Protocolli per infezione orale delle larve di lepidotteri con Baculovirus

In questo video, dimostriamo tecniche di infezione orale delle larve di lepidotteri con baculovirus per determinare l'efficienza insetticida.

Il virus Vao è comunemente usato come vettore di DNA utilizzato in combinazione con linee cellulari di insetti per l'espressione proteica. Tuttavia, il fatto che questo virus infetti efficacemente gli insetti con conseguenze letali lo rende anche un efficace agente insetticida. In Brasile, ad esempio, il virus del balo di tipo selvatico viene applicato a più di 1 milione di ettari di colture di soia ogni anno per il controllo del bruco del fagiolo di velluto per migliorare la loro efficacia insetticida, i virus del balo sono stati geneticamente modificati con geni che codificano tossine specifiche per insetti che sono attive all'interno dell'HemosIL dell'insetto.

In questo video, dimostriamo i metodi per l'infezione orale delle larve di lepidotteri con il virus bacao al fine di analizzare l'efficacia insetticida. Ciao, vengo dal laboratorio di disossamento cieco del Dipartimento di Oftalmologia e dell'Università statale dell'Iowa, e sono Wendy Sparks anche del laboratorio di disossamento. Oggi vi mostreremo due procedure per l'infezione da virus VA di ltro e larve.

Innanzitutto, harran ti mostrerà come infettare le larve neonate utilizzando un test biologico per l'alimentazione delle goccioline. E poi ti mostrerò come infettare le larve di stadio medio-tardivo usando un biotest del sangue dietetico. Quindi iniziamo.

I biotest di alimentazione con goccioline possono essere utilizzati per determinare la dose letale di abacavir e la sopravvivenza. Tempo di larve infette dal virus balo. Per questo test vengono generalmente utilizzate larve di stadio precoce o neonati.

Prima di iniziare, assicurati di avere a portata di mano tazze dietetiche con la dieta appropriata. Inoltre, preparare il virus appropriato Le diluizioni includono colorante alimentare verde a una concentrazione del 4% in volume. Al fine di determinare la concentrazione virale letale, la diluizione dovrebbe fornire un intervallo di mortalità compreso tra uno e 99%Possono essere necessari biotest preliminari per determinare un intervallo appropriato di concentrazioni di virus dopo aver agitato la provetta per prevenire la sedimentazione dei poliedri, fare due cerchi concentrici di piccole goccioline della soluzione virale in una capsula di Petri da 60 millimetri.

Per ogni concentrazione di virus utilizzata, ricordarsi di impostare anche un controllo negativo di infezione simulata. Trattamento successivo, trasferire da 25 a 30 larve neonate al centro dei cerchi concentrici utilizzando un pennello sterile. Mettere il coperchio sul piatto e sigillare con paraforma per evitare che le larve fuoriescano.

Idealmente, utilizzare pennelli diversi per il trasferimento a ciascun tipo di virus per prevenire la contaminazione tra i trattamenti. Lasciare riposare il piatto a temperatura ambiente per 10-15 minuti, durante i quali le larve bevono. Le larve in soluzione che si sono nutrite possono essere identificate dalla colorazione verde dell'intestino anteriore risultante dal colorante alimentare verde che trasferisce solo quelle larve che si sono nutrite in bicchieri di plastica da un'oncia, che contengono il trasferimento dietetico di una larva per tazza.

Dopo aver trasferito le larve, coprire le coppette con i coperchi e incubare a 28 gradi Celsius 24 ore dopo l'infezione. Elimina tutte le coppette contenenti larve morte. Queste morti premature probabilmente derivano da lesioni da manipolazione.

Quando si utilizza questo biotest per determinare la dose letale, le larve devono essere controllate ogni due o tre giorni fino a quando le finte larve infette e le larve trattate con virus sopravvissute si sono purificate o hanno iniziato a prendere in prestito per impupare le larve infette da virus rimarranno sulla parte superiore del cibo e poi moriranno dopo pochi giorni. Le larve morte a volte diventano nere che muoiono a causa dell'infezione essenzialmente in sacchi di poliedri, che si dissolvono completamente. Se disturbato meccanicamente in questo momento, valutare la mortalità larvale in ogni trattamento.

I biotest di concentrazione letale devono essere replicati tre o quattro volte in occasioni separate. Utilizzare 30 individui per dose per ogni virus o trattamento di controllo. Utilizzare un programma di analisi delle successioni appropriato come polo o SAS per calcolare i valori lc 50, gli intervalli di confidenza del 95% e le statistiche appropriate.

Questo test di alimentazione delle goccioline può essere utilizzato anche per determinare i valori del tempo di sopravvivenza ST 50. In questo caso, la mortalità delle larve viene valutata ogni quattro-otto ore con osservazioni più frequenti. Se il tasso di mortalità è elevato, i test biologici vengono eseguiti utilizzando una dose di lc 99 del virus, i tempi mediani di sopravvivenza e i limiti di confidenza del 95% vengono calcolati utilizzando lo stimatore Kaplan Mayer utilizzando un programma s plus o SAS.

Ora che Harang ti ha mostrato il biotest sull'alimentazione delle goccioline, ti mostrerò il biotest della spina dietetica Nel biotest della spina dietetica. Le larve di Instar da metà a tardiva vengono alimentate con un plug dietetico trattato con una dose nota di virus per determinare la dose letale o LD 50 il giorno prima di condurre questo test. Togli la dieta dalla tazza per far morire di fame le larve durante la notte.

Questo passaggio aumenterà la velocità con cui le larve consumano il virus. Inoculato cubo dietetico il giorno successivo, preparare la dieta tagliandola a cubetti di circa due millimetri cubi. Se i cubetti dietetici sono troppo piccoli, si seccheranno.

Se i cubi dietetici sono troppo grandi, le larve non saranno in grado di consumare l'intero cubo dietetico durante la notte. Ora aggiungi uno o due microlitri di sospensione di poliedri a ciascun cubo dietetico. La sospensione contiene il 4% in volume di colorante alimentare.

Lascia che la sospensione si immerga nella dieta per cinque-15 minuti. Ricordati di preparare anche un finto cubo dietetico trattato con virus come controllo negativo. Quindi, trasferisci un cubo dietetico su ogni larva di quarto stadio in ogni tazza.

Quindi metti le tazze nell'incubatrice per una notte a 28 gradi Celsius il giorno successivo, scarta tutte le larve che non hanno completamente mangiato il cubo dietetico. Quindi aggiungi un grande pezzo di dieta a ogni tazza per le larve rimanenti. Mantenere le larve a 28 gradi Celsius, aggiungendo ulteriore dieta se necessario fino a quando le larve finte infette e le larve infette dal virus sopravvissute hanno mangiato o iniziato a impuparsi.

A questo punto, registra il numero di insetti morti e sopravvissuti. Ti mostreremo solo due metodi per infettare gli insetti con il virus della schiena, il sanguinamento, la biopsia alimentare e la biopsia della placca dietetica. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare che le larve uccise dal virus vao dei cadaveri sono in genere fragili e possono facilmente rompersi rilasciando il virus.

Quindi sterilizzare le superfici di lavoro e smaltire i guanti contaminati e i materiali monouso in modo appropriato per prevenire la contaminazione. Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.