Sigma non specifiche attività di analisi della proteasi - caseina come substrato

Le proteasi scindono i legami peptidici in laboratorio. È spesso necessario misurare e/o confrontare l'attività delle proteasi Sigma. Il saggio universale di attività delle proteasi può essere utilizzato come procedura standardizzata per determinare l'attività delle proteasi, come facciamo durante le nostre procedure di controllo qualità.

In questo saggio, la casiana agisce come substrato quando la proteasi che stiamo testando digerisce la casiana. L'amminoacido tirosina viene liberato insieme ad altri amminoacidi e frammenti peptidici. La tirosina libera reagisce quindi con il reagente fenolo-folino o reagente di Folin-Ciocalteu per produrre un cromoforo di colore blu, quantificabile e misurato come valore di assorbanza sullo spettrofotometro.

Più tirosina viene rilasciata dalla casiana, più vengono generati i cromofori e maggiore è l'attività della proteasi. I valori di assorbanza generati dall'attività della proteasi vengono confrontati con una curva standard ottenuta facendo reagire quantità note di tirosina con il reagente FC, al fine di correlare le variazioni di assorbanza. A partire dalla quantità di tirosina in micromoli ricavata dalla curva standard, l'attività dei campioni di proteasi può essere determinata in unità, definite come la quantità in micromoli di tirosina equivalente rilasciata dalla caina al minuto. Salve, mi chiamo Carrie Cup Vineyard e sono una scienziata presso la nostra struttura Sigma Aldridge DeKalb qui a St. Louis, Missouri.

Oggi, vi mostrerò un metodo universalmente applicabile per testare l'attività della proteasi presso Sigma Aldridge. Utilizziamo principalmente questo saggio nel nostro settore di controllo qualità per assicurarci che la nostra proteasi abbia un'attività sufficiente prima di spedirla direttamente al vostro laboratorio. Prima di iniziare il saggio, dobbiamo verificare che i seguenti reagenti siano stati preparati correttamente.

Un tampone di fosfato di potassio 50 millimolare, pH 7,5. La soluzione viene posta a 37 gradi Celsius prima dell'uso. Una soluzione di kasian allo 0,65% peso su volume viene preparata mescolando 6,5 milligrammi per millilitro in un litro. La temperatura della soluzione viene aumentata gradualmente, con leggera agitazione, a 80-85 gradi Celsius per circa 10 minuti, fino al raggiungimento di una dispersione omogenea.

È molto importante non far bollire la soluzione. Successivamente, se necessario, il pH viene regolato con idrossido di sodio e acido cloridrico. Una soluzione di acido tricloroacetico 110 millimolare, preparata diluendo un reagente concentrato 6,1 normali in rapporto di uno a 55 con acqua purificata 0,5 millimolare, contiene sali di ferro o reagente fenolico di Folin, ovvero la soluzione che reagirà con la tirosina per generare un cambiamento di colore misurabile.

Questo sarà direttamente correlato all'attività delle proteasi. Una soluzione di carbonato di sodio 500 millimolare preparata utilizzando 53 milligrammi per millilitro di carbonato di sodio anidro in acqua purificata, e una soluzione diluente per enzimi, costituita da un tampone di acetato di sodio 10 millimolare con 5 millimolare di calcio a pH 7,5 a 37 gradi Celsius. Questa soluzione è quella che utilizziamo per sciogliere campioni solidi di proteasi o per diluire soluzioni enzimatiche.

La soluzione madre standard di L-tirosina, che deve avere una concentrazione iniziale di 1,1 millimolare, ovvero una soluzione di 0,2 milligrammi per millilitro di L-tirosina, viene preparata in acqua purificata e riscaldata delicatamente fino a completa dissoluzione della tirosina. Come per la casian, non far bollire questa soluzione. Lasciare raffreddare lo standard di L-tirosina a temperatura ambiente.

Questa soluzione verrà ulteriormente diluita per ottenere la curva standard, se necessario, utilizzando un campione solido di proteasi con attività predeterminata, che viene disciolto nel diluente enzimatico a una concentrazione di 0,1-0,2 unità per millilitro. Questa soluzione funge da controllo positivo per il saggio di controllo qualità e da validazione per i calcoli che eseguiremo al fine di determinare l'attività enzimatica. Ora che abbiamo preparato i nostri reagenti e tutti sono alla temperatura corretta, inizieremo il nostro saggio della proteasi.

Per iniziare questo saggio, procurarsi delle provette adatte che contengano circa 15 millilitri. Per ciascun enzima che si intende testare, saranno necessarie quattro provette. Una provetta verrà utilizzata come bianco, e altre tre verranno impiegate per saggare l'attività di tre campioni.

La diluizione della proteasi in tre diluizioni è utile quando si verificano i calcoli finali confrontandoli tra loro, assegnando a ciascun set di quattro vialli cinque millilitri della nostra soluzione allo 0,65% di kasian e lasciandoli equilibrare in un bagno termico a 37 gradi Celsius per circa cinque minuti. Successivamente, aggiungere concentrazioni variabili della nostra soluzione enzimatica a tre dei vialli del campione in prova, ma non al bianco. Mescolare per agitazione rotatoria e incubare a 37 gradi Celsius per esattamente 10 minuti.

L'attività della proteasi e il conseguente rilascio di tirosina durante questo periodo di incubazione saranno ciò che verrà misurato e confrontato tra i nostri campioni in esame. Dopo un'incubazione di 10 minuti, aggiungere cinque millilitri del reagente TCA in ogni provetta. Successivamente, un volume appropriato di soluzione enzimatica viene aggiunto a ciascuna provetta, incluso il bianco, in modo che il volume finale di soluzione enzimatica in ogni provetta sia di un millilitro.

