Protocolli per Microapplicator assistita Infezione delle larve di lepidotteri Baculovirus

Mentre il virus del baccala specifico per gli artropodi viene utilizzato come strumento di ricerca standard per i sistemi di espressione delle proteine eucariotiche, è anche in fase di sviluppo come agente insetticida sicuro per l'ambiente, che può uccidere gli insetti erbivori come i lepidotteri in natura. Le larve di lepidotteri sono infettate dai virus del baccala quando mangiano fogliame infetto. Le larve o i bruchi ingeriscono il virus del baccala in una forma nota come poliedro, che è un complesso di particelle virali impacchettate in una grande struttura proteica cristallina che protegge il virus dall'essiccazione.

Una volta che la larva è infetta, il virus buttato diffonde l'infezione all'interno dell'insetto. Il virus dirotta l'acido nucleico e il meccanismo di sintesi proteica dell'ospite per produrre più virus e poliedri. Alla fine le larve vengono infettate così completamente dal virus che si dissolvono in una melma disordinata di poliedri che gocciola sulle superfici delle piante mangiate dall'insetto, e poi il ciclo ricomincia da capo per determinare l'efficacia insetticida di un particolare Baca.

Le tecniche di micro applicatore del ceppo Avir e i biosaggi possono essere combinati. Le larve di Leid dorin possono essere infettate mediante iniezione di virus buttato direttamente nell'HemosIL o nella cavità corporea e possono essere valutati i tassi di mortalità. Inoltre, le larve possono essere infettate con poliedri utilizzando l'iniezione assistita da micro applicatore orale e può essere analizzata la tempistica dell'infezione dell'intestino e di altri tessuti.

Ciao, sono Wendy Sparks nel laboratorio di Brian e disossamento nel Dipartimento di Entomologia dell'Iowa State University E vengo anche da bis snap. Oggi vi mostreremo due procedure per infettare la DI del dotto di laboratorio con il virus dell'arretrato. Entrambi i metodi utilizzano un micro applicatore.

In primo luogo, ti mostrerò l'uso di un micro applicatore per rilasciare il virus del corpo nell'heni attraverso il prole. Quindi, quando si mostra, si utilizza il micro applicatore per erogare l'intestazione in polietilene nella protezione centrale attraverso il mouse. Quindi iniziamo.

Quando sviluppati per scopi insetticidi, i balo virus di solito contengono il gene del poliedro per facilitare l'infezione orale delle larve di parassiti. Tuttavia, a volte, ci sono motivi per testare un virus del baccala poliedro negativo per potenziali effetti insetticidi o per bypassare l'intestino di un insetto. In questo caso, l'iniezione di virus buttato utilizzando un micro applicatore può essere eseguita per infettare le larve prima di iniziare il test.

Il titolo dello stock di lavoro del virus inserito deve essere determinato utilizzando il test della placca o i test di diluizione del punto finale. Per gli esperimenti fisiologici, sarebbero tipiche iniezioni di cinque volte 10 al quarto PFU per quinto stadio H VNS. Per iniziare questo biotest, caricare ogni diluizione del virus in una siringa di plastica da un cc a Hercule con una punta dell'ago affilata calibro 28,5 o 32.

Di solito da uno a tre microlitri di soluzione virale incollata. Con un titolo da 10 a settimo, da meno 10 a un ottavo per millilitro può essere utilizzato per ogni larva in modo tale che caricare da 300 a 500 microlitri nella siringa sia sufficiente per la maggior parte degli scopi. Quindi, espellere le bolle d'aria dalla siringa tenendola in posizione verticale per portare l'aria alla punta dell'ago ed erogare.

Quindi fissare la siringa sul tubo di supporto della siringa. Ora imposta il volume su 1,0 microlitro. Per ogni goccia all'unità di controllo a microprocessore del micro applicatore, calibrare prima l'unità di controllo per assicurarsi che venga erogato il volume corretto, la velocità con cui viene erogata la goccia può essere impostata su una scala da zero a nove.

Viene comunemente utilizzato un intervallo da zero a uno. Premere l'interruttore a pedale per assicurarsi che la soluzione venga erogata in modo appropriato. Ricordare che se viene erogata troppa soluzione o se l'applicazione è troppo lenta, le impostazioni del volume e della velocità possono essere regolate fino a quando non viene applicato il giusto volume di soluzione alla velocità corretta.

Ora sono pronto per iniziare l'iniezione per l'infezione da H VNS. All'inizio del quinto, le larve dello stadio vengono tipicamente iniettate, le dimensioni maggiori degli stadi successivi facilitano il processo di iniezione. Inserire la punta dell'ago attraverso la plana di una delle gambe professionali e nella cavità del corpo.

