasportatori di soluti umani utilizzando geni ottimizzati per i codoni.

Espressione e purificazione ad alto rendimento di vettori di soluti umani per studi strutturali e biochimici

Impara le tecniche di infezione orale di larve di lepidotteri con baculovirus per valutare l'efficacia insetticida. Questo metodo include saggi di alimentazione con gocce e cubetti di dieta per determinare dosi letali.

Protocolli per infezione orale delle larve di lepidotteri con Baculovirus

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