Sigma non specifiche attività di analisi della proteasi - caseina come substrato

Le proteasi rompono i legami peptidici in laboratorio. Spesso è necessario misurare e/o confrontare l'attività delle proteasi Sigma. Il saggio universale dell'attività della proteasi può essere utilizzato come procedura standardizzata per determinare l'attività delle proteasi, che è ciò che facciamo durante le nostre procedure di controllo della qualità.

In questo test, il casiano funge da substrato quando la proteasi che stiamo testando digerisce il casiano. L'aminoacido tirosina viene liberato insieme ad altri amminoacidi e frammenti peptidici. La tirosina libera reagisce quindi con il fenolo caduto e con il fenolo o con il reagente caduto per produrre un cromoforo di colore blu, che è quantificabile e misurato come valore di assorbanza sullo spettrofotometro.

Più tirosina viene rilasciata dal casiano, più cromofori vengono generati e più forte è l'attività della proteasi I valori di assorbanza generati dall'attività della proteasi vengono confrontati con una curva standard che viene generata facendo reagire quantità note di tirosina con il reagente FC per correlare i cambiamenti nell'assorbanza. Con la quantità di tirosina in micromoli dalla curva standard, l'attività dei campioni di proteasi può essere determinata in termini di unità, che è la quantità di micromoli di tirosina equivalente rilasciata da Caino al minuto. Ciao, mi chiamo Carrie Cup Vineyard e sono una scienziata presso la nostra struttura Sigma Aldridge DeKalb qui a St.Louis, Missouri.

Oggi vi mostrerò un modo universalmente applicabile per testare l'attività della proteasi presso Sigma Aldridge. Utilizziamo questo test principalmente nella nostra area di controllo qualità per garantire che la nostra proteasi abbia un'attività sufficiente prima di spedirla direttamente a voi presso il vostro laboratorio. Prima di iniziare il test, dobbiamo assicurarci che i seguenti reagenti siano preparati correttamente.

Un tampone fosfato di potassio da 50 millimolari, pH 7,5. La soluzione viene posta a 37 gradi Celsius prima di utilizzare una soluzione kasian allo 0,65% in peso in volume, preparata mescolando 6,5 milligrammi in millilitri in un litro. La temperatura della soluzione viene gradualmente aumentata con una leggera agitazione a 80-85 gradi Celsius per circa 10 minuti fino a raggiungere una dispersione omogenea.

È molto importante non far bollire la soluzione. Se necessario, il pH viene quindi regolato con idrossido di sodio e acido cloridrico. Una soluzione di acido tricloroacetico da 110 millimolari preparata diluendo un brodo normale 6,1, rapporto da uno a 55 con acqua purificata 0,5 millimolari, calti caduti e sigillati o reagente fenolico caduto, che è la soluzione che reagirà con la tirosina per generare un cambiamento di colore misurabile.

Ciò sarà direttamente correlato all'attività delle proteasi. Una soluzione di carbonato di sodio da 500 millimolari preparata utilizzando da 53 milligrammi a millilitro di carbonato di sodio anidro in acqua purificata, una soluzione diluente enzimatica, che consiste in 10 millimolari di tampone di acetato di sodio con cinque millimolari di calcio a pH 7,5 a 37 gradi Celsius. Questa soluzione è quella che usiamo per sciogliere campioni solidi di proteasi o diluire soluzioni enzimatiche.

La soluzione madre standard di L-tirosina, che deve essere a una concentrazione iniziale di 1,1 millimolari, una soluzione da 0,2 milligrammi a millilitro di L-tirosina, viene preparata in acqua purificata e riscaldata delicatamente fino a quando la tirosina non si dissolve. Come con il casian, non far bollire questa soluzione. Lasciare raffreddare la L-tirosina standard a temperatura ambiente.

Questa soluzione sarà ulteriormente diluita per rendere la nostra curva standard, se necessario, un campione di proteasi solida di attività predeterminata, che viene sciolto utilizzando un diluente enzimatico da 0,1 a 0,2 unità per millilitro. Questa soluzione funge da controllo positivo per il test di controllo della qualità e da convalida per i calcoli che eseguiremo per determinare l'attività enzimatica. Ora che abbiamo preparato i nostri reagenti e sono tutti alla temperatura corretta, inizieremo il nostro test della proteasi.

Per iniziare questo test, trovare fiale adatte che contengano circa 15 millilitri. Per ogni enzima che testerai, avrai bisogno di quattro fiale. Una fiala verrà utilizzata come bianco e altre tre verranno utilizzate per testare l'attività di tre.

Diluizione della proteasi Tre diluizioni sono utili quando si controllano i nostri calcoli finali l'uno contro l'altro per ogni serie di quattro fiale a cinque millilitri della nostra soluzione kasiana allo 0,65% e lasciarle equilibrare in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per circa cinque minuti. Quindi aggiungere concentrazioni variabili della nostra soluzione enzimatica a tre delle fiale del campione di prova, ma non al bianco. Mescolateli agitandoli e incubateli a 37 gradi Celsius per esattamente 10 minuti.

L'attività della proteasi e la conseguente liberazione di tirosina durante questo periodo di incubazione è ciò che verrà misurato e confrontato tra i nostri campioni di prova. Dopo questa incubazione di 10 minuti, aggiungere i cinque millilitri del reagente TCA in ciascuna provetta. Quindi un volume appropriato di soluzione enzimatica viene aggiunto a ciascuna provetta, anche al bianco, in modo che il volume finale della soluzione enzimatica in ciascuna provetta sia di un millilitro.

