Utilizzando pinzette laser per manipolare i neuroni isolato in vitro
11 settembre 2008
Questo video descrive la manipolazione di colture di neuroni utilizzando pinzette laser in vitro.
Ashkin fu il primo a dimostrare che le pinzette laser o i trappole ottiche sono uno strumento potente per manipolare oggetti microscopici viventi micronizzati. In questo video, mostreremo come abbiamo applicato questa tecnologia per catturare e spostare neuroni. Questa è la stazione di lavoro per pinzette ottiche.
Le frecce verdi mostrano il percorso seguito dal raggio laser attraverso l'ottica del microscopio. Quando un raggio laser focalizzato dall'obiettivo del microscopio viene rifratto da una cellula, la forza che ne cambia la direzione agisce sulla cellula spingendola verso il centro del fuoco.
Questo genera newton di forza sufficienti a trascinare una cellula attraverso il mezzo. In questo video, parleremo della fabbricazione delle piastre, della preparazione delle cellule retiniche, del seeding delle cellule su piastre colturali, della manipolazione mediante pinzette laser e dell'osservazione della crescita cellulare. Poiché le cellule aderiscono al vetro, era necessario creare un'area repellente per le cellule in cui potessero essere facilmente intrappolate con le pinzette.
Metà della piastra è stata ricoperta con poli-HEMA, un polimero repellente per le cellule. L'altra metà è stata ricoperta con CellOne, un substrato che favorisce la crescita delle nostre cellule. Innanzitutto, una cellula viene identificata sul lato della piastra adesivo per le cellule.
Un'altra cellula viene quindi intrappolata sul lato del polimero e trasportata sul lato adesivo, dove entrambe le cellule vengono accoppiate. Per preparare le piastre, utilizziamo piastre in polistirene sterili soffiate con aria compressa, da 35 millimetri. Innanzitutto, pratichiamo un foro di un centimetro sul fondo con un piccolo tornio o un trapano a colonna.
Prendere vetrini puliti con acido e posizionarli in posizione verticale in un ambiente privo di polvere, ad esempio in una cappa. Prendere la soluzione di poli-HEMA disciolta in alcol al 95% e applicare alcune gocce vicino all'estremità superiore del vetrino, su una sola metà. Lasciare asciugare il poli-HEMA. Contrassegnare il lato del vetrino trattato con poli-HEMA.
Mettere la guarnizione S attorno al foro nella parte inferiore della piastra colturale. Incollare il vetrino alla piastra utilizzando la guarnizione S. Assicurarsi che il poliammide sia rivolto verso l'interno e verificare che non ci siano perdite attraverso eventuali fessure nella guarnizione di tenuta.
Posizionare il vetrino in modo che il bordo del rivestimento di poli-HEMA si trovi al centro della piastra. Lasciare asciugare la piastra per due o tre giorni, quindi tracciare dei segni sul fondo della piastra con una penna a punta di diamante, che serviranno come punti di riferimento per posizionare la piastra sul portapreparati del microscopio. Collocare le piastre nell'abbattitore e sterilizzarle sotto luce ultravioletta.
Applicare una o due gocce di soluzione di anticorpo caprino anti-US sul lato non poliureico della piastra, avendo cura di non farla fuoriuscire sul rivestimento polimerico e lasciare in posa per circa tre ore. Rimuoverla e lavare con soluzione fisiologica sterile. Applicare la soluzione di anticorpo primario sullo stesso sito e incubare tutta la notte, in preparazione all'esperimento del giorno successivo.
Le cellule utilizzate nel nostro laboratorio provengono da retine di salamandre in fase acquatica adulta. Le retine vengono dissezionate ed estratte, quindi digerite con enzimi. La piastra di coltura può quindi essere seminata con le cellule isolate.
Gli occhi vengono rimossi. La cornea viene dissezionata e rimossa. La coppa oculare viene posta in soluzione fisiologica sterile.
La retina viene separata dalla coppa oculare scavandola con il bordo di una pinza curva. L'anidride carbonica e l'ossigeno vengono insufflati in una soluzione di ringer contenente propano e successivamente sterilizzati attraverso un filtro ultrafine di 0,2 micron. Le retine vengono poste in una soluzione enzimatica e digerite per circa 40 minuti con agitazione per disgregare il tessuto.
