Protocolli per Microapplicator assistita Infezione delle larve di lepidotteri Baculovirus

Mentre il virus baccala, specifico per gli artropodi, viene utilizzato come strumento standard di ricerca per i sistemi di espressione proteica eucariotica, è inoltre in corso di sviluppo come agente insetticida ecologicamente sicuro, in grado di uccidere insetti erbivori come i lepidotteri in natura. Le larve di lepidotteri vengono infettate dai virus baccala ingerendo foglie contaminate. Le larve o bruchi ingeriscono il virus baccala sotto forma di poliedro, una complessa struttura di particelle virali racchiuse in una grande proteina cristallina che protegge il virus dalla disidratazione.

Una volta che la larva è infettata, il virus si diffonde all'interno dell'insetto. Il virus sfrutta i meccanismi dell'ospite per la sintesi di acidi nucleici e proteine al fine di produrre ulteriore virus e poliedri. Alla fine, la larva diventa così gravemente infettata che si dissolve in un liquido vischioso di poliedri che gocciola sulle superfici delle piante ingerite dall'insetto, permettendo così al ciclo di ricominciare per determinare l'efficacia insetticida di un particolare Baca.

Le tecniche di microapplicazione della ceppa Avir e i saggi biologici possono essere combinate. Le larve di Leid dorin possono essere infettate mediante iniezione del virus privo di involucro direttamente nell'emolinfa o nella cavità corporea e si possono valutare i tassi di mortalità. Inoltre, le larve possono essere infettate con poliedri utilizzando un'iniezione assistita da microapplicatore orale e si può analizzare il momento dell'infezione a livello intestinale e di altri tessuti.

Ciao, sono Wendy Sparks nel laboratorio di Brian e Boning del Dipartimento di Entomologia della Iowa State University e provengo anche io da Boning Snap. Oggi vi mostreremo due procedure per infettare Drosophila di laboratorio con il virus del backlog. Entrambi i metodi utilizzano un microapplicatore.

Per prima cosa, vi mostrerò come utilizzare un microapplicatore per somministrare il virus corporeo nell'heni attraverso il prole. Successivamente, vi mostrerò come utilizzare il microapplicatore per somministrare il poliintestino nel midollo attraverso il mouse. Cominciamo dunque.

Quando vengono svilupati per scopi insetticidi, i virus balo contengono solitamente il gene della poliedrina per facilitare l'infezione orale delle larve di parassiti. Tuttavia, talvolta vi sono motivi per testare un virus baccala negativo per la poliedrina al fine di valutarne gli effetti insetticidi potenziali o per aggirare l'intestino di un insetto. In tal caso, l'iniezione del virus privo di poliedrina mediante un microapplicatore può essere eseguita per infettare le larve prima di avviare il saggio.

Il titolo del ceppo lavorativo del virus deve essere determinato mediante saggio delle placche o saggi di diluizione endpoint. Per esperimenti fisiologici, iniezioni di cinque volte 10 alla quarta PFU per quinto stadio larvale di H VNS sarebbero tipiche. Per iniziare questo bioassay, caricare ogni diluizione del virus in una siringa di plastica da un cc con ago a punta fine da 28,5 o 32 gauge.

Di solito da uno a tre microlitri di soluzione del virus. Con una titolazione compresa tra 10 alla settima e 10 alla ottava per millilitro, può essere utilizzata per ciascun larva in modo che caricare da 300 a 500 microlitri nella siringa sia sufficiente per la maggior parte degli scopi. Successivamente, eliminare le bolle d'aria dalla siringa tenendola in posizione verticale in modo da far risalire l'aria fino alla punta dell'ago ed espellendola.

Quindi fissare la siringa sul tubo di supporto della siringa. Impostare ora il volume a 1,0 microlitro. Per ogni goccia proveniente dall'unità di controllo del microprocessore del microapplicatore, calibrare prima l'unità di controllo per assicurare che il volume corretto venga erogato; la velocità con cui la goccia viene dispensata può essere impostata su una scala da zero a nove.

Viene comunemente utilizzato un intervallo compreso tra zero e uno. Premere l'interruttore a pedale per assicurarsi che la soluzione venga dispensata in modo appropriato. Ricordare che, se viene dispensata troppa soluzione o se l'applicazione è troppo lenta, è possibile regolare le impostazioni di volume e velocità finché non si applica il volume corretto di soluzione al tasso appropriato.

Ora sono pronto per iniziare l'iniezione per l'infezione da H VNS. I larve di quinto stadio giovanile vengono tipicamente iniettate, poiché le dimensioni maggiori degli stadi successivi facilitano il processo di iniezione. Inserire la punta dell'ago attraverso la piana di una delle zampe pro e nella cavità corporea.

