Name: In Assemblea in vitro Nucleari Utilizzando frazionato Estratti Egg Xenopus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-09-02T13:52:00.000+00:00
Duration: 4 min 49 s
Description: Scopri come assemblare nuclei in vitro utilizzando estratti di uova di Xenopus e cromatina di sperma. Questo metodo permette di studiare la biologia cellulare e i meccanismi di formazione della membrana nucleare.

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Il protocollo testo completo di questo approccio sperimentale è disponibile in <a href="http://www.mrw.interscience.wiley.com/emrw/9780471143031/cp/cpcb/article/cb1110/current/abstract ">protocolli di corrente in Biologia Cellulare</a> .

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

in assemblea in vitro nucleari utilizzando frazionato estratti egg xenopus

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Assemblaggio membrana nucleare è un passo essenziale nel ciclo di divisione cellulare, questo processo può essere replicato in provetta, combinando cromatina spermatica Xenopus, citosol, e le frazioni di membrana di luce. Nuclei completi sono formati, tra cui le membrane nucleari con i complessi pori, e questi nuclei ricostituiti sono in grado di normali processi nucleari.

In Assemblea in vitro Nucleari Utilizzando frazionato Estratti Egg Xenopus

L'assemblaggio della membrana nucleare è una fase essenziale del ciclo di divisione cellulare; questo processo può essere replicato in provetta combinando sperma di Xenopus...

Gli estratti di uova di Xip Labus sono utili come materiale citoplasmatico e organellare per la ricostruzione in vitro di eventi cellulari come l'assemblaggio del nucleo e l'importazione di proteine nucleari. Quando il DNA della cromatina spermatica viene aggiunto a estratti di uova XUS grezzi o frazionati, le vescicole di membrana presenti nell'estratto si legano alla superficie della cromatina, si fondono e incorporano componenti dei pori nucleari per formare nuclei sintetici completamente funzionali. La caratterizzazione della base molecolare di questi processi è quindi possibile mediante immunodeplezione degli estratti e mediante modifica proteica.Ciao, mi chiamo Marie Cross e sono una studentessa laureata nel laboratorio della dottoressa Maureen Power presso il Dipartimento di Biologia Cellulare dell'Università di Emory ad Atlanta, in Georgia. Oggi vi mostreremo come formare nuclei in vitro utilizzando estratti di uova di xenopus frazionati. Questa procedura comprende i seguenti passaggi: eseguire la reazione di assemblaggio nucleare e valutare la formazione dei nuclei.Iniziamo. Per avviare l'assemblaggio nucleare, prelevare un'aliquote di citosol frazionato e aggiungere fosfocreatina da una soluzione madre 0,2 molare fino a una concentrazione finale di 20 millimolari. Quindi aggiungere creatina chinasi da una soluzione madre di 5 milligrammi per millilitro fino a una concentrazione finale di 50 microgrammi per millilitro.Infine, aggiungere 20 micromolari di ATP utilizzando una soluzione madre di 0,2 molare. Successivamente, aggiungere le membrane leggere al citosol in un rapporto di diluizione di uno a 10. Questo valore approssima la quantità di membrane presente nell'estratto grezzo originale.Mescolare tutti i componenti mediante pipettaggio su e giù per disperdere le membrane nell'estratto. Questa operazione deve essere eseguita prima di aggiungere la cromatina spermatica. Successivamente, aggiungere la cromatina spermatica all'estratto frazionato alla concentrazione desiderata e mescolare immediatamente l'estratto e la cromatina mediante pipettaggio delicato su e giù, utilizzando una punta tagliata.Quando il cromatina spermatico viene aggiunto all'estratto, inizia immediatamente a decondensarsi, condensarsi e diventare suscettibile alla rottura per taglio. Generalmente, queste reazioni vengono allestite in provette da centrifuga da 500 microlitri con un volume totale inferiore a cento microlitri. Gli estratti di uovo permettono la formazione di fino a 8.000-9.000.Incubare la miscela da uno a due ore a temperatura ambiente per consentire la formazione dei nuclei per microlitro. I nuclei vengono visualizzati mediante colorazione. Dopo circa 30 minuti, i nuclei appena formati saranno di piccole dimensioni e di forma ovale.Il DNA è ancora piuttosto condensato e il nucleo dovrebbe apparire di un blu chiaro compatto quando osservato nel canale UV durante la condensazione del DNA. Inoltre, la colorazione blu risulterà meno omogenea, con l’insorgere di aree nere a intervalli. La formazione della membrana nucleare può essere visualizzata aggiungendo un microgrammo per maschio di tre tre diaa carbossiammina o DHCC nel fissativo.DHCC è un colorante lipofilico fluorescente che viene visualizzato nel canale della fluoresceina. Nelle fasi iniziali di assemblaggio dei nuclei, le vescicole della membrana si legano alla superficie della cromatina e iniziano a fondersi in chiazze. Ciò determina un aspetto irregolare e discontinuo della membrana in formazione.Una volta completata, la membrana si dispiega uniformemente sulla superficie nucleare e apparirà come un bordo continuo e regolare attorno al DNA. Sarà presente una certa quantità di fluorescenza di fondo nel citosol circostante a causa delle vescicole della membrana, che non si sono incorporate nei nuclei. Vi abbiamo appena mostrato la ricostituzione nucleare in vitro utilizzando frazioni solubili e leggere di membrane provenienti da estratto di uovo di xenopus.È importante ricordare che l'estratto grezzo può essere utilizzato per l'assemblaggio nucleare, ma non dopo congelamento e scongelamento. Questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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Greggio e frazionato estratti di uova di Xenopus può essere utilizzato per fornire ingredienti per la ricostituzione di processi cellulari per l'analisi morfologiche e biochimiche. Lisi uovo e centrifugazione differenziale vengono utilizzati per preparare l'estratto grezzo che a sua volta in utilizzato per preparare estratti frazionato e preparati membrana luce.