Si noti che quando la punta dell'ago si inserisce nel prolo, modificare la posizione del corpo larvale Per evitare di danneggiare l'intestino e la parete del corpo, premere ora l'interruttore a pedale quattro volte per erogare quattro microlitri della soluzione virale nell'hemo seal. Al termine delle iniezioni, rimetti tutte le larve nell'incubatrice a 28 gradi Celsius. Controllare frequentemente la presenza di larve morte e assicurarsi che sia disponibile una dieta adeguata per le larve sopravvissute.

Anche se gli stadi tardivi non muoiono per lesioni alla cuticola derivanti dall'iniezione, le larve devono comunque essere controllate 24 ore dopo l'iniezione in caso di danni all'intestino, che potrebbero derivare da un'infezione batterica. Questa mortalità precoce dovrebbe essere esclusa dall'analisi dei dati. Se si utilizza il biotest assistito da micro applicatore con virus butted per biotest a concentrazione letale, il biotest deve essere replicato tre o quattro volte in occasioni separate.

Utilizzare 30 individui per dose per ogni virus o trattamento di controllo. Utilizzare un programma di analisi delle successioni appropriato come polo o SAS per calcolare i valori lc 50, gli intervalli di confidenza del 95% e le statistiche appropriate. Questo biotest può essere utilizzato anche per determinare i valori del tempo di sopravvivenza ST 50 dopo l'inoculazione di una dose fissa di virus.

In questo caso, la mortalità delle larve viene valutata ogni quattro-otto ore con osservazioni più frequenti. Se il tasso di mortalità è alto, i tempi mediani di sopravvivenza al 95% sono calcolati utilizzando lo stimatore Kaplan Meyer utilizzando un programma s plus o SAS. Ora che Harran vi ha mostrato il biotest assistito da micro applicatore utilizzando il virus butted.

Ti mostrerò il test. Utilizzo dei poliedri L'inoculazione orale di poliedri direttamente nell'intestino dell'insetto viene utilizzata quando il momento esatto dell'infezione è critico. Ad esempio, quando si monitora il modo in cui il virus si diffonde all'interno dell'insetto per iniziare questo test, sospendere i poliedri in una soluzione neutra di glicerina e acqua da 10 a 300.

I poliedri potrebbero essere utilizzati per il quarto stadio, ad esempio. Quindi caricare questa soluzione in una siringa di tubercolina CC di plastica o vetro con un ago a punta smussata calibro 32. Posizionare la siringa sul tubo di supporto del micro applicatore guardando verso il basso al microscopio.

Tenere il quarto o il quinto nella larva stellata, inserire l'ago attraverso la bocca e nella regione anteriore dell'intestino medio, quindi rilasciare i poliedri. Questa tecnica richiede un po' di pratica. Innanzitutto, può essere difficile trattenere le larve con i guanti senza schiacciarle.

In secondo luogo, ci vuole un po' di pratica per far passare l'ago oltre le parti della bocca. Si consiglia di esercitarsi a vaccinare circa 30 larve con PBS. Se ti capita di perforare l'intestino, sarà ovvio perché le larve sono diventate nere abbastanza rapidamente.

Ancora una volta, poiché l'inoculazione orale assistita da micro applicatore fornisce il momento esatto dell'infezione, questo metodo è molto utile per gli esperimenti in cui il tempo di infezione è importante per determinare come il virus si diffonde all'interno dell'insetto. Ad esempio, i virus che esprimono beta galattosio dasi possono essere inoculati per via orale nelle larve, che vengono poi sezionate in vari punti temporali per determinare quali tessuti vengono infettati quando ti mostreremo solo due vasi assistiti da micro applicatore per l'infezione. L'amore degli insetti con vir, il primo dei quali è stata l'inoculazione diretta tramite il virus pro Legg di butted, e questo ti permette di bypassare la fisiologia intestinale e valutare la letalità e il tempo letale del virus che ti interessa.

La seconda tecnica era l'inoculazione diretta nell'intestino medio utilizzando poliedri. Ciò consente di erogare una dose molto precisa direttamente nell'intestino medio, oltre a controllare un tempismo molto preciso dell'evento. Quindi puoi studiare anche la mortalità e altri fenotipi del virus.

Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare che le larve uccise dal virus baula dei cadaveri sono in genere fragili e possono facilmente rompersi rilasciando il virus. Quindi sterilizzare le superfici di lavoro e smaltire i guanti contaminati e i materiali monouso in modo appropriato per prevenire la contaminazione. Quindi questo è tutto.

Grazie per la tua visione. Buona fortuna con il tuo esperimento.