Name: Studiare Biogenesi della membrana con una luciferasi saggio basato su Reporter Gene (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-09-07T14:36:00.000+00:00
Duration: 13 min 48 s
Description: Scopri l'uso del saggio reporter con luciferasi per studiare la biogenesi della membrana durante la fagocitosi. Questo metodo analizza l'espressione genica coinvolta nella sintesi rapida di membrane cellulari.

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Colture Cellulari <ol><li> Colture delle risorse umane di rene embrionale 293 (HEK293), le cellule sono coltivate in 10 cm di piatti della cultura in &#39;medium A&#39;, composto da Media Dulbecco Modified Eagle (DMEM) integrato con un cocktail di antibiotici (100 unità per ml di penicillina e 100 mg per ml di solfato di streptomicina) e il 10% di siero fetale bovino (FBS). </li><li> Per impostare le celle di un esperimento, il mezzo è succhiare, e le cellule vengono lavate due volte con 5 ml di tampone fosfato (PBS) soluzione. </li><li> La PBS è poi rimosso e sostituito con 0,6 ml di una soluzione contenente 0,25% tripsina. </li><li> Il piatto viene incubata a 37 ˚ C per circa 2 min finché le cellule hanno cominciato a staccare. </li><li> 5,5 ml di terreno A è aggiunto per neutralizzare la tripsina e le celle sono contate con un emocitometro. </li><li> Le cellule sono diluite a 320.000 cellule per ml e dispensati a 0,1 ml per bene in un polilisina rivestite da 96 pozzetti piastra di coltura. </li><li> Porre la capsula in un tessuto culturale incubatore a 37 ˚ C con un&#39;atmosfera contenente 8,8% di CO2 e far crescere per 24 ore. </li></ol> Trasfezioni <ol><li> Nella preparazione per trasfezioni, dovrebbe essere considerato quanti replica devono essere eseguite per condizioni sperimentali e quali quantità di plasmide saranno transfettate. Noi di routine eseguire tutte le condizioni in triplice copia e trasfezione un totale di 50 a 100 ng di DNA plasmidico per bene. Mescola plasmide deve includere almeno un giornalista che esprime costruire lucciola luciferasi e un plasmide luciferasi Renilla controllo esprimendo da un promotore costitutivo. </li><li> Le soluzioni plasmide vengono aggiunti nei tubi da 1,5 ml microcentrifuga ed integrata con 10 microlitri per ogni campione di siero e senza antibiotici senza DMEM. Per esempio, se 20 pozzi sono tutti di essere transfettate con 50 mg di DNA, aggiungere 200 ul DMEM a 1 mg di DNA. </li><li> Per il DMEM / DNA soluzione aggiungere 3 ml &#39;TransIT 293 reagente&#39; (Mirus) per DNA mcg. Mescolare pipettando up &amp; down e lasciare che i campioni a temperatura ambiente per almeno 10 min. </li><li> Durante questo periodo, rimuovere il supporto dal-96 e piastra di coltura e sostituire con 90 ml di A. mezzo fresco </li><li> Per ogni pozzetto aggiungere 10 microlitri della DMEM / DNA / transito 293 miscela. </li><li> Porre la capsula in un tessuto culturale incubatore a 37 ˚ C con un&#39;atmosfera contenente 8,8% di CO2 e far crescere per 24 ore. </li></ol> Fagocitosi <ol><li> Preparare