Studiare Biogenesi della membrana con una luciferasi saggio basato su Reporter Gene

Ciao, sono IL OV e studio la coordinazione di diversi percorsi di sintesi lipidica in relazione alla memoria e alla biogenesi. È utile disporre di un sistema sperimentale in cui la biogenesi delle membrane avvenga rapidamente e in modo indotto. Abbiamo scoperto che la fagocitosi di microsfere di lattice è particolarmente utile per questi studi, poiché le cellule sintetizzano molto rapidamente nuove membrane per rimpiazzare quelle perse come materiale di rivestimento all'inizio del processo di inglobamento.

In questo video, il mio collega Ong Zang dimostrerà le procedure utilizzate per studiare i cambiamenti nell'espressione genica indotti dalla fagocitosi mediante un approccio basato su un saggio con reporter luciferasi. Ciao, sono X del Leverage of Exon North, del Dipartimento di Biologia Molecolare e Cellulare dell'Università di Harvard. Oggi vi mostrerò come utilizzare un saggio con gene reporter per analizzare la regolazione dei geni coinvolti nella biogenesi della membrana dopo la fagocitosi. Cominciamo.

Per questa procedura, utilizziamo colture di cellule renali embrionali umane 293. Queste cellule vengono coltivate in una piastra da 10 centimetri con il mezzo A, costituito dal mezzo di Eagle modificato con sali di Balsal o DMM, integrato con il 10% di siero bovino fetale o FBS e un cocktail di antibiotici. Mediante una tecnica di standardizzazione, le cellule vengono staccate dal fondo della piastra, contate e quindi seminate in piastre a 96 pozzetti rivestite con polilisina, dove vengono coltivate per 24 ore prima dell'inizio delle trasfezioni.

Per la nostra trasfezione, eseguiamo regolarmente tutte le condizioni in triplicato e la trasfezione, per un totale di 50-100 nanogrammi di DNA plasmidico per pozzetto. Le miscele devono includere almeno il costrutto reporter che esprime la luciferasi di lucciola e il plasmide di controllo che esprime la renilla luciferasi da un promotore costitutivo. Per iniziare, preparare una miscela di DMEM privo di siero e antibiotici con il reagente di trasfezione Trans 2 N 3: utilizzare 10 microlitri di DMEM per ogni pozzetto da trasfettare e 3 microlitri di reagente Trans 2 9 3 per microgrammo di DNA plasmidico.

Ad esempio, se 20 pozzetti devono essere trasfettati con 50 nanogrammi di DNA in tre microlitri di reagente trans 2 9 3 fino a 200 microlitri di DM EM. La soluzione viene mescolata aspirando e dispensando ripetutamente con una pipetta e quindi lasciata a riposo a temperatura ambiente per almeno cinque minuti. Successivamente, il DNA viene prelevato in provette microcentrifuga separate. Le concentrazioni delle nostre soluzioni stock di plusmetro sono solitamente comprese tra 10 e 100 nanogrammi per microlitro.

Dopo aver fatto incubare la miscela di transito DM M per cinque minuti, questa viene trasferita nel tubo del DNA e la soluzione viene nuovamente mescolata mediante pipettaggio. Successivamente, lasciare i campioni a temperatura ambiente per 20 minuti. Durante l'incubazione di 20 minuti, rimuovere il mezzo dalla piastra di coltura a 96 pozzetti e sostituirlo con 19 microlitri di mezzo fresco A una volta completata l'incubazione; aggiungere quindi 10 microlitri della miscela D-M-M-D-N-A tradotta in tre a ciascun pozzetto.

La miscela deve essere pipettata direttamente nel liquido esistente. Non permettere alla punta della pipetta di toccare la parete del tubo. È inoltre importante includere tre pozzetti di cellule che verranno lasciati non trattati e ispezionati.

L'attività media della luciferasi in queste pozzette verrà successivamente sottratta come fondo. Posizionare la piastra a 96 pozzette nell'incubatore a 37 gradi C e coltivare le cellule per 24 ore. Al termine dell'incubazione di 24 ore, procedere con l'induzione della biosintesi della membrana, biosintesi dei granuli lax. Per iniziare, preparare una sospensione contenente mezzo di coltura cellulare e granulo lax.

Per fare ciò, preparare il mezzo B, che è una miscela uno a uno di DM EM e mezzo hemps, F term, più antibiotici e 10% di FBS. Quindi aggiungere le perle di 0,75 micron alle concentrazioni fino a un milligrammo per millilitro. Ovviamente, ogni esperimento deve includere controlli in cui non vengono aggiunte perle.