Nota: quando la punta dell'ago entra nel prole, modificare la posizione del corpo della larva per evitare di danneggiare l'intestino e la parete corporea; premere ora quattro volte l'interruttore a pedale per somministrare quattro microlitri di soluzione virale nell'emocapsula. Al termine delle iniezioni, riposizionare tutte le larve nell'incubatrice a 28 gradi Celsius. Controllare frequentemente la presenza di larve morte e assicurarsi che sia disponibile una quantità adeguata di alimento per le larve sopravvissute.

Anche se gli ultimi stadi larvali non muoiono a causa di lesioni al tegumento provocate dall'iniezione, le larve devono comunque essere controllate 24 ore dopo l'iniezione per verificare eventuali danni all'intestino, che potrebbero derivare da un'infezione batterica. Questa mortalità precoce deve essere esclusa dall'analisi dei dati. Se si utilizza il saggio biologico assistito da microapplicatore con virus applicato per contatto per saggi di concentrazione letale, il saggio biologico deve essere ripetuto tre o quattro volte in occasioni distinte.

Utilizzare 30 individui per dose per ogni trattamento virale o di controllo. Utilizzare un programma appropriato di analisi probit, come Polo o SAS, per calcolare i valori di LC50, gli intervalli di confidenza al 95% e le statistiche appropriate. Questo saggio biologico può essere utilizzato anche per determinare i valori di tempo di sopravvivenza ST50 dopo l'inoculazione di una dose fissa di virus.

In questo caso, la mortalità delle larve viene registrata ogni quattro a otto ore con osservazioni più frequenti. Se il tasso di mortalità è elevato, i tempi medi di sopravvivenza con i limiti di confidenza al 95% vengono calcolati utilizzando lo stimatore di Kaplan-Meier mediante un programma S-plus o SAS. Ora che Harran vi ha mostrato il saggio biologico assistito da microapplicatore mediante virus butted.

Vi mostrerò il saggio. L'inoculazione orale di poliedri direttamente nell'intestino dell'insetto viene utilizzata quando il momento esatto dell'infezione è fondamentale. Ad esempio, quando si monitora la disseminazione del virus all'interno dell'insetto, per iniziare questo saggio sospendere i poliedri in una soluzione neutra galleggiante tre a due di glicerina e acqua da 10 a 300.

Le poliedre potrebbero essere utilizzate, ad esempio, per la quarta instar h ance. Successivamente, caricare questa soluzione in una siringa di tubercolina in plastica o vetro da un CC con ago a punta smussata da 32 gauge. Posizionare la siringa sul tubo di supporto del microapplicatore osservando al microscopio.

Tenere la larva stellare al quarto o quinto stadio, inserire l'ago attraverso la bocca fino alla regione anteriore del mesentero, quindi somministrare i poliedri. Questa tecnica richiede una certa pratica. Innanzitutto, può essere difficile tenere le larve con i guanti senza schiacciarle.

In secondo luogo, è necessario un po' di pratica per guidare l'ago oltre le parti boccali. Raccomandiamo di esercitarsi nell'inoculazione di circa 30 larve con PBS. Se doveste perforare l'intestino, sarà evidente perché le larve melanizzeranno e diventeranno nere molto rapidamente.

Anche in questo caso, poiché l'inoculazione orale assistita da microapplicatore consente di stabilire con precisione il momento dell'infezione, questo metodo risulta particolarmente utile per esperimenti in cui è fondamentale conoscere il tempo di infezione al fine di determinare come il virus si diffonde all'interno dell'insetto. Ad esempio, virus che esprimono beta-galattosidasi possono essere inoculati per via orale in larve, che successivamente vengono dissezionate in diversi intervalli di tempo per identificare quali tessuti vengono infettati e in quale momento. Mostreremo soltanto due vettori infettivi assistiti da microapplicatore. Il primo prevede un'inoculazione diretta tramite il pro-legg del virus iniettato, consentendo di aggirare la fisiologia intestinale e di valutare la letalità e il tempo letale del virus di interesse.

La seconda tecnica è stata l'inoculazione diretta nell'intestino medio utilizzando poliedri. Questo consente di somministrare una dose molto precisa direttamente nell'intestino medio, oltre a controllare con grande precisione i tempi dell'evento. Successivamente, è possibile studiare anche la mortalità e altri fenotipi del virus.

Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare che le larve morte a causa del virus baula nei cadaveri sono tipicamente fragili e possono facilmente rompersi, rilasciando il virus. Pertanto, sterilizzare le superfici di lavoro e smaltire i guanti contaminati e i materiali monouso in modo appropriato per prevenire contaminazioni. Questo è tutto.

Grazie per aver seguito. Buona fortuna con il tuo esperimento.