sospensioni contenenti mezzo B (una miscela 1:1 di DMEM e Ham F12 medium più antibiotici e il 10% FBS) più 0,75 micron sfere di lattice a zero a 1 mg per ml. </li><li> Rimuovere il supporto dal-96 pozzetti cultura e sostituirlo con 0,1 ml di sospensioni tallone in media B. </li><li> Spin la piastra per 2 min a 1000 x g. </li><li> Le cellule sono poi coltivate a 37 ˚ C per 6 a 16 ore. A seconda delle condizioni e il promotore usato per guidare luciferasi, un aumento dell&#39;espressione del gene reporter può essere rilevato dopo 1 a 3 ore. </li><li> In alcuni casi può essere necessario per incubare le cellule con perline da 30 a 60 minuti, poi fare 2 lavaggi con PBS per rimuovere perle prive di personalità giuridica, e aggiungere mezzi freschi prima incubando le cellule per ulteriori periodi di tempo. </li></ol> Dual-GloTM saggio luciferasi <ol><li> Nota: il nostro protocollo per l&#39;utilizzo di questo kit si differenzia per alcuni aspetti da quello consigliato dal produttore. E &#39;stato modificato per ridurre la quantità di reagenti necessari per campione. </li><li> Preparare una soluzione di 1 M DTT, dividere in più piccole aliquote e conservare a -20 ˚ C. </li><li> Preparare un buffer di lisi contenente 20 mM Tris-HCl (pH 7,8), il 10% (v / v) glicerolo, e 0,5% (v / v) Triton X-100. Prima dell&#39;uso, aliquota una quantità necessaria per l&#39;esperimento e aggiungere 1 ml per ml di 1 M DTT, più cocktail inibitore della proteasi per una concentrazione finale di 0,5 a 1x. Non riutilizzare la soluzione rimanente DTT. </li><li> Quando si utilizza il Dual-GloTM kit per la prima volta, preparare l&#39;(lucciola) Reagente luciferasi, trasferendo l&#39;intero contenuto di un flacone di doppio buffer GloTM luciferasi (fornito con il kit) per una bottiglia di Dual-GloTM substrato luciferasi (a condizione con il kit). Dividere il reagente utilizzato luciferasi in 10 ml aliquote e conservare a -20 ˚ C. </li><li> Rimuovere la piastra a 96 pozzetti dal tessuto cultura incubatore e posizionarlo sul ghiaccio. Rimuovere il supporto per aspirazione, aggiungere 40 microlitri per pozzetto di tampone di lisi, e poi lasciare la piastra in ghiaccio per 30 min. </li><li> In un bianco opaco a 96 pozzetti (OptiplateTM-96, Perkin Elmer numero di catalogo 6005290) aliquota 15 microlitri per pozzetto di reagente luciferasi, e poi aggiungere 15 ml di lisato cellulare. </li><li> Incubare la piastra a temperatura ambiente per 10 minuti e quindi leggere la luminescenza in un lettore di micropiastre. </li><li> Immediatamente prima dell&#39;uso, preparare una quantità appropriata di Renilla soluzione di substrato della luciferasi con l&#39;aggiunta di 1 parte Dual-GloTM Stop &amp; Glo ®; Reagente (fornito con il kit) per 100 parti Dual-GloTM Stop &amp; Glo ® Buffer (fornito con il kit). </li><li> Per ogni pozzetto aggiungere 15 microlitri per pozzetto della soluzione di substrato Renilla luciferasi, incubare a temperatura ambiente per 10 minuti e quindi misurare la luminescenza di nuovo. </li></ol>

