In Assemblea in vitro Nucleari Utilizzando frazionato Estratti Egg Xenopus

Gli estratti di uova di Xip Labus sono utili come materiale citoplasmatico e organellare per la ricostruzione in vitro di eventi cellulari come l'assemblaggio del nucleo e l'importazione di proteine nucleari. Quando il DNA della cromatina spermatica viene aggiunto a estratti di uova XUS grezzi o frazionati, le vescicole di membrana presenti nell'estratto si legano alla superficie della cromatina, si fondono e incorporano componenti dei pori nucleari per formare nuclei sintetici completamente funzionali. La caratterizzazione della base molecolare di questi processi è quindi possibile mediante immunodeplezione degli estratti e mediante modifica proteica.

Ciao, mi chiamo Marie Cross e sono una studentessa laureata nel laboratorio della dottoressa Maureen Power presso il Dipartimento di Biologia Cellulare dell'Università di Emory ad Atlanta, in Georgia. Oggi vi mostreremo come formare nuclei in vitro utilizzando estratti di uova di xenopus frazionati. Questa procedura comprende i seguenti passaggi: eseguire la reazione di assemblaggio nucleare e valutare la formazione dei nuclei.

Iniziamo. Per avviare l'assemblaggio nucleare, prelevare un'aliquote di citosol frazionato e aggiungere fosfocreatina da una soluzione madre 0,2 molare fino a una concentrazione finale di 20 millimolari. Quindi aggiungere creatina chinasi da una soluzione madre di 5 milligrammi per millilitro fino a una concentrazione finale di 50 microgrammi per millilitro.

Infine, aggiungere 20 micromolari di ATP utilizzando una soluzione madre di 0,2 molare. Successivamente, aggiungere le membrane leggere al citosol in un rapporto di diluizione di uno a 10. Questo valore approssima la quantità di membrane presente nell'estratto grezzo originale.

Mescolare tutti i componenti mediante pipettaggio su e giù per disperdere le membrane nell'estratto. Questa operazione deve essere eseguita prima di aggiungere la cromatina spermatica. Successivamente, aggiungere la cromatina spermatica all'estratto frazionato alla concentrazione desiderata e mescolare immediatamente l'estratto e la cromatina mediante pipettaggio delicato su e giù, utilizzando una punta tagliata.

Quando il cromatina spermatico viene aggiunto all'estratto, inizia immediatamente a decondensarsi, condensarsi e diventare suscettibile alla rottura per taglio. Generalmente, queste reazioni vengono allestite in provette da centrifuga da 500 microlitri con un volume totale inferiore a cento microlitri. Gli estratti di uovo permettono la formazione di fino a 8.000-9.000.

Incubare la miscela da uno a due ore a temperatura ambiente per consentire la formazione dei nuclei per microlitro. I nuclei vengono visualizzati mediante colorazione. Dopo circa 30 minuti, i nuclei appena formati saranno di piccole dimensioni e di forma ovale.

Il DNA è ancora piuttosto condensato e il nucleo dovrebbe apparire di un blu chiaro compatto quando osservato nel canale UV durante la condensazione del DNA. Inoltre, la colorazione blu risulterà meno omogenea, con l’insorgere di aree nere a intervalli. La formazione della membrana nucleare può essere visualizzata aggiungendo un microgrammo per maschio di tre tre diaa carbossiammina o DHCC nel fissativo.

DHCC è un colorante lipofilico fluorescente che viene visualizzato nel canale della fluoresceina. Nelle fasi iniziali di assemblaggio dei nuclei, le vescicole della membrana si legano alla superficie della cromatina e iniziano a fondersi in chiazze. Ciò determina un aspetto irregolare e discontinuo della membrana in formazione.

Una volta completata, la membrana si dispiega uniformemente sulla superficie nucleare e apparirà come un bordo continuo e regolare attorno al DNA. Sarà presente una certa quantità di fluorescenza di fondo nel citosol circostante a causa delle vescicole della membrana, che non si sono incorporate nei nuclei. Vi abbiamo appena mostrato la ricostituzione nucleare in vitro utilizzando frazioni solubili e leggere di membrane provenienti da estratto di uovo di xenopus.

È importante ricordare che l'estratto grezzo può essere utilizzato per l'assemblaggio nucleare, ma non dopo congelamento e scongelamento. Questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.