Preparazione e frazionamento di Xenopus laevis Egg Estratti

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Un metodo è descritto per l'analisi degradazione delle proteine ​​usando radioattivo e proteine ​​luciferasi-fusione in estratto uovo Xenopus e il suo adattamento per lo screening high-throughput per piccoli modulatori molecola di degradazione delle proteine.

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Descriviamo i metodi di manipolazione degli ovociti immaturi di Xenopus laevis, la maturazione in vitro degli ovociti in ovuli e l'iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi. Questo protocollo consente la degradazione di alcune proteine materne e la sovraespressione di geni di interesse alla fecondazione, e quindi è prezioso per studiare il ruolo di fattori specifici nello sviluppo embrionale precoce.

Manipolazione e<em&gt; In Vitro</em&gt; Maturazione di<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; ovociti, seguito da Iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi, per studiare lo sviluppo embrionale

I meccanismi molecolari della decondensazione della cromatina mitotica altamente compattata sono mal definiti. Presentiamo un test cell-free basato su cluster di cromatina mitotica isolati da cellule HeLa ed estratto di uova di Xenopus laevis che ricostituisce fedelmente il processo di decondensazione in vitro.

Un Free Cell Assay per studiare cromatina decondensazione alla fine del mitosi

Descriviamo un sistema di ovociti e cappucci animali di Xenopus per il clonaggio dell'espressione di geni in grado di indurre una risposta in un ectoderma competente, e discutiamo le tecniche per la successiva analisi di tali geni. Questo sistema è utile nell'identificazione funzionale di un'ampia gamma di prodotti genici.

Clonazione funzionale utilizzando un<em&gt; Xenopus</em&gt; Ovociti Expression System

I meccanismi di ridimensionamento cellulare e intracellulare rimangono sfuggenti. L'uso di estratti di embrioni di Xenopus è diventato sempre più comune per chiarire i meccanismi di regolazione delle dimensioni degli organelli. Questo metodo descrive la preparazione dell'estratto embrionale e un nuovo saggio di scala nucleare attraverso il quale è possibile identificare i meccanismi di regolazione delle dimensioni nucleari.

Un test cellulare gratuitamente utilizzando<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; Embryo Estrae per studiare i meccanismi del regolamento Size nucleare

Presentiamo un metodo per la generazione di in vitro autosostenuto mitotica oscillazioni a livello di singola cellula incapsulando gli estratti di uovo di Xenopus laevis in microemulsioni di acqua in olio.

La ricostituzione delle oscillazioni del ciclo cellulare in microemulsioni di uovo senza cellula Xenopus estrae

Descriviamo un metodo per la preparazione e l'imaging dal vivo di estratti citoplasmatici non diluiti da uova di Xenopus laevis .

Xenopus laevis Preparazione dell'estratto di uova e metodi di imaging dal vivo per la visualizzazione dell'organizzazione citoplasmatica dinamica

Scopri come assemblare nuclei in vitro utilizzando estratti di uova di Xenopus e cromatina di sperma. Questo metodo permette di studiare la biologia cellulare e i meccanismi di formazione della membrana nucleare.

In Assemblea in vitro Nucleari Utilizzando frazionato Estratti Egg Xenopus

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