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

studiare biogenesi della membrana con una luciferasi saggio basato su reporter gene

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

Per studiare il coordinamento delle diverse vie di sintesi dei lipidi durante la biogenesi della membrana è utile lavorare con un sistema sperimentale in cui la biogenesi della membrana avviene rapidamente e in modo inducibile. Abbiamo scoperto che la fagocitosi di sfere di lattice è pratico per questi scopi, come le cellule in rapida sintesi di lipidi di membrana per riempire piscine membrana perso come materiale per il confezionamento durante fagocitazione delle particelle. Qui si descrivono le modalità per lo studio delle variazioni di fagocitosi indotta espressione del gene luciferasi con un approccio basato giornalista gene utilizzando il Dual-Glo sistema luciferasi di analisi da Promega.

Qui si descrivono le modalità per lo studio delle variazioni di fagocitosi indotta espressione del gene luciferasi con un approccio basato giornalista gene utilizzando il Dual-GloTM sistema luciferasi di analisi da Promega.

Studiare Biogenesi della membrana con una luciferasi saggio basato su Reporter Gene

Per studiare il coordinamento delle diverse vie di sintesi lipidica durante la biogenesi delle membrane, è utile lavorare con un sistema sperimentale in cui la membrana...

Ciao, sono IL OV e studio la coordinazione di diversi percorsi di sintesi lipidica in relazione alla memoria e alla biogenesi. È utile disporre di un sistema sperimentale in cui la biogenesi delle membrane avvenga rapidamente e in modo indotto. Abbiamo scoperto che la fagocitosi di microsfere di lattice è particolarmente utile per questi studi, poiché le cellule sintetizzano molto rapidamente nuove membrane per rimpiazzare quelle perse come materiale di rivestimento all'inizio del processo di inglobamento.In questo video, il mio collega Ong Zang dimostrerà le procedure utilizzate per studiare i cambiamenti nell'espressione genica indotti dalla fagocitosi mediante un approccio basato su un saggio con reporter luciferasi. Ciao, sono X del Leverage of Exon North, del Dipartimento di Biologia Molecolare e Cellulare dell'Università di Harvard. Oggi vi mostrerò come utilizzare un saggio con gene reporter per analizzare la regolazione dei geni coinvolti nella biogenesi della membrana dopo la fagocitosi. Cominciamo.Per questa procedura, utilizziamo colture di cellule renali embrionali umane 293. Queste cellule vengono coltivate in una piastra da 10 centimetri con il mezzo A, costituito dal

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Biologia

Con il crescente interesse per le terapie con cellule staminali, le tecniche di imaging molecolare sono ideali per il monitoraggio del comportamento delle cellule staminali dopo il trapianto. Geni reporter luciferasi hanno permesso non invasiva, la valutazione ripetitivo della sopravvivenza cellulare, la posizione e la proliferazione in vivo. Questo video dimostra come monitorare la proliferazione hESC in un topo vivo.

In vitro e in Imaging bioluminescenza gene reporter in vivo di cellule staminali embrionali umane

Orologi circadiani funzionare all'interno di singole celle, cioè, sono cellule autonome. Qui, descriviamo i metodi per la generazione di cellule autonome modelli di orologio con tecniche non invasive, luciferasi a base di tecnologia in tempo reale bioluminescenza. Cellule Reporter fornire trattabili, sistemi modello per lo studio della biologia funzionale circadiano.

Monitoraggio Cell-autonome Ritmi orologio circadiano di espressione genica mediante bioluminescenza Reporter luciferasi

Il video mostra il dosaggio della luciferasi utilizzato per quantificare le proteine marcate con luciferasi. Il test utilizza un enzima luciferasi ingegnerizzato composto da un frammento di grandi dimensioni che si lega al frammento piccolo, che è coniugato con una proteina di interesse. Le subunità legate formano un enzima attivo che, in presenza del substrato, rilascia un segnale luminescente. Questo segnale viene quindi quantificato utilizzando un luminometro.

Il saggio della luciferasi: un test ad alto rendimento per misurare i segnali luminescenti utilizzando bioreporter ingegnerizzati basati su sistemi di nanoluciferasi

Questo video mostra il test di complementazione della luciferasi divisa per rilevare le interazioni proteina-proteina. In questo saggio, le proteine di interesse sono etichettate con frammenti piccoli e grandi dell'enzima luciferasi. Quando le proteine interagiscono, i frammenti grandi e piccoli si combinano per formare un complesso enzimatico attivo, che in presenza di un substrato specifico, rilascia una luminescenza brillante che può essere misurata.