Dopo aver lavato tre volte, le retine vengono dissociate mediante tri. Utilizzando una pipetta sferica da tre millimetri, le cellule isolate sono pronte per la semina prima della semina. La piastra da coltura contenente il mezzo viene posizionata sul palchetto del microscopio e orientata correttamente utilizzando i segni di graffio sul fondo della piastra.
Questo consente di riprodurre esattamente la posizione della piastra in un momento successivo. Le cellule vengono quindi seminate sia sul lato con poli-hema sia sul lato con cellule della piastra. La posizione della piastra sul palchetto del microscopio, così come la potenza del laser, è controllata tramite joystick.
Prima di tutto, abbiamo identificato una cellula aderente a un lato della piastra. Si tratta di una cellula retinica multipolare, identificabile dai suoi dendriti. Le coordinate della posizione della cellula vengono salvate.
Questa è una cellula fotoricettore a bastoncello sul lato della piastra rivestito con sostanza repellente per le cellule polari. La piastra viene abbassata e la cellula viene catturata dal laser ed elevata al di sopra del fondo della piastra. La cellula viene ora trasportata all'altro lato della piastra, fino alle coordinate della cellula multipolare.
In realtà, la cellula è stazionaria. È la piastra che si sta muovendo. La cellula sta ora passando oltre il bordo del rivestimento poliemo.
La protuberanza che si estende dalla cellula è il terminale assonale. La cellula è ben distante da detriti e altre cellule sul fondo della piastra, che potrebbero ostacolarne il movimento. Le immagini fuori fuoco delle cellule sul fondo della piastra sono visibili sullo sfondo.
La cellula bastoncello raggiunge la cellula multipolare e può essere posizionata con precisione nel punto desiderato e alla distanza voluta da tale cellula. La piastra viene sollevata e la cellula aderisce al substrato della cellula. I principali vantaggi di questa procedura sono la possibilità di scegliere quali cellule spostare e il fatto che le manipolazioni possano avvenire all'interno di un esperimento sterile chiuso.
Le interazioni tra cellula e cellula possono essere monitorate mediante time-lapse video o fotografia digitale. Le pinzette laser possono essere utilizzate con qualsiasi tecnica biologica. Qui, ad esempio, una tecnica di fluorescenza dimostra la presenza di proteine sinaptiche nei punti di contatto tra cellule spostate dalle pinzette.
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Panoramica
In questo video viene descritta la manipolazione di neuroni coltivati in vitro mediante l'uso delle pinzette laser. Si dimostra che le pinzette laser rappresentano uno strumento potente per catturare e spostare i neuroni.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Manipolazione ottica
- Biologia cellulare
Sfondo
- Le pinzette laser sono state dimostrate per la prima volta da Ashkin come metodo per manipolare oggetti microscopici viventi.
- Questa tecnologia consente un controllo preciso dei movimenti cellulari.
- Comprendere la manipolazione dei neuroni può essere utile in varie applicazioni di ricerca nel campo delle neuroscienze.
- Le trappole ottiche utilizzano fasci laser focalizzati per esercitare forze sulle cellule.
Scopo dello studio
- Dimostrare l'applicazione delle pinzette laser nella manipolazione neuronale.
- Illustrare la meccanica del trappolamento ottico in un contesto biologico.
- Fornire informazioni sui potenziali utilizzi di questa tecnologia nella ricerca in neuroscienze.
Metodi Utilizzati
- Utilizzo di pinzette laser per manipolare neuroni in coltura.
- Osservazione dell'interazione tra luce laser e cellule neuronali.
- Utilizzo di un microscopio per focalizzare il fascio laser.
- Dimostrazione del movimento dei neuroni verso il centro di focalizzazione.
Risultati principali
- Cattura e movimentazione con successo di neuroni mediante pinzette laser.
- Rappresentazione visiva del percorso del fascio laser attraverso l'ottica del microscopio.