Questo viene fatto per tenere conto del valore di assorbanza dell'enzima stesso. Ora incubare le soluzioni a 30 gradi Celsius per 30 minuti. Durante questa incubazione di 30 minuti, potresti voler impostare le tue diluizioni standard di tirosina, che viene eseguita utilizzando sei fiale DR.

Questo può facilmente contenere otto millilitri per le sei fiale. Le soluzioni standard di gambo di tirosina da 1,1 millimolari vengono aggiunte con i seguenti volumi in millilitri: 0,05, 0,1, 0,2, 0,4 e 0,5. Non aggiungere alcuno standard di tirosina al grezzo.

Potrebbero essere necessari standard più bassi per i campioni di test IPU che produrranno un piccolo cambiamento di colore. Una volta aggiunta la soluzione standard di tirosina, aggiungere un volume appropriato di acqua purificata a ciascuno degli standard per portare il volume a due millilitri. Dopo l'incubazione, filtrare ciascuna delle soluzioni di prova e il bianco.

Utilizzando un filtro per siringa da 0,45 micron, due millilitri dei campioni di prova e il filtrato bianco vengono quindi aggiunti a quattro fiale DR che possono contenere almeno otto millilitri. È possibile utilizzare lo stesso tipo di fiala in cui sono stati preparati gli standard per tutte le fiale contenenti gli standard e viene aggiunto un bianco standard di cinque millilitri di carbonato di sodio e, per ottenere i migliori risultati, il reagente caduto viene aggiunto immediatamente dopo, il carbonato di sodio viene quindi aggiunto ai nostri campioni di prova e al bianco di prova. Noterai che queste soluzioni diventano torbide dopo l'aggiunta di carbonato di sodio.

Quindi viene aggiunto il reagente caduto, che reagirà con la tirosina libera. Le fiale DRAM vengono quindi miscelate mediante agitazione e incubate a 37 gradi Celsius per 30 minuti dopo questa incubazione. Dovresti notare che gli standard hanno una gradazione di colore correlata alla quantità di tirosina aggiunta, le concentrazioni più alte di tirosina appaiono più scure.

Puoi anche notare un apprezzabile cambiamento di colore nei nostri campioni di prova. Due millilitri di queste soluzioni vengono filtrati utilizzando un filtro per siringa da 0,45 micron e una cuvetta adatta. Ora che abbiamo terminato il nostro test, procediamo allo spettrofotometro e registriamo i nostri valori di assorbanza.

L'assorbanza dei nostri campioni viene misurata da uno spettrofotometro che utilizza una lunghezza d'onda di 660 nanometri. Il percorso della luce è impostato su un centimetro, i valori di assorbanza per il bianco standard standard, i diversi campioni di prova e un bianco di prova. Una volta raccolti tutti i dati, siamo pronti per creare la nostra curva standard.

Per generare la curva, è necessario calcolare la differenza di assorbanza tra il grezzo standard e quello standard. Questo è il valore di assorbanza attribuibile alla quantità di tirosina nelle soluzioni standard. Dopo il semplice calcolo, creiamo la nostra curva standard tracciando la variazione dell'assorbanza dei nostri standard sull'asse Y rispetto alla quantità in micromoli per ciascuno dei nostri cinque standard sull'asse x.

Una volta inseriti i nostri punti dati, generiamo una linea di best fit, quindi troviamo la variazione dell'assorbanza nei nostri campioni di prova calcolando la differenza tra l'assorbanza del nostro campione di prova e l'assorbanza del nostro bianco di prova. Osservando la nostra curva standard, identifichiamo il valore di assorbanza per uno dei nostri campioni di prova sull'asse Y. Ora viaggiando parallelamente all'asse X, disegniamo una linea e ci fermiamo nel punto in cui colpiamo la nostra curva standard.

Quindi dalla coordinata X presa a questo punto, abbiamo la quantità e le micro moli di tirosina liberate durante questa particolare reazione proteolitica. Per ottenere l'attività dell'enzima in unità per millilitro, eseguire il seguente calcolo, prendere il numero di micro moli di tirosina equivalenti rilasciate, ottenuto dalla curva standard e moltiplicarlo per il volume totale del saggio in millilitri, che nel nostro caso è di 11 millilitri. Quindi dividi questo valore per altre tre quantità.

Il tempo del test, che abbiamo eseguito per 10 minuti, il volume dell'enzima utilizzato nel test, che è stato variato. Usiamo un millilitro. Il volume di millilitri utilizzati nel rilevamento metrico del cloro, che può variare in base al veterinario Q.

Usiamo due millilitri. Le micromoli di tirosina divise per il tempo in minuti ci danno la nostra misura dell'attività della proteasi che chiamiamo unità. Possiamo annullare le unità di misura del volume nel numeratore e nel denominatore e quindi rimaniamo con una misura dell'attività enzimatica in termini di unità per millilitro.

Al fine di determinare l'attività in un campione di proteasi solida diluito in diluente enzimatico, dividiamo la nostra attività in unità per millilitro per la concentrazione di solido utilizzata in questo test originariamente in milligrammi per millilitro, lasciandoci con l'attività. In termini di unità per milligrammo, ti abbiamo appena mostrato come analizzare l'attività della proteasi utilizzando il saggio universale dell'attività della proteasi di Sigma. Come hai visto durante l'esecuzione di questa procedura, è fondamentale ricordarsi di riscaldare lentamente sia la soluzione casiana che quella di tirosina e di non farle bollire.

Inoltre, è fondamentale preparare spazi vuoti diversi sia per i tuoi standard che per ogni campione di prova che hai. Quindi questo è tutto. Grazie per l'osservazione e buona fortuna con le tue attività di proteasi.