Saggio di complementazione della luciferasi divisa per identificare specifiche interazioni proteina-proteina

Vi presentiamo un metodo di screening rapido e poco costoso per identificare regolatori trascrizionali utilizzando high-throughput transfezioni robotici e un dual-bagliore saggio di luciferasi in casa. Questo protocollo genera rapidamente dati scalo side-by-side funzionali per migliaia di geni ed è facilmente modificabile per indirizzare qualsiasi gene di interesse.

High-throughput screening funzionale utilizzando una casalinga Dual-glow Luciferase Assay

Il raggiungimento di un livello di sistemi di comprensione dei processi cellulari è un obiettivo di biologia cellulare moderna. Descriviamo qui le strategie per multiplazione reporter luciferasi di varia funzione cellulare end-point per interrogare la funzione del gene utilizzando genoma scala librerie di RNAi.

Una piattaforma di screening Luciferase basata multiplex per interrogare il cancro-associata trasduzione del segnale in cellule in coltura

Un'analisi di bioluminescenza in vitro per determinare il ritmo circadiano cellulare in cellule epiteliali mammarie è presentata. Questo metodo utilizza plasmidi di reporter di cellule di mammifero che esprimono destabilizzato luciferasi sotto il controllo del promotore del gene di periodo 2 . Può essere adattato ad altri tipi di cella per valutare gli effetti di organo-specific il ritmo circadiano.

In Vitro Dosaggio di bioluminescenza per caratterizzare il ritmo circadiano in cellule epiteliali mammarie

Luciferasi codificato geneticamente sono un popolare reporter non invasiva dell'espressione genica. Utilizzo di un automatizzato luciferasi longitudinale imaging ottimizzato di gas e temperatura registratore (ALLIGATOR) consente la registrazione longitudinale da cellule bioluminescenti nell'ambito di una vasta gamma di condizioni. Qui vi mostriamo come alligatore possono essere utilizzati nel contesto della ricerca di ritmi circadiani.

Misura flessibile dei reporter bioluminescenti utilizzando un automatizzato Luciferase longitudinale Imaging ottimizzato di Gas e temperatura registratore (ALLIGATOR)

Le cellule staminali neurali/progenitrici mostrano varie dinamiche di espressione dei componenti di segnalazione di Notch che portano a diversi risultati di eventi cellulari. Tale espressione dinamica può essere rivelata dal monitoraggio in tempo reale, non dall'analisi statica, utilizzando un sistema di imaging a bioluminescenza altamente sensibile che consente la visualizzazione di rapidi cambiamenti nelle espressioni geniche.

Risonanza in tempo reale sulla bioluminescenza delle dinamiche di segnalazione di nota durante la neurogenesi di Murine

Abbiamo sviluppato un saggio reporter di biogenesi di microRNA intronico da utilizzare in cellule in vitro con quattro plasmidi: uno con miRNA intronico, uno con il bersaglio, uno per sovraesprimere una proteina regolatrice e uno per Renilla luciferasi. Il miRNA è stato elaborato e potrebbe controllare l'espressione della luciferasi legandosi alla sequenza bersaglio.

Un saggio reporter per analizzare la maturazione dei microRNA intronici in cellule di mammifero

I ritmi circadiani, che esistono nella maggior parte degli organismi, regolano l'organizzazione temporale dei processi biologici. Gli organoidi 3D sono recentemente emersi come modello in vitro fisiologicamente rilevante. Questo protocollo descrive l'uso di reporter bioluminescenti per osservare i ritmi circadiani negli organoidi, consentendo indagini in vitro dei ritmi circadiani nei sistemi multicellulari.

Monitoraggio delle oscillazioni circadiane con un reporter di bioluminescenza negli organoidi

Scopri l'uso del saggio reporter con luciferasi per studiare la biogenesi della membrana durante la fagocitosi. Questo metodo analizza l'espressione genica coinvolta nella sintesi rapida di membrane cellulari.

Studiare Biogenesi della membrana con una luciferasi saggio basato su Reporter Gene

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