- Dimostrazione delle forze agenti sulle cellule a causa della rifrazione laser.
- Illustrazione dell'efficacia delle trappole ottiche nella ricerca biologica.
Conclusioni
- I pinzette laser sono efficaci per manipolare i neuroni in vitro.
- Questa tecnica può migliorare la nostra comprensione del comportamento neuronale.
- Ulteriori applicazioni delle pinzette laser potrebbero far progredire la ricerca in neuroscienze.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
I pinzette laser permettono una manipolazione precisa e senza contatto di singoli neuroni in vitro, supportando studi meccanicistici sulla connettività sinaptica e sulla crescita dei neuriti. Questa capacità migliora la validazione degli obiettivi consentendo un'analisi controllata delle interazioni tra cellule in un ambiente sterile e osservabile. Il metodo fornisce un controllo spaziale quantitativo utile per ridurre i rischi nelle ipotesi della scoperta precoce in neuroscienze.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Prima Fase di Scoperta e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche controllando l'indirizzamento dei neuriti e la selezione dei partner sinaptici.
- Valore operativo: Consente la validazione funzionale di bersagli neuronali mediante l'osservazione diretta dell'estensione dei prolungamenti e dell'adesione.
- Valore predittivo: Riduce l'ambiguità meccanicistica nella chiarificazione dei percorsi isolando i comportamenti dei neuriti dipendenti da variabili.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara coppie neuronali standardizzate per una valutazione coerente di molecole di adesione o segnali di guida.
- Valore operativo: Permette un'allestimento riproducibile e un posizionamento su substrati adesivi/repellenti definiti, garantendo uniformità nei saggi.
- Scalabilità: Facilita la formazione di gruppi cellulari definiti per letture multiparametriche in formati di screening.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Supporta la modellizzazione rilevante per le malattie consentendo la ricostruzione controllata di circuiti neuronali retinici.
- De-risking Meccanicistico: Permette di testare molecole di guida o substrati adesivi in coppie isolate di neuriti prima di studi su reti complesse.
- Conferma Predittiva: Fornisce dati con risoluzione spaziale per informare modelli di interazione con il bersaglio in contesti di neurodegenerazione o rigenerazione.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
I pinzette laser si integrano nei flussi di lavoro della scoperta precoce consentendo la manipolazione guidata da ipotesi di neuroni isolati prima dello screening di composti o del profilo fenotipico.
- Biologia della scoperta: Supporta l'isolamento delle variabili nei saggi di crescita dei neuriti e di formazione delle sinapsi.
- Screening: Genera configurazioni neuronali standardizzate per un'esposizione ai composti e una rilevazione dei risultati costanti.
- Analisi: Permette misurazioni morfometriche e basate sulla fluorescenza precise a distanze intercellulari definite.
- Ricerca traslazionale: Si collega a modelli preclinici attraverso la riproduzione controllata di schemi di adiacenza delle cellule retiniche.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come piattaforma riutilizzabile per la manipolazione dei neuriti in diverse campagne di validazione degli obiettivi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nei meccanismi bersaglio riducendo il rumore derivante da interazioni cellulari non controllate.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità attraverso la fabbricazione standardizzata delle piastre e il posizionamento controllato tramite laser.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione fornendo evidenze dirette di comportamenti dei neuriti mediati dal bersaglio.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei bersagli in base a fenotipi d'interazione validati, adeguata al livello di rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche nel campo del trapping ottico, della coltura neuronale e delle tecniche microchirurgiche sterili.
- È dipendente da una stazione di lavoro con pinzette laser, da un microscopio invertito e da strumenti per la fabbricazione delle piastre di coltura.
- Necessita della standardizzazione della modellizzazione del substrato (ad esempio Sal-1 rispetto a poli-HEMA) tra diversi gruppi di lavoro per garantire la comparabilità dei dati.
- L'adattamento ad altri tipi neuronali richiede la validazione della compatibilità dell'adesione e dell'efficienza del trappolamento.
- È limitato nella capacità di elaborazione per schermate su larga scala, ma risulta adatto per analisi meccanicistiche successive e per la conferma di risultati positivi.