Successivamente, rimuovere il mezzo dalla piastra di coltura a 96 pozzetti e sostituire ogni pozzetto con 100 microlitri della sospensione di perline. Una volta aggiunta la sospensione, centrifugare la piastra per due minuti a 1000 G. Questo passaggio favorisce la concentrazione delle perline sul fondo del pozzetto e facilita la fagocitosi. Successivamente, incubare le cellule a 37 gradi C per sei-sedici ore.

A seconda delle condizioni e del promotore utilizzato per indurre l'aumento della luciferasi, l'espressione genica del promotore può essere rilevata dopo uno a tre ore. Per determinati esperimenti, potrebbe essere necessario disaccoppiare fal dalla sintesi lipidica, ad esempio per studiare gli effetti di determinati farmaci sulla sintesi lipidica senza influenzare la formazione delle particelle. In tali casi, incubare le cellule con il complesso per 30 a 16 minuti per consentire alle cellule di internalizzare i microsfera.

Dopo questo periodo di incubazione, le cellule vengono lavate due volte con PBS per rimuovere i microsfera non incorporati. Successivamente viene aggiunto del mezzo fresco e le cellule vengono quindi incubate per sei-ciciassette ore per l'espressione del gene reporter. Ora siamo pronti per procedere con i saggi ferrosi.

Per iniziare i saggi con luciferasi, preparare un tampone xis contenente 20 milioni di moli di alberi, HCl pH 7,8, 10% volume/volume di glicerolo e 0,5% volume/volume di Triton X-100; utilizzare la quantità adeguata necessaria per l'esperimento. Quindi aggiungere un microlitro per millilitro di DTT 1 molare. Non riutilizzare la soluzione di DTT avanzata.

Quindi, aggiungere un cocktail di inibitori della proteasi a una concentrazione finale da 0,5 a una volta, quando si utilizza per la prima volta il kit dual glow, preparare il reagente di luciferasi della lucerna trasferendo l'intero contenuto di una bottiglia di buffer dual glow luciferasi in una bottiglia di substrato di luciferasi dual glow. Dividere il reagente di luciferasi non utilizzato in aliquote da 10 millilitri e conservarlo a meno 20 gradi C. Una volta pronto il reagente di luciferasi, rimuovere la piastra a 96 pozzetti dall'incubatore per colture cellulari e posizionarla sul ghiaccio. Successivamente, rimuovere il mezzo per aspirazione, quindi aggiungere 40 microlitri per pozzetto di buffer di lisi e lasciare la piastra sul ghiaccio per 30 minuti.

Successivamente, aggiungere 15 microlitri di reagente Lucifer per pozzetto. In una piastra bianca opaca a 96 pozzetti, utilizziamo la piastra Perkin S optive 96. Quindi aggiungere 15 microlitri di lisato cellulare e incubare la piastra a temperatura ambiente per 10 minuti.

Dopo 10 minuti, leggere la luminescenza con un lettore di micropiastre. Successivamente, eseguire il saggio con luciferasi vaniglia per ottenere dati per il plasmide di controllo. A tale scopo, preparare immediatamente prima l'opportuna quantità di soluzione del substrato per luciferasi aggiungendo una parte di reagente dual glow, stop and glow a 100 parti.

Doppio flash, arrestare e tampone luminoso. Successivamente, aggiungere 15 microlitri di soluzione substrato a ciascun pozzetto. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 10 minuti, quindi misurare nuovamente la luminescenza.

Si noti che abbiamo modificato il protocollo raccomandato dal produttore per questi saggistica luminiscente doppia. Al fine di ridurre la quantità di reagenti necessaria per il campione, ora la piastra può essere analizzata nuovamente utilizzando un lettore di piastre. Una volta raccolti i dati con il lettore di micropiastre, questi possono essere trasferiti a un programma di fogli elettronici come Microsoft Excel per ulteriori analisi.

Per prima cosa, calcolare la media delle tre pozzette non resecate e sottrarre tale valore da ciascun punto dati. Successivamente, per ogni pozzetta transfettata, dividere il valore della luciferasi di firefly. Moltiplicare tale valore per la luciferasi e quindi calcolare, per ogni serie di campioni triplicati, la media, la deviazione e il coefficiente di variazione.

Nel nostro esempio, utilizziamo diverse concentrazioni di perline che sono state riportate sull'asse x rispetto al rapporto tra l'attività della luciferasi e quella della vanillina. Come si può osservare, si verifica un aumento dose-dipendente di questo rapporto. Vi abbiamo appena mostrato come utilizzare un saggio genico basato su un reporter luciferasico per misurare l'espressione del promotore del recettore LDL in risposta alla fagocitosi di perline di lattice.

Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di verificare che le cellule siano confluenti all'80-90% al momento della trasfezione. È tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.