Questo viene fatto per tenere conto del valore di assorbanza dell'enzima stesso. Incubare ora le soluzioni a 30 gradi Celsius per 30 minuti. Durante questa incubazione di 30 minuti, si consiglia di preparare le diluizioni del campione standard di tirosina, che vengono effettuate utilizzando sei vial DR.

Questo può contenere facilmente otto millilitri distribuiti nei sei vial. Alla soluzione standard di tirosina 1,1 millimolare vengono aggiunti i seguenti volumi in millilitri: 0,05, 0,1, 0,2, 0,4 e 0,5. Non aggiungere alcuno standard di tirosina al bianco.

Potrebbero essere necessari standard più bassi per i campioni di prova dell'IPU che produrranno una lieve variazione di colore. Una volta aggiunta la soluzione standard di tirosina, aggiungere un volume appropriato di acqua purificata a ciascuno degli standard per portare il volume a due millilitri. Dopo l'incubazione, filtrare ciascuna delle soluzioni di prova e il bianco.

Utilizzando un filtro per siringa da 0,45 micron, due millilitri dei campioni di prova e del filtrato bianco vengono aggiunti a quattro provette DR che possono contenere almeno otto millilitri. È possibile utilizzare lo stesso tipo di provetta in cui sono stati preparati gli standard; in tutte le provette contenenti gli standard e il bianco dello standard, si aggiungono cinque millilitri di carbonato di sodio e, per ottenere i migliori risultati, il reagente caduto viene aggiunto immediatamente dopo; quindi si aggiunge il carbonato di sodio ai campioni di prova e al bianco di prova. Si noterà che queste soluzioni diventano torbide dopo l'aggiunta del carbonato di sodio.

Quindi si aggiunge il reagente caduto, che reagirà con la tirosina libera. I vial DRAM vengono quindi mescolati con movimenti rotatori e incubati a 37 gradi Celsius per 30 minuti; dopo questa incubazione, si dovrebbe osservare una gradazione di colore negli standard, correlata alla quantità di tirosina aggiunta, con le concentrazioni più elevate di tirosina che appaiono di colore più scuro.

È inoltre possibile osservare un evidente cambiamento di colore nei nostri campioni di prova. Due millilitri di queste soluzioni vengono filtrati utilizzando un filtro a siringa da 0,45 micron e delle cuvette adatte. Ora che abbiamo terminato il nostro saggio, procediamo con lo spettrofotometro e registriamo i valori di assorbanza.

L'assorbanza dei nostri campioni viene misurata mediante spettrofotometro utilizzando una lunghezza d'onda di 660 nanometri. Il cammino ottico è impostato a un centimetro; registrare i valori di assorbanza per lo standard bianco, i diversi campioni in prova e il bianco di prova. Una volta raccolti tutti i dati, siamo pronti a creare la nostra curva di calibrazione.

Per generare la curva, è necessario calcolare la differenza di assorbanza tra lo standard e lo standard bianco. Questo valore di assorbanza corrisponde alla quantità di tirosina presente nelle soluzioni standard. Dopo un semplice calcolo, creiamo la curva standard riportando la variazione di assorbanza dei nostri standard sull'asse Y rispetto alla quantità in micromoli per ciascuno dei nostri cinque standard sull'asse X.

Dopo aver inserito i nostri punti dati e generato una retta di regressione, determiniamo la variazione di assorbanza nei nostri campioni in esame calcolando la differenza tra l'assorbanza del campione in esame e quella del bianco di prova. Analizzando la nostra curva standard, identifichiamo sul lato Y il valore di assorbanza di uno dei nostri campioni in esame. Procedendo ora parallelamente all'asse X, tracciamo una linea fermandoci nel punto in cui intersechiamo la curva standard.

Quindi, a partire dalla coordinata X rilevata in questo punto, otteniamo la quantità in micro moli di tirosina liberata durante questa particolare reazione proteolitica. Per calcolare l'attività dell'enzima in unità per millilitro, effettuare il seguente calcolo: prendere il numero di micro moli di equivalenti di tirosina rilasciati, ottenuto dalla curva standard, e moltiplicarlo per il volume totale del saggio in millilitri, che nel nostro caso è di 11 millilitri. Successivamente, dividere questo valore per altre tre quantità.

Il tempo del saggio, che abbiamo eseguito per 10 minuti, il volume di enzima utilizzato nel saggio, che è stato variato. Utilizziamo un millilitro. Il volume di millilitri impiegato nel rilevamento clorimetrico, che può variare in base al vostro Q vet.

Utilizziamo due millilitri. I micromoli di tirosina divisi per il tempo in minuti ci forniscono la nostra misura dell'attività della proteasi, che chiamiamo unità. Possiamo eliminare le unità di misura del volume al numeratore e al denominatore, ottenendo così una misura dell'attività enzimatica espressa in unità per millilitro.

Per determinare l'attività in un campione solido di proteasi diluito nel diluente enzimatico, dividiamo la nostra attività espressa in unità per millilitro per la concentrazione del solido utilizzato inizialmente nel saggio, espressa in milligrammi per millilitro, ottenendo così l'attività in unità per milligrammo. Abbiamo appena illustrato come analizzare l'attività della proteasi utilizzando il saggio universale dell'attività della proteasi di Sigma. Come avete potuto osservare eseguendo questa procedura, è fondamentale ricordare di riscaldare lentamente sia la soluzione di caseina che quella di tirosina, senza portarle a ebollizione.

Inoltre, è fondamentale preparare diversi bianchi sia per gli standard sia per ciascun campione in esame. È tutto. Grazie per averci seguito e buona fortuna con le vostre attività proteasiche.